張成林,古 文,汪 貞,石利利,王 蕾①,楊家新 (1. 南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京 1003;. 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,江蘇 南京 10033)

搖蚊(Chironomidae)屬昆蟲綱雙翅目長角亞目搖蚊科,是完全變態(tài)昆蟲,生命周期包括卵、幼蟲、蛹、成蟲4個階段。幼蟲時期又可細(xì)分為4個齡期,占據(jù)生活史時間最長。幼蟲主要生活在水體沉積物表層,可用于檢測水體沉積物的受污染情況[1]。因具有易飼養(yǎng)、繁殖量大、變態(tài)發(fā)育特征明顯、生命周期短等特征,搖蚊已被經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(Organization for Economic Co-operation and Development,OECD)列為無脊椎動物內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)測試的模式生物[2-3]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)將EDCs定義為能改變機(jī)體內(nèi)分泌功能,并對生物體及后代或種群產(chǎn)生不良影響的外源性化合物或混合物[4],目前各國對EDCs的篩選與測試多集中在脊椎動物,2012年OECD新增搖蚊進(jìn)入EDCs測試評估框架的第四、五級測試層級模式生物,但研究內(nèi)容主要停留在性別比、產(chǎn)卵率、羽化率、羽化時長等個體水平的毒性終點(diǎn),并未從分子水平上揭示內(nèi)分泌干擾機(jī)理[5-7]。篩選無脊椎動物內(nèi)分泌干擾性的分子生物標(biāo)志物、識別可能的致毒通路已成為環(huán)境EDCs篩查的關(guān)鍵技術(shù)問題[8]。據(jù)此,歐盟已將無脊椎動物內(nèi)分泌干擾性機(jī)理和方法研究納入優(yōu)先研究領(lǐng)域[9]。

與脊椎動物內(nèi)分泌調(diào)節(jié)方式不同,昆蟲生長發(fā)育主要受胰島素、保幼激素和蛻皮激素3種內(nèi)分泌激素的調(diào)節(jié)[10]。其中,胰島素是重要的營養(yǎng)調(diào)節(jié)信號,對昆蟲的繁殖、生長、發(fā)育、壽命、代謝等生命過程都有關(guān)鍵調(diào)控作用[11]。去除合成胰島素的神經(jīng)分泌細(xì)胞可導(dǎo)致果蠅發(fā)育延遲和生長緩慢[12]。除直接作用外,胰島素還能與蛻皮激素、保幼激素等途徑互作、協(xié)同調(diào)控昆蟲生長發(fā)育和繁殖。研究表明,牛胰島素處理可促進(jìn)埃及伊蚊(Aedesaegypti)分泌蛻皮激素進(jìn)而改變其發(fā)育歷期[13]。尖音庫蚊(Culexpipiens)、埃及伊蚊的相關(guān)研究證實(shí),胰島素還可調(diào)控保幼激素的分泌并促進(jìn)卵巢發(fā)育[14-15]。在注射胰島素類似物后,大草蛉(Chrysopapallens)的卵巢發(fā)育、卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)的合成均得到促進(jìn)[16]。

胰島素信號通路廣泛存在于生物體內(nèi),其主要調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)與功能相對保守[17]。胰島素信號通路主要通過PI3K-Akt途徑發(fā)揮自身生理功能[18]:隨體液運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外的胰島素與位于細(xì)胞膜上的胰島素受體(insulin receptor,InR)相結(jié)合,InR被磷酸化后激活,將胰島素信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。胰島素信號在進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后主要經(jīng)由磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱Akt)信號途徑繼續(xù)向下傳遞,目前關(guān)于昆蟲胰島素信號通路方面的研究也多集中在PI3K-Akt信號途徑[19]:PI3K是由p85調(diào)節(jié)亞基與p110催化亞基組成的異二聚體,PI3K的p85調(diào)節(jié)亞基與上游經(jīng)InR磷酸化激活的胰島素受體底物(insulin receptor substrate,IRS)結(jié)合后可活化p110催化亞基,使磷脂酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate,PIP2)轉(zhuǎn)換為磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-phosphate,PIP3),由PIP3活化的3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(3-phosphoinositide dependent kinase,Pdk)繼續(xù)磷酸化Akt[20],被磷酸化激活的Akt進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中并調(diào)控如叉頭轉(zhuǎn)錄因子O家族(forkhead transcription factor O, FoxO)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,GSK3)等下游基因的活性來行使調(diào)節(jié)功能[21]。

胰島素信號通路中的InR、Pdk、Akt、FoxO已被證實(shí)對昆蟲生長發(fā)育及繁殖過程有重要影響[22]。在褐飛虱(Nilaparvatalugens)中,通過RNAi抑制InR基因的表達(dá)影響了幼蟲蛻皮和蛹的羽化,降低了成蟲卵子的產(chǎn)生和孵化率,敲低Pdk、Akt會導(dǎo)致褐飛虱短翅表型的增加,沉默F(xiàn)oxO則會導(dǎo)致長翅型的出現(xiàn)[23]。缺失Pdk基因?qū)е鹿壟咛ニ劳?過表達(dá)Pdk和Akt則可以在PI3K依賴的條件下增加細(xì)胞和器官的大小[24]。InR的敲低會造成長紅錐蝽(Rhodniusprolixus)卵黃原蛋白的積累、卵巢質(zhì)量減小且產(chǎn)卵量降低[25]。盡管如此,目前搖蚊胰島素信號通路關(guān)鍵基因的序列信息尚未揭示,阻礙了基于胰島素信號通路的內(nèi)分泌干擾作用機(jī)理的研究。

筆者以我國廣布種伸展搖蚊(Chironomustentans)為研究對象,在開展轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上,篩選出胰島素信號通路關(guān)鍵基因序列并開展RACE基因全長擴(kuò)增,預(yù)測并驗(yàn)證了基因序列的開放閱讀框(open reading frame,ORF),對相關(guān)氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和基因同源比對,最后檢測了相關(guān)基因在不同發(fā)育階段(Ⅰ齡、Ⅱ齡、Ⅲ齡、Ⅳ齡幼蟲,蛹期,雌性成蟲,雄性成蟲)伸展搖蚊中的相對表達(dá)量,為基于胰島素信號通路的內(nèi)分泌干擾性機(jī)理研究提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 供試生物飼養(yǎng)

伸展搖蚊(Chironomustentans),養(yǎng)殖于曝氣48 h以上的除氯自來水中,保持水體溫和曝氣,每日喂食1次粉末狀飼料(飼料品牌為“魚樂園水族”,主要成分為進(jìn)口白魚粉、肝末粉、酵母粉、蝦紅素、天然免疫劑、蛋氨酸、賴氨酸、微量元素等),保持光暗比為10 h∶14 h,溫度(23±1)℃。試驗(yàn)開始時供試生物已在實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培育10代以上。

1.2 總RNA提取與第一鏈cDNA的逆轉(zhuǎn)錄合成

收集伸展搖蚊全部發(fā)育階段(卵、Ⅰ～Ⅳ齡幼蟲、蛹期、雌雄成蟲)正常個體混合后作為樣本。用吸水紙除去多余水分后立即進(jìn)行液氮速凍,采用Trizol法對樣本進(jìn)行總RNA提取,獲得的總RNA則暫存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作,取1 μL提取的總RNA作為模板,先后加入1 μL 100 μmol·L-1的Oligo (dT)引物和10 μL的經(jīng)焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)處理過的DEPC水,混合均勻后于65 ℃條件下溫育5 min并立即浸入冰水1 min降溫。再在反應(yīng)液中依次加入4 μL 5X反應(yīng)緩沖液、1 μL RiboLock RNA酶抑制劑、2 μL 10 mmol·L-1dNTP mix、1 μL RevertAid M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶,搖晃混勻后短暫離心,于42 ℃條件下反應(yīng)1 h,再在70 ℃條件下放置5 min以結(jié)束反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA可在-20 ℃條件下暫存。

1.3 轉(zhuǎn)錄組單基因序列庫的建立

委托南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行cDNA高通量測序,獲得cDNA片段兩端的序列(Reads)。對測序得到的cDNA片段進(jìn)行組裝,從而獲得伸展搖蚊的轉(zhuǎn)錄本(mRNA)序列并構(gòu)建出伸展搖蚊的單基因序列庫,基于單基因序列庫進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)注釋、基因功能注釋等一系列生物信息學(xué)分析。

1.4 RACE基因克隆與測序

從實(shí)驗(yàn)室的伸展搖蚊單基因序列庫中提取出胰島素信號通路中的4個基因(InR、Pdk、Akt、FoxO)相關(guān)序列信息,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。以伸展搖蚊的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:5.0 μL cDNA模板、正反向引物各1.5 μL、2X Ex taq Buffer (takara) 25.0 μL、dNTP Mix (10 mmol·L-1) 1.0 μL、Ex taq (takara) 1.0 μL、15.0 μL無核酶DEPC水;反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃ 30 s變性、55 ℃ 30 s復(fù)性、72 ℃ 60 s延伸,設(shè)置35次循環(huán),72 ℃ 10 min延伸以獲得最終產(chǎn)物,PCR產(chǎn)物以0.01 g·mL-1的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測,電壓120 V,電泳0.5 h。切割下含有目的基因的膠條,以膠回收試劑盒(OMEGA)回收目的片段,具體方法按試劑盒說明書進(jìn)行,送往轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行RACE基因克隆實(shí)驗(yàn),拼接、測序后獲得基因全長,預(yù)測開放閱讀框(open reading frame,ORF)并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

表1 伸展搖蚊胰島素信號通路基因擴(kuò)增引物序列Table 1 Primer sequences used for cloning and quantitative of genes in C. tentans

1.5 目的基因氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

利用DNAstar等軟件對預(yù)測得到的ORF進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo),并分析各基因編碼蛋白的分子量、等電點(diǎn)等信息。利用在線軟件SMART(http:∥smart.embl.de)對氨基酸序列進(jìn)行了保守結(jié)構(gòu)域的推導(dǎo)。運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行多物種比對。借助MEGA 11軟件以近鄰相接法(neighbor-joining)構(gòu)建各基因氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹,各分支采用自助抽樣法(bootstraps method)進(jìn)行1 000次重復(fù)檢驗(yàn)。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)

收集伸展搖蚊Ⅰ～I(xiàn)V齡幼蟲、蛹、雌性成蟲、雄性成蟲的正常存活個體進(jìn)行qRT-PCR,了解胰島素通路基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。前處理方法同1.2節(jié)。利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),以GADPH為內(nèi)參基因(表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。利用Genious 2×SYBR Green Fast qPCR Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR操作,反應(yīng)體系(20 μL)為:SYBR Premix Ex Taq(2×)試劑10 μL、正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL、各樣本cDNA模板1 μL、去離子水7 μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件設(shè)置為:95 ℃預(yù)變性5 min,循環(huán)1次;95 ℃變性10 s;60 ℃延伸30 s,循環(huán)40次。采用 2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進(jìn)行相對定量分析,差異顯著性用IBM SPSS Statistics 19軟件中的單因素方差分析(LSD)法計(jì)算(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序

通過高通量測序儀測序共獲得55 456 284條伸展搖蚊原始測序序列(raw reads),共8.32 G。 去除低質(zhì)量測序序列后剩余的54 142 666條高質(zhì)量測序序列被拼接為31 546條轉(zhuǎn)錄本(transcript),并提取出22 882條單基因序列(unigene),這些序列長度從201到13 746 bp不等,平均長度為938 bp。將22 882條單基因序列與多個公共數(shù)據(jù)庫(swiss-prot、nr、Pfam、KOG、GO、KEGG)里的蛋白比對,通過序列相似性進(jìn)行功能注釋。有8 819條單基因序列可被注釋到swiss-prot數(shù)據(jù)庫中,12 777條單基因序列與nr數(shù)據(jù)庫中蛋白序列同源,此外還分別有9 808、10 074 條單基因序列與Pfam數(shù)據(jù)庫、KOG數(shù)據(jù)庫中記載的蛋白序列具有良好的同源性。8 137條注釋到GO數(shù)據(jù)庫中的單基因序列在生物過程(biological progress)、細(xì)胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)3類中,轉(zhuǎn)錄(transcription)、細(xì)胞(cell)和結(jié)合(binding)是最主要的類別,這與其余昆蟲類似(圖1)。

圖1 伸展搖蚊轉(zhuǎn)錄組序列GO分類圖Fig.1 Histone representation of GO of C. tentans

共有7 130條單基因序列可與KEGG數(shù)據(jù)庫中蛋白比對上,其中4 333條單基因序列被映射到了254條KEGG通路中,3 171條單基因序列參與了116條代謝(metabolism)相關(guān)通路,1 394條單基因序列被映射到41條生物體系統(tǒng)(organismal systems)通路中,17條細(xì)胞過程(cellular processes)通路也被注釋到1 149條單基因序列,其余單基因序列分散在人類疾病(human diseases)、遺傳信息加工(genetic information processing)、環(huán)境信息加工(environmental information processing)通路中。映射到胰島素信號通路的單基因序列共有133條,超過21條集中在PI3K-Akt途徑中(表2)。

表2 伸展搖蚊轉(zhuǎn)錄組中感興趣基因Table 2 Unigenes of interest of C. tentans transcriptome

2.2 胰島素信號通路基因全長與氨基酸序列分析

InR是一種酪氨酸激酶受體(PTK),其氨基酸序列具有很高的保守性[26]。InR是胰島素的直接作用靶點(diǎn),作為一種跨膜蛋白,可以接收來自外界的胰島素信號并級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部[27]。檢測結(jié)果表明,伸展搖蚊InR基因的ORF全長為4 311 bp,CG含量為36.93%;推導(dǎo)出該序列編碼1 436個氨基酸(圖2),其中亮氨酸(Leu)含量最高,為121個,其次為天冬氨酸(Asp),含有100個;預(yù)測的分子量為162.48 kD;理論等電點(diǎn)為5.67,帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為190,帶正電的氨基酸殘基(Arg + Lys)總數(shù)為159;親水性平均值為-0.395;對推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行SMART分析,確定了4個保守結(jié)構(gòu)域:3個FN3 結(jié)構(gòu)域(第579～679、696～901、925～1 016個氨基酸)和1個TyrKc 結(jié)構(gòu)域(第1 094～1 363個氨基酸)。

圖2 伸展搖蚊InR、Pdk、Akt、FoxO基因的核苷酸序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of InR, Pdk, Akt and FoxO from C. tentans

Pdk是胰島素信號通路PI3K/Akt途徑中的關(guān)鍵因子,負(fù)責(zé)Akt的激活,其氨基酸序列在人、黑腹果蠅及秀麗隱桿線蟲等多物種中表現(xiàn)出高度保守性[28]。檢測結(jié)果表明,由RACE基因克隆獲得的伸展搖蚊Pdk基因全長為2 124 bp,推測ORF長為1 413 bp,CG含量為31.84%。推導(dǎo)出該序列編碼470個氨基酸(圖2),其中亮氨酸含量最高,為49個,其次為賴氨酸(Lys)與絲氨酸(Ser),分別含有45和38個。預(yù)測的分子量為54.71 kD,理論等電點(diǎn)為7.21,帶負(fù)電的氨基酸殘基總數(shù)為66,帶正電的氨基酸殘基總數(shù)為66,親水性平均值為-0.533。對推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行SMART分析,確定了2個保守結(jié)構(gòu)域,分別為S_TKc 結(jié)構(gòu)域(第6～293個氨基酸)和PH 結(jié)構(gòu)域(第376～465個氨基酸)。

Akt在被PI3K-Pdk激活后,會繼續(xù)激活多種下游蛋白,從而調(diào)節(jié)多種生命活動[29]。檢測結(jié)果表明,RACE基因克隆實(shí)驗(yàn)得到的伸展搖蚊Akt基因全長為4 277 bp,驗(yàn)證所得的ORF含1 563 bp,CG含量為34.74%;推導(dǎo)出該序列編碼520個氨基酸(圖2),含量最多的為亮氨酸,有45個,其次為谷氨酸(Glu)與絲氨酸,分別含有39和38個;預(yù)測的分子量為60.01 kD,理論等電點(diǎn)為5.97,帶負(fù)電的氨基酸殘基總數(shù)為71,帶正電的氨基酸殘基總數(shù)為64。親水性平均值為-0.424。對推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行SMART分析,確定了3個保守結(jié)構(gòu)域:PH 結(jié)構(gòu)域(第28～131個氨基酸)、S_TKc 結(jié)構(gòu)域(第183～440個氨基酸)以及S_TK_X 結(jié)構(gòu)域(第441～506個氨基酸)。

FoxO是Akt的重要靶點(diǎn)之一,活化的Akt會磷酸化FoxO使其失活,從而將FoxO限制在細(xì)胞質(zhì)中,無法發(fā)揮作用[30],若胰島素信號通路受阻,FoxO無法被磷酸化,游離在細(xì)胞質(zhì)中的FoxO便會進(jìn)入到細(xì)胞核中,抑制細(xì)胞的正常分裂并加速細(xì)胞的凋亡[31]。檢測結(jié)果表明,伸展搖蚊FoxO基因經(jīng)RACE基因克隆、拼接得到的序列全長為3 343 bp,經(jīng)驗(yàn)證ORF含有1 569 bp,CG含量為39.90%;推導(dǎo)出該序列編碼522個氨基酸(圖2),其中絲氨酸(Ser)含量最高,為62個,其次為天冬酰胺(Asn),有55個;預(yù)測的分子量為57.80 kD,理論等電點(diǎn)為5.45,帶負(fù)電的氨基酸殘基總數(shù)為53,帶正電的氨基酸殘基總數(shù)為39。親水性平均值為-0.801。對推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行SMART分析,確定了1個保守結(jié)構(gòu)域,為FH 結(jié)構(gòu)域(第91～180個氨基酸)。

2.3 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

利用BLAST在線軟件(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對伸展搖蚊InR基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源比對發(fā)現(xiàn),伸展搖蚊與岸溪搖蚊的一致性最高,達(dá)91.09%,與范氏多足搖蚊、埃及伊蚊的一致性分別為68.42%、45.94%(表3),多物種比對一致性仍有58.81%(圖3),說明InR基因氨基酸序列在近緣物種間具有高度保守性。采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,伸展搖蚊與岸溪搖蚊聚類為同一分支,并與鱗翅目的家蠶、甜菜夜蛾距離最為接近,與同翅目的稻褐飛虱、直翅目的東亞飛蝗同源性則較低(圖4)。

以MEGA的NJ鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,節(jié)點(diǎn)上數(shù)值代表自舉檢驗(yàn)值,重復(fù)運(yùn)行1 000次。

表3 伸展搖蚊氨基酸序列同其他已知蚊蟲相應(yīng)氨基酸序列的同源性比對Table 3 Homology comparison of amino acid sequence between C. tentans and other mosquitoes

Blast同源序列比對顯示,伸展搖蚊Pdk編碼的氨基酸序列與岸溪搖蚊、范氏多足搖蚊、白紋伊蚊的一致性分別為94.26%、58.70%、45.75%(表3),多物種比對一致性可高達(dá)66.43%(圖3),說明Pdk基因氨基酸序列在生物進(jìn)化過程中相對保守。根據(jù)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的分析結(jié)果,伸展搖蚊與埃及伊蚊最為接近,并與同屬于雙翅目的黑腹果蠅、桔小實(shí)蠅聚為一支,與鞘翅目、鱗翅目昆蟲關(guān)系較近,與半翅目的豌豆蚜、膜翅目蜜蜂科昆蟲的同源性關(guān)系依次漸遠(yuǎn)(圖4)。

Akt編碼的氨基酸序列在多物種中進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn),伸展搖蚊與岸溪搖蚊、范氏多足搖蚊、白紋伊蚊顯示出高度一致性,分別為97.12%、95.58%、78.49%(表3),多物種比對一致性可高達(dá)91.76%(圖3),說明Akt基因氨基酸序列在物種間高度保守。采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),伸展搖蚊與同屬于雙翅目的埃及伊蚊、銅綠蠅、致倦庫蚊、黑腹果蠅等昆蟲最為接近,其中同源關(guān)系較近的為埃及伊蚊,與鞘翅目的馬鈴薯甲蟲、光肩星天牛以及鱗翅目的家蠶、棉鈴蟲關(guān)系較遠(yuǎn)(圖4)。

與伸展搖蚊FoxO編碼的氨基酸序列一致性最高的為岸溪搖蚊的98.66%,與范氏多足搖蚊的一致性可達(dá)90.48%,與致倦庫蚊的一致性為60.94%(表3),多物種比對一致性為81.60%(圖3),說明FoxO基因編碼的蛋白高度保守。采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn),伸展搖蚊與埃及伊蚊、淡色庫蚊等雙翅目長角亞目昆蟲聚為同一分支,并與雙翅目短角亞目的黑腹果蠅、桔小實(shí)蠅親緣關(guān)系最近。與Pdk、Akt不同的是,FoxO與鱗翅目的家蠶、梨小食心蟲的親緣關(guān)系要比光肩星天牛、米象等鞘翅目昆蟲更為接近(圖4)。

2.4 基因時序表達(dá)分析

InR、Pdk、Akt、FoxO基因在伸展搖蚊不同發(fā)育階段的表達(dá)量結(jié)果(圖5)顯示,4種基因的表達(dá)水平趨勢基本相同,均在Ⅰ齡表達(dá)量最高。在幼蟲經(jīng)歷一次蛻皮,進(jìn)入到Ⅱ齡后,各基因表達(dá)量迅速下降至一個谷值,僅為Ⅰ齡期的4%、44%、10%、13%。在Ⅱ齡到Ⅳ齡幼蟲階段,表達(dá)量隨著齡期的增長呈現(xiàn)出持續(xù)增長狀態(tài),發(fā)育到蛹期后又有所下降。與蛹期相比,羽化后的雌性成蟲各基因的表達(dá)量又有所升高,可達(dá)蛹期的1.8～3.3倍;而雄性成蟲各基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出持續(xù)下降趨勢,僅為蛹期的30%～50%。雌性成蟲的InR、Pdk、Akt、FoxO基因表達(dá)量均顯著高于雄性成蟲,分別為雄性成蟲的6.5、4.7、7.0、6.5倍(圖5)。

L1～L4分別表示Ⅰ～Ⅳ齡幼蟲;Pu—蛹期;FA—雌性成蟲;MA—雄性成蟲。

3 討論

胰島素信號通路一方面可以根據(jù)外部環(huán)境條件變化調(diào)節(jié)昆蟲物質(zhì)和能量代謝,直接調(diào)控昆蟲生長發(fā)育,另一方面還能通過影響保幼激素、蛻皮激素的合成來改變昆蟲發(fā)育進(jìn)程,影響發(fā)育和繁殖過程[32]。胰島素信號通路是研究外源性化合物對無脊椎動物內(nèi)分泌干擾作用機(jī)理的重要途徑。伸展搖蚊作為生態(tài)毒理學(xué)研究的模式生物,其胰島素信號通路上游基因InR、Pdk、Akt、FoxO序列的鑒定對進(jìn)一步研究其在內(nèi)分泌干擾性中的作用具有重要意義,相關(guān)氨基酸序列結(jié)構(gòu)及其進(jìn)化保守性可為篩選基于胰島素信號通路的無脊椎動物內(nèi)分泌干擾性基因標(biāo)志物提供關(guān)鍵信息[15]。與埃及伊蚊、黑腹果蠅、家蠶等其他模式生物相比,伸展搖蚊InR蛋白氨基酸序列僅缺少了1個含45～48個氨基酸FU保守結(jié)構(gòu)域,而Pdk、Akt、FoxO蛋白的氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域則完全一致[33]。結(jié)合多物種比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果,伸展搖蚊InR、Pdk、Akt、FoxO等胰島素信號通路上游基因與其他昆蟲同源性較高,具有較高的進(jìn)化保守性,可以作為研究無脊椎動物內(nèi)分泌干擾性的潛在基因標(biāo)志物。

昆蟲發(fā)育過程中,激素水平的周期性變化通過一系列基因調(diào)控蛻皮、變態(tài)、求偶、繁殖等行為,且這種調(diào)控具有時間特異性。研究發(fā)現(xiàn),家蠶成蟲注射胰島素樣神經(jīng)肽家蠶素后,血淋巴中海藻糖和脂質(zhì)水平并不會像在幼蟲中一樣顯著降低[34-35]。因此,確定激素調(diào)控基因在不同發(fā)育階段的背景表達(dá)情況是研究外源性化合物內(nèi)分泌干擾作用的基礎(chǔ)。在伸展搖蚊中,胰島素信號調(diào)控基因InR、Pdk、Akt、FoxO在不同發(fā)育階段均有表達(dá),且表達(dá)量趨勢基本相同,在Ⅰ齡和Ⅳ齡幼蟲時期出現(xiàn)了2個峰值。鑒于胰島素信號主要決定昆蟲生長速率[32],推測伸展搖蚊Ⅰ齡和Ⅳ齡幼蟲生長最快。Ⅰ齡幼蟲是卵孵化后最初的幼蟲形態(tài),4個胰島素信號調(diào)控基因的高表達(dá)提示此階段是幼蟲各組織、器官生長的關(guān)鍵時期。與伸展搖蚊類似,在對美洲白蛾(Hyphantriacunea)的研究中,InR、Akt、FoxO、PI3K、mTOR等胰島素信號通路在Ⅰ齡幼蟲階段亦顯示出較高的表達(dá)量[27],FoxO在桔小實(shí)蠅的幼蟲剛孵化時表達(dá)量最高[36]。Ⅳ齡為伸展搖蚊的幼蟲末齡,4個胰島素信號調(diào)控基因在此時均出現(xiàn)表達(dá)峰值,表明此時幼蟲生長加速,為獲得關(guān)鍵體重、啟動蛹化變態(tài)做準(zhǔn)備。這與煙草天蛾(Manducasexta)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)等昆蟲體重主要在末齡幼蟲獲得的規(guī)律一致[28,37]。

InR、Pdk、Akt、FoxO的表達(dá)量在伸展搖蚊中表現(xiàn)出了性別差異性,4種基因在雌性成蟲中的表達(dá)量均顯著高于雄性成蟲,分別達(dá)雄性成蟲的6.5、4.7、7.0、6.5倍,這種雌雄表達(dá)水平的差異在家蠶、桔小實(shí)蠅等昆蟲中也同樣被觀察到[33,38]。大量研究表明,胰島素信號通路會參與調(diào)節(jié)昆蟲卵巢細(xì)胞的發(fā)育。敲低InR基因后,鱗翅目二化螟(Chilosuppressalis)的卵母細(xì)胞無法發(fā)育成熟,卵黃原蛋白的生成受阻,卵巢內(nèi)卵黃沉積減少[39];而對赤擬谷盜等多種昆蟲的InR基因進(jìn)行RNA干擾后,均出現(xiàn)了明顯的繁殖力下降現(xiàn)象[25,37]。對豆莢野螟注射InR、Akt、FoxO基因的特異性雙鏈RNA,均可顯著降低對應(yīng)基因mRNA水平,并干擾卵巢正常發(fā)育[40]。FoxO蛋白可以介導(dǎo)營養(yǎng)信號對卵母細(xì)胞生成的調(diào)節(jié),在營養(yǎng)缺乏的條件下進(jìn)入細(xì)胞核,抑制卵母細(xì)胞的增殖[41],還可直接與卵黃原蛋白基因啟動子中的FoxO應(yīng)答元件結(jié)合,從而影響卵黃的發(fā)生與成熟[42]。因此,InR、Pdk、Akt、FoxO基因在伸展搖蚊雌性成蟲中的高表達(dá)可能與其參與卵巢組織的發(fā)育成熟及卵黃原蛋白的合成與沉積有關(guān)。

4 結(jié)論

(1)該研究獲得了伸展搖蚊胰島素信號通路基因(InR、Pdk、Akt、FoxO)全長和ORF序列信息,推導(dǎo)出分別編碼了1 436、470、520、522個氨基酸序列的蛋白,對推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行了多種生物信息學(xué)分析,并通過近緣物種序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,驗(yàn)證了胰島素信號通路基因在昆蟲的進(jìn)化過程中的保守性,為深入研究伸展搖蚊胰島素信號通路基因提供了理論基礎(chǔ)。

(2)該研究明確了胰島素信號通路基因在伸展搖蚊Ⅰ齡、Ⅱ齡、Ⅲ齡、Ⅳ齡幼蟲,蛹,雌性成蟲,雄性成蟲等不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。結(jié)果表明,InR、Pdk、Akt、FoxO均在生長速度最快的Ⅰ齡和Ⅳ齡幼蟲階段表達(dá)量最高,且在雌性成蟲體內(nèi)的表達(dá)量顯著高于雄性成蟲,說明胰島素信號通路在伸展搖蚊的生長發(fā)育和繁殖方面發(fā)揮了重要作用。