郭海亮，李德新

1 北京市平谷區(qū)醫(yī)院內(nèi)科，北京 101200；2 北京市平谷區(qū)醫(yī)院檢驗(yàn)科

肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，是各種病因長(zhǎng)期、反復(fù)作用形成的彌漫性肝損害，主要特征為彌漫性纖維化、假小葉和再生結(jié)節(jié)形成以及正常肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞等［1］。肝硬化是全球范圍內(nèi)的高發(fā)病和多發(fā)病，嚴(yán)重者可能會(huì)出現(xiàn)肝性腦病、肝腎綜合征、上消化道大出血、肝癌等并發(fā)癥，進(jìn)而威脅患者生命安全［2-3］。目前，肝硬化的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。因此，深入探索肝硬化發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物，對(duì)其早期診斷意義重大。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過200 個(gè)核苷酸的RNA 分子，雖然不具備蛋白編碼功能，但在染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)、基因表達(dá)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用［4］。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 表達(dá)或功能異常與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［5］。小核仁RNA宿主基因7（SNHG7）是一種新發(fā)現(xiàn)的致癌性lncRNA，全長(zhǎng)2 176 bp，定位于人染色體9q34.3。有研究報(bào)道，lncRNA SNHG7 在非小細(xì)胞肺癌［6］、前列腺癌［7］、結(jié)直腸癌［8］、胃癌［9］等惡性腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)。XIE等［10］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG7還與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。而肝纖維化是肝硬化的前期病變，也是肝硬化發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。由此推測(cè)，lncRNA SNHG7 可能在肝硬化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但目前鮮見相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究探討了肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 表達(dá)變化及其臨床意義。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2019年1月—2021年12月北京市平谷區(qū)醫(yī)院內(nèi)科收治的肝硬化患者80例（觀察組）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合肝硬化診斷標(biāo)準(zhǔn)［11］，并經(jīng)肝穿刺活檢證實(shí)；②年齡18～80 歲；③臨床資料完整；④認(rèn)知功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他肝臟疾病者；②合并其他部位惡性腫瘤者；③合并凝血功能障礙者；④合并心、肺、腎等重要臟器功能不全者；⑤治療依從性差者。其中，男44 例、女36 例，年齡（55.12 ± 5.78）歲，BMI（23.12 ± 2.45）kg/m2，有吸煙史48 例、有飲酒史42 例，Child-Pugh 分級(jí)［12］：A 級(jí)30 例、B 級(jí)28 例、C 級(jí)22 例。同期另選在北京市平谷區(qū)醫(yī)院體檢健康的志愿者80 例（對(duì)照組），男42例、女38 例，年齡（56.21 ± 5.98）歲，BMI（23.45 ±3.26）kg/m2，有吸煙史43 例、有飲酒史39 例。兩組性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史具有可比性。本研究經(jīng)北京市平谷區(qū)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批編號(hào)：20220415），所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 血清lncRNA SNHG7 表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)。觀察組入院次日，對(duì)照組體檢當(dāng)日，采集空腹肘靜脈血5 mL，待血液自然凝固后，3 000 r/min 離心10 min、離心半徑15 cm，留取上層血清，-20 ℃冰箱保存。采用TRIzol 法提取血清總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按照One Step RT-PCR Kit 說明，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。以cDNA 為模板，按SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：lncRNA SNHG7 上游引物5'-TTGCTGGCGTCTCGGTTAAT-3'、下游引物5'-GGAAGTCCATCACAGGCGAA-3'，GAPDH 上游引物5'-AACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3'、下游引物5'-AGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3'。PCR 反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 模板2 μL，2 × SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s共40個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算lncRNA SNHG7相對(duì)表達(dá)量。

1.3 肝硬化預(yù)后相關(guān)的資料收集分析 肝硬化患者入院后予改善肝功能、抗肝纖維化、防治并發(fā)癥等規(guī)范治療，肝功能恢復(fù)正常，無明顯臨床癥狀后出院。出院后通過電話或門診復(fù)查形式定期隨訪6 個(gè)月，預(yù)后不良23 例、預(yù)后良好57 例。收集肝硬化患者一般資料（包括性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史）以及入院時(shí)血清膽紅素、肌酐、凝血酶原時(shí)間國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）、白蛋白（ALB）、凝血酶原時(shí)間（PT）和Child-Pugh 評(píng)分。比較肝硬化患者預(yù)后不良者與預(yù)后良好者上述臨床資料，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的指標(biāo)納入多因素Cox 回歸模型，分析肝硬化患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析法。危險(xiǎn)因素分析采用多因素Cox 回歸模型。預(yù)測(cè)效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清lncRNA SNHG7 表達(dá)比較 觀察組與對(duì)照組血清lncRNA SNHG7 相對(duì)表達(dá)量分別為2.16 ± 0.52、1.12 ± 0.22，觀察組血清lncRNA SNHG7 相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（t=16.475，P＜0.05）。

2.2 不同Child-Pugh 分級(jí)肝硬化患者血清lncRNA SNHG7表達(dá)比較 Child-Pugh分級(jí)A、B、C級(jí)肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 相對(duì)表達(dá)量分別為1.75 ±0.44、2.21 ± 0.48、2.65 ± 0.68，Child-Pugh 分級(jí)A級(jí)肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 相對(duì)表達(dá)量低于Child-Pugh 分級(jí)B、C 級(jí)肝硬化患者（t分別為3.584、6.025，P均＜0.05），Child-Pugh 分級(jí)B 級(jí)肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 相對(duì)表達(dá)量低于Child-Pugh 分級(jí)C級(jí)肝硬化患者（t=2.571，P＜0.05）。

2.3 肝硬化患者血清lncRNA SNHG7表達(dá)與Child-Pugh 分級(jí)的關(guān)系 Spearman 相關(guān)分析顯示，肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 表達(dá)與Child-Pugh 分級(jí)呈正相關(guān)關(guān)系（rs=0.526，P＜0.01）。

2.4 肝硬化患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素分析結(jié)果 肝硬化患者預(yù)后不良者與預(yù)后良好者臨床資料比較見表1。以肝硬化患者預(yù)后（預(yù)后不良=1，預(yù)后良好=0）為因變量，以膽紅素、肌酐、INR、ALB、PT、Child-Pugh評(píng)分、lncRNA SNHG7表達(dá)為自變量，納入多因素Cox回歸模型。結(jié)果顯示，Child-Pugh 評(píng)分、lncRNA SNHG7 表達(dá)為肝硬化患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P均＜0.05），見表2。

表1 肝硬化患者預(yù)后不良者與預(yù)后良好者臨床資料比較

表2 肝硬化患者預(yù)后不良的多因素Cox回歸分析結(jié)果

2.5 血清lncRNA SNHG7 表達(dá)對(duì)肝硬化患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值分析結(jié)果 ROC 曲線分析顯示，血清lncRNA SNHG7 表達(dá)預(yù)測(cè)肝硬化患者預(yù)后不良的曲線下面積為0.895（95%CI：0.821～0.969），其最佳截?cái)嘀禐?.20，此時(shí)其預(yù)測(cè)肝硬化患者預(yù)后不良的靈敏度為78.3%、特異度為82.5%、Youden 指數(shù)為0.608。見圖1。

圖1 血清lncRNA SNHG7表達(dá)預(yù)測(cè)肝硬化患者預(yù)后不良的ROC曲線

3 討論

肝硬化是各種慢性肝病發(fā)展的晚期階段，主要特征為彌漫性纖維化、假小葉和再生結(jié)節(jié)形成以及正常肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞等［1］。肝硬化早期癥狀不典型，僅有輕微的厭油、乏力、肝區(qū)不適癥狀；晚期可出現(xiàn)肝功能損害、門靜脈高壓等相關(guān)的癥狀和體征，并導(dǎo)致多器官受損，嚴(yán)重威脅患者生命安全［13-14］。引起肝硬化的病因有很多，如慢性病毒性肝炎、長(zhǎng)期酗酒、膽汁淤積等。目前，肝硬化的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。因此，深入探索肝硬化發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的生物標(biāo)志物，對(duì)其早期診斷意義重大。

lncRNA 是一類長(zhǎng)度超過200 個(gè)核苷酸、無蛋白編碼功能的RNA 分子，由RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成。lncRNA 可在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后、翻譯或翻譯后水平上調(diào)控基因的表達(dá)［15］。越來越多研究表明，lncRNA 異常表達(dá)與人類多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如lncRNA MCM3AP-AS1 在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，并通過靶向miR-194-5p/FOXA1 信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)［16］；lncRNA MALAT1在內(nèi)皮細(xì)胞或心肌細(xì)胞中過表達(dá)，可不同程度參與心血管疾病的病理過程［17］。lncRNA SNHG7 是一種新發(fā)現(xiàn)的致癌性lncRNA，全長(zhǎng)2 176 bp，定位于人染色體9q34.3。XIE等［18］研究報(bào)道，lncRNA SNHG7 在肝外轉(zhuǎn)移的肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)。YANG等［19］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG7在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且其高表達(dá)與患者預(yù)后不良呈正相關(guān)；下調(diào)lncRNA SNHG7 表達(dá)則可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。XIE 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG7 在肝纖維化小鼠肝組織中表達(dá)上調(diào)，而敲除lncRNA SNHG7 的小鼠肝纖維化程度有所減輕，表明lncRNA SNHG7 可能是一個(gè)候選的抗肝纖維化靶點(diǎn)。而肝纖維化是肝硬化的前期病變，也是肝硬化發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。由此推測(cè)，lncRNA SNHG7 可能在肝硬化的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清lncRNA SNHG7相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，提示lncRNA SNHG7 可能參與肝硬化的發(fā)生、發(fā)展。Child-Pugh 分級(jí)是對(duì)肝硬化患者肝臟儲(chǔ)備功能量化評(píng)估的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果顯示，隨著Child-Pugh 分級(jí)增加，肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，并且其表達(dá)與Child-Pugh 評(píng)分呈正相關(guān)，提示lncRNA SNHG7 與肝硬化患者肝功能損傷程度密切相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化患者預(yù)后不良者膽紅素、肌酐、INR、PT、Child-Pugh評(píng)分及l(fā)ncRNA SNHG7表達(dá)均高于其預(yù)后良好者，ALB低于其預(yù)后良好者；多因素Cox 回歸分析顯示，Child-Pugh 評(píng)分、lncRNA SNHG7表達(dá)是肝硬化患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果表明，血清lncRNA SNHG7 高表達(dá)與肝硬化患者預(yù)后不良有關(guān)。ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA SNHG7 表達(dá)預(yù)測(cè)肝硬化患者預(yù)后不良的AUC為0.895，其最佳截?cái)嘀禐?.20，此時(shí)其預(yù)測(cè)肝硬化患者預(yù)后不良的靈敏度為78.3%、特異度為82.5%。提示lncRNA SNHG7 對(duì)肝硬化患者預(yù)后不良具有較高的預(yù)測(cè)效能。

綜上所述，肝硬化患者血清lncRNA SNHG7 高表達(dá)，其高表達(dá)與病情嚴(yán)重程度增加和預(yù)后不良密切相關(guān)；lncRNA SNHG7 可作為預(yù)測(cè)肝硬化患者預(yù)后不良的血清生物標(biāo)志物。但本研究尚存在一定不足之處，如樣本量較小、未深入探索lncRNA SNHG7在肝硬化中的具體作用機(jī)制，后續(xù)將進(jìn)一步深入研究。