許龍，解民鵬，臧其威，李吉堯，賈會(huì)軍

1 宿遷市第一人民醫(yī)院胸心外科，江蘇宿遷 223800；2 宿遷市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科

食管癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020 年我國食管癌新發(fā)病例約32.4 萬例、死亡病例約30.1 萬例，在各類惡性腫瘤中分別居第六位和第四位［1］。食管癌早期無特異性癥狀，大多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，預(yù)后較差。目前，食管癌發(fā)病的確切分子機(jī)制尚不完全清楚。因此，深入探索食管癌發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)尋找其早期診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物具有重要意義［2］。研究表明，微小核糖核酸（miRNA）能夠通過調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展，并可影響患者預(yù)后［3］。miR-758-3p 是近年新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA。有研究報(bào)道，在卵巢癌組織中miR-758-3p 異常表達(dá)，并且其異常表達(dá)可導(dǎo)致患者預(yù)后不良［4］。核仁紡錘體相關(guān)蛋白1（NUSAP1）是一種微管結(jié)合蛋白，在細(xì)胞有絲分裂過程中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，NUSAP1 過表達(dá)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期失調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［5］。有學(xué)者通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-758-3p、NUSAP1 均為食管癌的差異表達(dá)基因［6-7］。但二者表達(dá)與食管癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系尚不清楚。鑒于此，本研究觀察了食管癌組織miR-758-3p、NUSAP1 mRNA 表達(dá)變化，并分析二者表達(dá)變化與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018 年1 月—2020 年4 月宿遷市第一人民醫(yī)院胸心外科收治的食管癌患者97例，均經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診；③接受根治性或姑息性手術(shù)治療；④術(shù)前未接受任何抗腫瘤治療；⑤臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他食管疾病者；②合并其他部位惡性腫瘤者；③合并急慢性感染、神經(jīng)或免疫系統(tǒng)疾病者；④年齡＜18 歲者；⑤妊娠期或哺乳期婦女。其中，男69 例、女28例，年齡26～77（59.54 ± 10.52）歲，有吸煙史45例、有飲酒史43 例；病理類型：腺癌9 例，鱗癌88 例；腫瘤最大徑：≥3 cm 42 例，＜3 cm 55 例；組織分化程度：低分化44 例，中高分化53例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期48例，Ⅲ期49 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例。本研究經(jīng)宿遷市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批編號(hào)：20180302），所有研究對(duì)象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 miR-758-3p、NUSAP1 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 取術(shù)中留取的新鮮食管癌組織及其癌旁組織（距腫瘤組織邊緣＞3 cm 并經(jīng)組織病理檢查明確為正常食管組織），液氮下速凍后研磨成粉末。采用TRIzol法提取組織總RNA，經(jīng)Nano-300 微量分光光度計(jì)鑒定，提取的總RNA 濃度和純度合格。根據(jù)TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 1 h，80 ℃ 5 s。以cDNA 為模板，按QuantiTect SYBR?Green PCR Kit 說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。所有引物序列由上海新貝生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。miR-758-3p 上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGTTTGTGACCTGGTCCA-3'、下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCA-3'，U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；NUSAP1 上游引物5'-GCATAAGCGTTCACTGACCAA-3'、下游引物5'-TTGGTCAGTGAACGCTTATGC-3'，GAPDH 上游引物5'-CACCTTAAAGCTCAAATTCTT-3'、下游引物5'-AAGAATTTGAGCTTTAAGGTG-3'。PCR 反應(yīng)體系共20 μL：cDNA 模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，2 × TransStart?Top Green qPCR SurperMix 10 μL，無核酸酶水8 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s，95 ℃30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s共40次循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以U6或GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-758-3p、NUSAP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 miR-758-3p 與NUSAP1 的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過TargetScan 數(shù)據(jù)庫（https：//www. targetscan. org/）在線預(yù)測(cè)miR-758-3p與NUSAP1的結(jié)合位點(diǎn)。

1.4 隨訪 通過電話或門診復(fù)查形式定期隨訪3年，出院后第1年每3個(gè)月隨訪1次，之后每6個(gè)月隨訪1次。隨訪截至2023年4月30日，記錄患者生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計(jì)軟件。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法。生存分析采用Kaplan-Meier 法，生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織與癌旁正常組織miR-758-3p、NUSAP1 mRNA表達(dá)比較 食管癌組織miR-758-3p、NUSAP1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為0.64 ± 0.11、3.19 ± 0.58，癌旁正常組織分別為1.06 ± 0.14、1.49 ± 0.30。食管癌組織miR-758-3p相對(duì)表達(dá)量低于癌旁正常組織，NUSAP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常組織（t分別為23.037、25.253，P均＜0.05）。

2.2 食管癌組織miR-758-3p 表達(dá)與NUSAP1 mRNA 表達(dá)的關(guān)系 經(jīng)TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)，NUSAP1 基因3'非翻譯區(qū)583～589 位點(diǎn)處存在miR-758-3p 的結(jié)合位點(diǎn)。Pearson 相關(guān)分析顯示，食管癌組織miR-758-3p 相對(duì)表達(dá)量與NUSAP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.732，P＜0.01）。

2.3 食管癌組織miR-758-3p、NUSAP1 mRNA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 食管癌組織miR-758-3p、NUSAP1 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 食管癌組織miR-758-3p、NUSAP1 mRNA 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 截至2023年4月30日，97例食管癌患者死亡46例、失訪3例。以食管癌組織miR-758-3p、NUSAP1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量的均數(shù)為臨界值，將患者分為miR-758-3p 高表達(dá)者（≥0.64，47 例）與miR-758-3p 低表達(dá)者（＜0.64，50 例）、NUSAP1 mRNA 高表達(dá)者（≥3.19，43 例）與NUSAP1 mRNA 低表達(dá)者（＜3.19，54 例）。生存分析顯示，miR-758-3p高表達(dá)者3 年累積生存率為61.70%，miR-758-3p 低表達(dá)者為44.00%，二者生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=5.682，P＜0.05）；NUSAP1 mRNA高表達(dá)者3年累積生存率為41.86%，NUSAP1 mRNA低表達(dá)者為61.11%，二者生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Log-rankχ2=6.918，P＜0.05）。見圖1。

圖1 食管癌組織不同miR-758-3p、NUSAP1 mRNA表達(dá)者的生存曲線

3 討論

食管癌早期癥狀無特異性，如食管內(nèi)異物感、進(jìn)食梗噎感、食物滯留感以及胸骨后針刺樣、燒灼樣或牽拉摩擦樣疼痛［8］，一旦出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難，病變多已進(jìn)展至中晚期。盡管近年來食管癌篩查已取得了很大進(jìn)步，早期確診率得以提升，但仍有超過50%患者確診時(shí)已進(jìn)展至中晚期，即使經(jīng)手術(shù)、放療、化療等綜合治療，5 年生存率亦不足30%［9］。目前，食管癌發(fā)病的確切分子機(jī)制尚不完全清楚。因此，深入探索食管癌發(fā)病的分子機(jī)制，對(duì)尋找其早期診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物具有重要意義。

表觀遺傳學(xué)改變?cè)谑彻馨┑陌l(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。作為一類新興的表觀遺傳調(diào)控分子，miRNA 能夠通過與靶信使核糖核酸特異性結(jié)合，從而引起核糖核酸降解或轉(zhuǎn)錄后基因沉默，進(jìn)而調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖、分化、遷移等生物學(xué)行為［3］。miR-758-3p 是近年新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，能夠調(diào)控機(jī)體膽固醇攝取。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-758-3p 還能參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。如在胃癌組織中miR-758-3p 低表達(dá)，上調(diào)miR-758-3p 表達(dá)能夠通過靶向雙微體同源基因2而降低胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［10］；在乳腺癌組織中miR-758-3p表達(dá)降低，上調(diào)miR-758-3p表達(dá)能夠通過靶向鋅指蛋白217而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移并誘導(dǎo)其凋亡［11］。有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，miR-758-3p表達(dá)降低與卵巢癌、黑色素瘤患者預(yù)后不良有關(guān)［4，12］。HUMMEL 等［6］通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-758-3p 低表達(dá)與食管癌細(xì)胞的惡性增殖密切相關(guān)。由此推測(cè)，miR-758-3p 表達(dá)變化與食管癌患者預(yù)后有關(guān)，但目前鮮見相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌組織miR-758-3p 相對(duì)表達(dá)量降低；食管癌組織miR-758-3p 表達(dá)與組織分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。結(jié)果表明，miR-758-3p能夠參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。ZHU等［13］研究報(bào)道，miR-758-3p 表達(dá)升高能夠靶向下調(diào)Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制促進(jìn)食管癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的信號(hào)通路激活，降低其侵襲和遷移能力，進(jìn)而抑制食管癌進(jìn)展。本研究生存分析發(fā)現(xiàn)，miR-758-3p 高表達(dá)者與其低表達(dá)者3 年累積總生存率分別為61.70%、44.00%，二者生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步佐證了miR-758-3p 表達(dá)與食管癌患者預(yù)后有關(guān)。

紡錘體是一種產(chǎn)生于細(xì)胞分裂前初期至末期的、由微管和微管蛋白構(gòu)成的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，主要功能是在細(xì)胞分裂過程中牽引染色體至分裂極［14］。NUSAP1 是細(xì)胞增殖過程中不可缺少的微管結(jié)合蛋白，能夠通過維持紡錘體裝配和功能而參與細(xì)胞有絲分裂過程。在生理狀態(tài)下，NUSAP1表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，但NUSAP1表達(dá)缺失或過表達(dá)，則會(huì)引起細(xì)胞有絲分裂無法進(jìn)行或有絲分裂異常而引起癌變［5］。近年研究報(bào)道，NUSAP1 過表達(dá)能夠影響肺癌、前列腺癌惡性進(jìn)展并可導(dǎo)致患者預(yù)后不良［15-16］。劉洋等［17］研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織NUSAP1 過表達(dá)，其過表達(dá)與食管癌細(xì)胞的惡性增殖有關(guān)。但目前鮮見NUSAP1 表達(dá)與食管癌患者預(yù)后關(guān)系的報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管癌組織NUSAP1 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高；食管癌組織NUSAP1 mRNA表達(dá)與組織分化程度、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。結(jié)果表明，NUSAP1能夠參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。劉洋等［17］研究發(fā)現(xiàn)，NUSAP1表達(dá)升高能夠激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白、過氧化物酶體增殖物激活受體、Wnt/β-連環(huán)蛋白等信號(hào)通路，引起食管癌細(xì)胞分裂異常，促進(jìn)食管癌細(xì)胞的持續(xù)增殖、分化、侵襲和遷移，進(jìn)而導(dǎo)致食管癌的惡性進(jìn)展［17］。本研究生存分析發(fā)現(xiàn)，NUSAP1 mRNA高表達(dá)者3年累積生存率低于NUSAP1 mRNA低表達(dá)者，二者生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步佐證了NUSAP1 mRNA表達(dá)與食管癌患者預(yù)后有關(guān)。

李曉敏等［18］研究報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌中miR-758-3p過表達(dá)能夠靶向下調(diào)NUSAP1表達(dá)，抑制非小細(xì)胞肺癌的惡性進(jìn)展。但miR-758-3p是否通過靶向調(diào)控NUSAP1 參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展尚不清楚。本研究經(jīng)TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，NUSAP1基因3'非翻譯區(qū)583～589 位點(diǎn)處存在miR-758-3p的結(jié)合位點(diǎn)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在食管癌組織中miR-758-3p 表達(dá)與NUSAP1 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果提示，miR-758-3p 與NUSAP1 可能共同參與食管癌的惡性進(jìn)展，但二者具體的分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，食管癌組織miR-758-3p 低表達(dá)、NUSAP1 mRNA高表達(dá)，二者表達(dá)變化與組織分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后密切相關(guān)。