支博遠(yuǎn)，毛凱榮，田岳鳳，翟春濤，李瑋

山西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，山西 晉中 030619

艾灸療法是中醫(yī)的特色治療方法之一，主要利用艾絨燃燒刺激人體穴位或特定部位，通過激發(fā)經(jīng)氣活動(dòng)來調(diào)整機(jī)體紊亂的生理生化功能，從而達(dá)到防治疾病的目的［1］。隔藥餅灸是隔物灸法現(xiàn)代臨床應(yīng)用的重要形式，在艾條灸較柔和且持久的溫?zé)嵝?yīng)基礎(chǔ)上，配合藥物復(fù)方制餅作為襯隔物，不僅使艾灸治療的優(yōu)勢(shì)病種涵蓋范疇得以拓展，而且在免疫功能調(diào)節(jié)方面表現(xiàn)出更突出的作用［2-3］。艾灸療法可對(duì)循環(huán)、神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)以及艾灸局部分子靶點(diǎn)激活產(chǎn)生影響，憑借神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體免疫功能的廣泛調(diào)節(jié)，其中對(duì)特異性免疫功能激活是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的重要途徑［4］。T淋巴細(xì)胞是特異性免疫中細(xì)胞免疫的重要效應(yīng)細(xì)胞，其激活和功能依賴“第二信號(hào)”即共刺激信號(hào)參與。針對(duì)T 淋巴細(xì)胞活化促進(jìn)和抑制的不同作用，共刺激信號(hào)分子調(diào)控功能表現(xiàn)出正負(fù)兩種作用形式。細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）、CD28 和4-1BB 均為T 淋巴細(xì)胞上的共刺激分子，其中CTLA-4 表現(xiàn)出負(fù)向調(diào)控作用，而CD28、4-1BB 則表現(xiàn)出正向調(diào)控作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，隔藥餅灸可更好地通過調(diào)控負(fù)性共刺激分子程序性死亡受體1（PD-1）表達(dá)，提高機(jī)體的免疫功能［5］。由于共刺激分子數(shù)量眾多且在作用時(shí)重疊但不冗余，這一特性提示隔藥餅灸在改善免疫功能時(shí)可能還有其他共刺激信號(hào)分子的參與。因此，本研究探討了隔藥餅灸對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制兔共刺激分子CTLA-4、4-1BB、CD28的影響，旨在為進(jìn)一步探索隔藥餅灸改善免疫功能的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大耳白兔32 只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.5 ± 0.3）kg，購自北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)［動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0007］。所有大耳白兔飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)，定量飲食、足量飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～25 ℃、相對(duì)濕度50%～70%。本研究嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》，動(dòng)物倫理編號(hào)：2021DW036。艾絨，購自北京同仁堂中藥飲片有限責(zé)任公司；注射用環(huán)磷酰胺，購自江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司；遵六味地黃湯原方劑量飲片，購自山西同仁堂大藥房，熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓按8∶4∶4∶3∶3∶3組配，研磨成粉，過120目篩備用。兔解剖臺(tái)，購自張家港市青松生物醫(yī)學(xué)儀器有限公司；DG5033A 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，購自煙臺(tái)華東電子科技有限公司；H550L型倒置顯微鏡，購自日本尼康株式會(huì)社。CTLA-4、4-1BB、CD28 ELISA 試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；抗CTLA-4 單克隆抗體，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；抗4-1BB單克隆抗體及HRP標(biāo)記的IgG二抗，購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 動(dòng)物分組干預(yù) 大耳白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)7 天，隨機(jī)分為空白組、模型組、艾條灸組、隔藥餅灸組，每組8 只。模型組、艾條灸組和隔藥餅灸組每日9：00—11：00腹腔注射生理鹽水稀釋的環(huán)磷酰胺60 mg/kg，連續(xù)注射7 天，制備免疫抑制模型。以動(dòng)物出現(xiàn)精神狀態(tài)差、飲食少、有脫毛現(xiàn)象即為模型制備成功［3］?？瞻捉M同期腹腔注射等量生理鹽水。模型制備成功次日，將艾條灸組和隔藥餅灸組固定于兔解剖臺(tái)，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［6］常用動(dòng)物穴位定位法和擬人比照法［4］，選取神闕穴、關(guān)元穴、足三里穴（雙側(cè)）、脾俞穴（雙側(cè)）、腎俞穴（雙側(cè)）備皮。隔藥餅灸組：六味地黃湯藥粉溫水調(diào)勻，用模具制成直徑10 mm、厚3 mm 的藥餅，置于上述穴位處；將艾絨用艾柱模具制成艾柱（質(zhì)量約0.3 g，直徑0.8 cm、高0.5 cm），置于藥餅之上，線香點(diǎn)燃，燃盡易壯，每穴連灸五壯，隔日1次，共10 次。艾條灸組：將與隔藥餅灸組5壯艾柱等量艾絨（質(zhì)量約1.5 g）用卷煙器制成小艾條并固定于自制艾灸架上，在距離穴位2～3 cm 處施灸，隔日1 次，共10 次?？瞻捉M和模型組僅固定于兔解剖臺(tái)相同時(shí)間，不予艾灸。

1.3 血清CTLA-4、4-1BB、CD28 檢測(cè) 艾條灸組和隔藥餅灸組末次干預(yù)次日，空白組和模型組同時(shí)間，20%烏拉坦5 mL/kg 耳緣靜脈注射麻醉。麻醉完全后，仰臥位固定于兔解剖臺(tái)，抽取腹腔靜脈血5 mL，室溫靜置10 min，3 000 r/min 離心10 min、離心半徑8.5 cm，留取上層血清，-20 ℃冰箱保存。采用ELISA法檢測(cè)血清CTLA-4、4-1BB、CD28。所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 脾臟和肝臟組織CTLA-4、4-1BB表達(dá)檢測(cè) 腹腔靜脈取血后，耳緣靜脈注射空氣處死，無菌條件下迅速摘取脾臟和肝臟，10%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、包埋，5 μm 厚連續(xù)切片。切片經(jīng)烤片干燥后，常規(guī)脫蠟至水，然后置于EDTA 抗原修復(fù)液中，微波爐內(nèi)加熱抗原修復(fù)。自然冷卻至室溫，山羊血清封閉30 min，分別滴加抗CTLA-4、4-1BB 單克隆抗體（稀釋比均為1∶200），4 ℃孵育過夜。次日，滴加HRP 標(biāo)記的IgG 二抗（稀釋比1∶1 000），37 ℃孵育45 min。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，常規(guī)脫水、透明、封固，顯微鏡下拍照。

由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片。結(jié)果不一致時(shí)，協(xié)商解決。CTLA-4、4-1BB陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜或細(xì)胞間質(zhì)，呈棕褐色顆粒。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)200倍鏡下視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件檢測(cè)每視野平均光密度，以其平均值作為脾臟或肝臟組織CTLA-4、4-1BB陽性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料服從正態(tài)分布且方差齊性，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清CTLA-4、4-1BB、CD28 水平比較 見表1。

表1 各組血清CTLA-4、4-1BB、CD28水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組血清CTLA-4、4-1BB、CD28水平比較（pg/mL，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與艾條灸組比較，△P＜0.05。

組別空白組模型組艾條灸組隔藥餅灸組CD28 4.39 ± 1.56 8.60 ± 0.92*6.30 ± 1.24*#5.14 ± 1.17*#△21.82＜0.05 n8 8 8 8 F P CTLA-4 75.76 ± 2.29 103.82 ± 3.96*92.76 ± 2.83*#89.90 ± 2.39*#△154.04＜0.05 4-1BB 190.53 ± 21.39 124.39 ± 30.00*137.37 ± 28.80*#152.65 ± 28.39*#△11.13＜0.05

2.2 各組脾臟和肝臟組織CTLA-4、4-1BB 表達(dá)比較 見表2。

表2 各組脾臟和肝臟組織CTLA-4、4-1BB陽性表達(dá)比較（±s）

表2 各組脾臟和肝臟組織CTLA-4、4-1BB陽性表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別空白組模型組艾條灸組隔藥餅灸組n8 8 8 8 CTLA-4陽性表達(dá)脾臟組織0.177 2 ± 0.039 0 0.237 7 ± 0.041 1*0.194 1 ± 0.050 5#0.187 0 ± 0.026 2#4.422＜0.05肝臟組織0.179 9 ± 0.030 9 0.227 1 ± 0.032 4*0.190 3 ± 0.041 0#0.183 6 ± 0.032 6#3.960＜0.05 F P 4-1BB陽性表達(dá)脾臟組織0.268 5 ± 0.029 6 0.219 7 ± 0.029 0*0.245 1 ± 0.037 7 0.256 0 ± 0.039 5#2.680＜0.05肝臟組織0.289 3 ± 0.060 4 0.220 4 ± 0.051 9*0.266 0 ± 0.028 7#0.280 4 ± 0.027 6#4.736＜0.05

3 討論

免疫功能及微生態(tài)平衡在內(nèi)的一切抗病物質(zhì)與能力，即機(jī)體抵御外邪入侵的能力，在中醫(yī)上稱之為“正氣”。正氣充盈可抵御外邪入侵，還可驅(qū)邪外出，這與免疫系統(tǒng)的功能相近。正氣調(diào)和陰陽，促使陰平陽秘，從而恢復(fù)陰陽相對(duì)平衡的狀態(tài)，相當(dāng)于免疫穩(wěn)態(tài)。無論從傳統(tǒng)中醫(yī)理論著眼，還是從現(xiàn)代免疫體系出發(fā)，二者的作用基礎(chǔ)均歸結(jié)于機(jī)體的整體調(diào)節(jié)，而達(dá)到機(jī)體自身的穩(wěn)定與平衡是防病和治病的基礎(chǔ)。這表明中醫(yī)“正氣”與西醫(yī)“免疫”兩種理論有著共同的落腳點(diǎn)。

《醫(yī)學(xué)入門》云：“凡病藥之不及，針之不到，必須灸之?！卑目赏ㄟ^調(diào)節(jié)機(jī)體免疫而發(fā)揮溫通、活血、扶正祛邪等功效。艾灸療法主要分為艾條灸、直接灸和間接灸三種，隔藥餅灸是間接灸中最常見的一種，不僅可發(fā)揮艾灸和穴位的作用，還可聯(lián)合所選藥物制作的隔藥餅與艾灸共同發(fā)揮協(xié)同作用。前期研究表明，隔藥餅灸能夠有效改善免疫抑制兔的免疫功能［3］。在此基礎(chǔ)上，以隔六味地黃湯藥餅灸為主要研究方向，進(jìn)一步研究隔藥餅灸干預(yù)免疫抑制兔的作用機(jī)制。

共刺激信號(hào)最早在針對(duì)解釋B淋巴細(xì)胞耐受性誘導(dǎo)的雙信號(hào)模型中提出，在該模型基礎(chǔ)上擴(kuò)展研究并應(yīng)用于T 淋巴細(xì)胞激活機(jī)制［7］，被后來研究者稱為經(jīng)典“雙信號(hào)”。針對(duì)T淋巴細(xì)胞活化促進(jìn)和抑制的不同作用，共刺激信號(hào)分子調(diào)控功能表現(xiàn)出正負(fù)兩種作用形式。關(guān)于共刺激信號(hào)發(fā)揮作用的一個(gè)模型借鑒潮汐變化解釋共刺激信號(hào)在響應(yīng)表達(dá)時(shí)會(huì)受到機(jī)體內(nèi)部環(huán)境變化的影響，從而平衡宿主先天細(xì)胞和微生物之間的通信，使正負(fù)免疫效應(yīng)趨于平衡，即共刺激信號(hào)調(diào)節(jié)是由兩種相反效應(yīng)分子作用的最終結(jié)果決定［8］。這種動(dòng)態(tài)的作用方式與中醫(yī)理論中的“正邪”“陰陽”似乎有異曲同工之處。

共刺激信號(hào)分子多是在T 淋巴細(xì)胞膜上構(gòu)成性表達(dá)，且大多數(shù)共刺激信號(hào)是在激活的T 淋巴細(xì)胞上表達(dá)，尤其是共抑制分子信號(hào)。共刺激信號(hào)分子CD28 在幼稚T 淋巴細(xì)胞上不斷表達(dá)，與其配體B7結(jié)合，傳導(dǎo)T淋巴細(xì)胞激活所必需的共刺激信號(hào)，是已知TCR 信號(hào)存在下幼稚T 淋巴細(xì)胞激活的啟動(dòng)子［9］。CTLA-4與PD-1同屬于CD28超家族共刺激分子，其中CTLA-4 與CD28 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合相同的受體B7，在防止免疫過度表達(dá)方面發(fā)揮重要作用，主要存在于細(xì)胞內(nèi)庫中，在抗原刺激下快速運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能［10］。在正常T淋巴細(xì)胞中，因無誘導(dǎo)性刺激，CTLA-4呈低表達(dá)，注射環(huán)磷酰胺后，機(jī)體免疫功能受損，T淋巴細(xì)胞增多，同時(shí)CTLA-4含量也顯著增多。本研究結(jié)果顯示，艾灸可降低免疫抑制兔肝臟和脾臟組織CTLA-4表達(dá)，從而提高免疫功能，且隔藥餅灸的作用效果更加顯著。4-1BB 是活化T 淋巴細(xì)胞表達(dá)的重要表面標(biāo)志物，屬于膜表面糖蛋白，與其配體4-1BBL 誘導(dǎo)的信號(hào)應(yīng)答發(fā)生在CD28 介導(dǎo)的活化信號(hào)之后，不僅與T 淋巴細(xì)胞活化關(guān)系密切，而且能促進(jìn)細(xì)胞增殖和阻止細(xì)胞活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡［11］。而CTLA-4 在T 淋巴細(xì)胞激活狀態(tài)下表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，CD28會(huì)通過內(nèi)吞作用表達(dá)下調(diào)。有研究表明，在CD28 與B7 結(jié)合被阻斷的情況下，T 淋巴細(xì)胞會(huì)進(jìn)入反應(yīng)遲鈍的“克隆無反應(yīng)”狀態(tài)，可能會(huì)影響后續(xù)共刺激信號(hào)傳遞［12-13］。這可能與免疫抑制兔肝臟和脾臟組織4-1BB 表達(dá)降低有關(guān)，經(jīng)隔藥餅灸治療后，4-1BB 表達(dá)升高，免疫抑制兔機(jī)體的免疫功能得到改善。此外，共刺激信號(hào)分子還以可溶形式存在于外周血中，且具備與相對(duì)應(yīng)的抗體結(jié)合而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，對(duì)自身免疫疾病、腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估均有重要意義［14-15］。

血清中可溶性CTLA-4 的產(chǎn)生主要依賴非激活狀態(tài)T 淋巴細(xì)胞中編碼CTLA-4 的mRNA，此時(shí)憑借其與CD28 在競(jìng)爭(zhēng)配體的天然優(yōu)勢(shì)，阻斷共刺激分子CD28與其配體的結(jié)合，負(fù)性調(diào)控T淋巴細(xì)胞活化和增殖；T 淋巴細(xì)胞活化后，可溶性CTLA-4 通過旁分泌形式調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，同時(shí)對(duì)CD28-B7 和CTLA-4-B7 發(fā)揮阻斷作用，減弱T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)的下調(diào)作用［16］。在對(duì)不止一種惡性腫瘤的臨床觀察中發(fā)現(xiàn)，免疫功能伴隨病程發(fā)展呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，外周血中可溶性CTLA-4含量會(huì)出現(xiàn)不同程度升高；而且與健康人群相比，腫瘤康復(fù)人群外周血中可溶性CTLA-4 含量依然偏高［17］。這與注射環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫抑制模型后機(jī)體血清中可溶性CTLA-4 含量變化一致，經(jīng)隔藥餅灸干預(yù)后血清中可溶性CTLA-4含量降低?？扇苄訡D28 來源與T 淋巴細(xì)胞活化后CTLA-4發(fā)揮作用而導(dǎo)致膜CD28的脫落有關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，膜CD28 的脫落是機(jī)體免疫功能下降的重要原因，在免疫相關(guān)性疾病中外周血可溶性CTLA-4和可溶性CD28含量變化呈正相關(guān)［18］。故本研究選擇可溶性CTLA-4和CD28來觀察免疫抑制兔的免疫功能變化，從多角度探討隔藥餅灸在調(diào)控共刺激分子表達(dá)改善免疫功能的作用機(jī)制。本研究結(jié)果表明，免疫抑制狀態(tài)下血清中可溶性CTLA-4 和CD28 升高，艾條灸組血清CTLA-4 和CD28 含量降低，隔藥餅灸組降低更明顯，表明隔藥餅灸的作用效果更顯著?？扇苄?-1BB 是膜結(jié)合4-1BB 的剪接變體，通過與膜結(jié)合4-1BB 競(jìng)爭(zhēng)4-1BBL 配體阻斷細(xì)胞間的相互作用，從而防止T淋巴細(xì)胞共刺激過度，實(shí)現(xiàn)免疫平衡，其主要由高水平表達(dá)膜4-1BB 的活化抗原特異性CD8+T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，但相同數(shù)量表達(dá)高水平膜4-1BB 的CD4+T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生量更多［19］。隔藥餅灸可使環(huán)磷酰胺免疫抑制兔血清中升高的CD8+T淋巴細(xì)胞含量和降低的CD4+T淋巴細(xì)胞含量向正常水平轉(zhuǎn)變。臨床研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中可溶性4-1BB 與CD28 含量變化呈正相關(guān)［14，20］。有研究發(fā)現(xiàn)，一定量的環(huán)磷酰胺聯(lián)合激動(dòng)性4-1BB 抗體能夠產(chǎn)生很好的協(xié)同作用，環(huán)磷酰胺對(duì)機(jī)體內(nèi)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的免疫抑制性網(wǎng)絡(luò)可在一定程度上激發(fā)4-1BB 表達(dá)［21］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫抑制兔血清中可溶性4-1BB 與CD28 含量變化呈現(xiàn)相反趨勢(shì)，這可能與環(huán)磷酰胺構(gòu)建的免疫抑制模型是通過多種途徑實(shí)現(xiàn)免疫抑制有關(guān)。

綜上所述，隔藥餅灸能夠通過調(diào)節(jié)共刺激分子CTLA-4、4-1BB、CD28 而改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制兔的免疫功能，其效果優(yōu)于艾條灸。隔藥餅灸在免疫調(diào)節(jié)方面的作用是通過多靶點(diǎn)、多通道協(xié)同完成的，但在免疫調(diào)節(jié)過程中是否還有其他共刺激分子參與，仍需進(jìn)一步研究。