耿蘊峰，張景承，薛菲，王冬冬

石家莊市人民醫(yī)院普外二科，石家莊 050030

肝細胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌中最常見的一種類型，占85%～90%，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。盡管在過去幾十年里HCC 的治療取得了很大進展，但手術(shù)切除仍然是其首選的治療方法。由于術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，HCC 的總體預(yù)后仍不能令人滿意［1］。目前，HCC 發(fā)生、發(fā)展的確切分子機制尚不完全清楚。因此，闡明HCC 發(fā)生、發(fā)展的分子機制，對研發(fā)特異性靶向治療藥物具有重要意義。MIR31HG 是一種長度為2 166 bp 的長鏈非編碼RNA（lncRNA），定位于人染色體9p21.3。研究表明，作為一種新的腫瘤調(diào)節(jié)因子，MIR31HG 可通過多種機制調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療耐藥，并與患者預(yù)后有關(guān)［2］。但MIR31HG 在HCC 中的研究甚少，其具體作用機制尚不明確。有研究報道，lncRNA 可作為一種競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA），與miRNA 競爭性結(jié)合以減少miRNA 對其靶基因的調(diào)控，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3］。miR-361 是目前研究較多的腫瘤相關(guān)微小RNA。研究證實，在HCC中miR-361 可作為抑癌基因抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移，并且還能增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［4-6］。有研究發(fā)現(xiàn)，MIR31HG 可作為ceRNA 競爭性結(jié)合miR-361的3'UTR，從而干擾miR-361對腫瘤細胞侵襲和遷移的影響［7-9］。但MIR31HG 能否作為ceRNA 干擾miR-361，從而影響HCC 細胞的黏附、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）目前尚不清楚。2022 年4 月—2023 年4 月，本研究探討了敲低lncRNA MIR31HG 對HCC 細胞黏附、侵襲、遷移和EMT的影響及其機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常肝細胞系LO2、高侵襲性HCC細胞系MHCC97H 和低侵襲性HCC 細胞系MHCC97L，購自美國ATCC。MIR31HG特異性siRNA（MIR31HG siRNA）及陰性對照siRNA（NC siRNA）、MIR31HG野生型（WT）及突變型（MUT）雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒、miR-361 模擬物（miR-361 mimics）及陰性對照模擬物（NC mimics），購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。所有引物序列購自美國Promega 公司。Transwell 小室，購自美國Millipore 公司；PCR 儀，購自瑞士Roche公司；酶標儀，購自美國Bio-TeK 公司。PrimeScriptTMRT Master Mix、Green?PrimeScriptTMRT-PCR Kit，購自日本TaKaRa 公司；CCK-8，購自武漢博士德生物工程有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒，購自美國Promega 公司。上皮鈣黏素（E-cadherin）、神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）、纖連蛋白（Fibronectin）、GAPDH 一抗及HRP 標記的IgG 二抗，購自美國Abcam公司。

1.2 細胞傳代培養(yǎng) 將LO2、MHCC97H、MHCC97L細胞接種于含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長至70%～80%融合時，0.25%胰蛋白酶消化、計數(shù)，按1∶3傳代。取傳3代、對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 細胞篩選 取傳3 代、對數(shù)生長期細胞，采用TRIzol法提取細胞總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA純度和濃度合格。按PrimeScript?RT Master Mix 說明，將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按Green?PrimeScriptTMRT-PCR Kit說明進行PCR 擴增。引物序列：MIR31HG 上游引物5'-AGTTTGTGGCCCAGTTTCCA-3'、下游引物5'-CACCGCTCAGTAGTCGATCC-3'，內(nèi)參GAPDH 上游引物5'-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3'、下游引物5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'；miR-361 上游引物5'-TTGCATAGTCACAAAAGTGAT-3'、下游引物5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'，內(nèi)參U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2 × One Step TB Green RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5 μL，cDNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s、58 ℃ 45 s、72 ℃30 s 共40 個循環(huán)。PCR 擴增反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以GAPDH 或U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。選擇lncRNA MIR31HG相對表達量較高的HCC細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 分組轉(zhuǎn)染 取傳3 代、對數(shù)生長期HCC 細胞，接種于6 孔板，每孔1 × 104個，隨機分為對照組和敲低組，每組設(shè)6 個復(fù)孔。然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，按Lipofectamine2000說明，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，對照組轉(zhuǎn)染NC siRNA、敲低組轉(zhuǎn)染MIR31HG siRNA。轉(zhuǎn)染6 h 更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用RT-qPCR 法驗證轉(zhuǎn)染效率。具體步驟參照1.3。

1.5 細胞黏附能力檢測 采用細胞-基質(zhì)黏附實驗。Matrigel 基質(zhì)膠包被96 孔板，37 ℃風干過夜。次日，每孔加入含2%牛血清白蛋白的細胞培養(yǎng)液，37 ℃封閉1 h。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h 細胞，用含0.1%牛血清白蛋白的培養(yǎng)液重懸制成單細胞懸液，細胞密度為5 × 105/mL。取細胞懸液100 μL 接種于96孔板中，37 ℃孵育2 h，PBS 清洗去除96 孔板中未黏附的細胞，每孔加入CCK-8 溶液10 μL，繼續(xù)孵育4 h。酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔的光密度（OD）值。以O(shè)D450值代表細胞黏附能力。

1.6 細胞侵襲和遷移能力檢測 采用Transwell 小室實驗。①細胞侵襲能力檢測：用Matrigel 基質(zhì)膠包被Transwell 小室上室面。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h 細胞，制成密度為1 × 105/mL 單細胞懸液。取細胞懸液200 μL 加入Transwell 小室上室，下室加入含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基500 μL。然后將Transwell小室置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，用棉簽輕輕拭去上室面未穿膜細胞，5% 戊二醛溶液固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下拍照觀察。隨機選取5個200倍視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。以穿膜細胞數(shù)代表細胞侵襲能力。②細胞遷移能力檢測：Transwell小室上室面不包被Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟同細胞侵襲能力檢測。

1.7 E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。收集兩組轉(zhuǎn)染48 h細胞，加入RIPA 裂解液冰上充分裂解，提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量合格。加入5 × 上樣緩沖液，100 ℃水浴變性。取變性蛋白40 μg，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，采用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉，分別滴加E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin、GAPDH 一抗（稀釋比均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜。次日，TBS 洗膜后，滴加HRP標記的IgG二抗（稀釋比為1∶5 000），37 ℃孵育1 h。ECL 發(fā)光，暗室內(nèi)曝光、顯影。凝膠成像儀采集圖像，Gel-Pro Analyzer 凝膠圖像處理軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH 為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。

1.8 MIR31HG 與miR-361 的結(jié)合位點預(yù)測與驗證 通過LncBase V. 2 在線軟件預(yù)測lncRNA MIR31HG與miR-361的結(jié)合位點。

取傳3代、對數(shù)生長期HCC細胞，接種于24孔板，每孔1 × 104個，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h，按照Lipofectamine2000說明，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將MIR31HG WT、MIR31HG MUT 與miR-361 mimics、NC mimics 共轉(zhuǎn)染HCC 細胞。轉(zhuǎn)染24 h，收集細胞，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirnov 檢驗符合正態(tài)分布，以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞篩選結(jié)果 MHCC97H、MHCC97L、LO2細胞lncRNA MIR31HG 相對表達量分別為2.69 ±0.22、1.94 ± 0.17、1.02 ± 0.04，miR-361 相對表達量分別為0.29 ± 0.07、0.61 ± 0.11、0.98 ± 0.03。MHCC97H、MHCC97L 細胞lncRNA MIR31HG 相對表達量均高于LO2 細胞（t分別為12.94、9.12，P均＜0.05），miR-361 相對表達量均低于L02 細胞（t分別為15.69、5.62，P均＜0.05）；MHCC97H 細胞lncRNA MIR31HG 相對表達量高于MHCC97L 細胞（t=4.67，P＜0.05），miR-361 相對表達量低于MHCC97L 細胞（t=4.25，P＜0.05）。因此，選擇MHCC97H細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 lncRNA MIR31HG 敲低效率驗證結(jié)果 敲低組與對照組lncRNA MIR31HG 相對表達量分別為0.20 ± 0.06、1.05 ± 0.02，敲低組lncRNA MIR31HG相對表達量低于對照組（t=23.28，P＜0.05）。

2.3 敲低lncRNA MIR31HG 對HCC 細胞黏附能力的影響 敲低組與對照組細胞黏附能力分別為0.14 ± 0.02、0.36 ± 0.04，敲低組細胞黏附能力低于對照組（t=8.52，P＜0.05）。

2.4 敲低lncRNA MIR31HG 對HCC 細胞侵襲和遷移能力的影響 在Transwell 侵襲實驗中，敲低組與對照組穿膜細胞數(shù)分別為（312 ± 29）、（487 ± 53）個，敲低組穿膜細胞數(shù)低于對照組（t=5.02，P＜0.05）；在Transwell 遷移實驗中，敲低組與對照組穿膜細胞數(shù)分別為（253 ± 26）、（394 ± 42）個，敲低組穿膜細胞數(shù)低于對照組（t=4.94，P＜0.05）。

2.5 敲低lncRNA MIR31HG 對HCC 細胞EMT 相關(guān)蛋白表達的影響 見表1。

表1 兩組EMT相關(guān)蛋白相對表達量比較（-x ± s）

2.6 lncRNA MIR31HG 與miR-361 的靶向調(diào)控關(guān)系預(yù)測與驗證結(jié)果 經(jīng)LncBase V. 2 在線軟件預(yù)測，lncRNA MIR31HG 存在與miR-361 的結(jié)合位點，見圖1。

圖1 lncRNA MIR31HG與miR-361的結(jié)合位點示意圖

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染MIR31HG WT + miR-361 mimics、MIR31HG WT + NC mimics、MIR31HG MUT + miR-361 mimics、MIR31HG MUT + NC mimics 的HCC 細胞熒光素酶活性分別為0.36 ± 0.07、1.01 ± 0.03、1.02 ± 0.04、0.99 ± 0.05。轉(zhuǎn)染MIR31HG WT + miR-361 mimics的HCC細胞熒光素酶活性低于轉(zhuǎn)染MIR31HG WT + NC mimics 的HCC 細胞（t=14.78，P＜0.05），而轉(zhuǎn)染MIR31HG MUT + miR-361 mimics與MIR31HG MUT + NC mimics的HCC細胞熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.81，P＞0.05）。

3 討論

HCC 是世界上第五大常見癌癥和第三大癌癥相關(guān)死亡原因。盡管在過去幾十年里HCC 的治療取得了很大進展，但手術(shù)切除仍然是其首選的治療方法。由于術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，HCC 患者5 年生存率僅約30%，預(yù)后較差。目前，HCC 發(fā)生、發(fā)展的確切分子機制尚不完全清楚。因此，闡明HCC 發(fā)生、發(fā)展的分子機制，對研發(fā)特異性靶向治療藥物具有重要意義。

lncRNA 是一類長度超過200 bp、無長開放閱讀框的內(nèi)源性非編碼RNA。雖然lncRNA 不具備蛋白質(zhì)編碼能力，但其在各種生物學過程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。lncRNA 已被確定為表觀遺傳學機制中的重要調(diào)節(jié)因子，這些表觀遺傳學機制涉及組蛋白修飾、DNA 甲基化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)等。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 功能失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移以及治療耐藥密切相關(guān)［10］。在惡性腫瘤的早期診斷和靶向治療方面，lncRNA 的應(yīng)用前景越來越受到關(guān)注。CAO 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZEB2-19 可通過TRA2A/RSPH14 軸減弱NF-κB 信號通路，從而抑制HCC 進展并緩解樂伐替尼的耐藥性。ZENG 等［12］研究報道，lncRNA SLC7A11-AS1 通過介導(dǎo)KLF9 泛素化而促進HCC 進展。近年陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些lncRNA與HCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，但至今尚未發(fā)現(xiàn)在HCC發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵性作用的lncRNA［13］。MIR31HG 是近年新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，可在多種惡性腫瘤細胞中異常表達，能夠影響腫瘤細胞的增殖、遷移、凋亡以及EMT 等生物學過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIR31HG 在胃癌［14］、胰腺癌［15］、甲狀腺癌［16］、乳腺癌［17］等惡性腫瘤細胞中高表達，可能具有促癌基因作用。但在膀胱癌細胞中發(fā)現(xiàn)MIR31HG 低表達，可能具有抑癌基因作用［18］。以上研究表明，lncRNA MIR31HG 在不同惡性腫瘤中具有明顯的異質(zhì)性，可能通過不同的信號通路而發(fā)揮作用。但迄今為止lncRNA MIR31HG 在HCC 中的研究甚少，并且其作用機制尚不明確。

本研究通過RT-qPCR 法檢測了MHCC97H、MHCC97L、LO2細胞中l(wèi)ncRNA MIR31HG表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MHCC97H、MHCC97L 細胞lncRNA MIR31HG表達明顯高于LO2 細胞，并且MHCC97H 細胞lncRNA MIR31HG 表達明顯高于MHCC97L 細胞，提示lncRNA MIR31HG 在HCC 的發(fā)生、發(fā)展中可能具有促癌基因作用。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法敲低MHCC97H 細胞lncRNA MIR31HG 表達，并通過RT-qPCR 法驗證，發(fā)現(xiàn)敲低組lncRNA MIR31HG 表達低于對照組，表明本研究成功敲低了MHCC97H細胞lncRNA MIR31HG。進一步研究發(fā)現(xiàn)，敲低組細胞黏附、侵襲和遷移能力均明顯低于對照組，上皮標志物E-cadherin 蛋白表達明顯高于對照組，而間質(zhì)標志物N-cadherin、Fibronectin 蛋白表達明顯低于對照組。表明敲低lncRNA MIR31HG能夠抑制HCC細胞的黏附、侵襲和遷移以及EMT。進一步證實lncRNA MIR31HG 在HCC 的發(fā)生、發(fā)展中起著促癌基因作用。

lncRNA 作為ceRNA 可通過與miRNA 競爭性結(jié)合，從而影響下游miRNA 對其靶基因的調(diào)控。目前，在宮頸癌［7］、骨肉瘤［8］、結(jié)腸癌［9］等惡性腫瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA MIR31HG 能夠競爭性結(jié)合miR-361 的3'UTR，從而干擾miR-361 對靶基因的調(diào)控，繼而影響腫瘤細胞的惡性生物學行為。有研究報道，miR-361在HCC細胞中表達降低，上調(diào)miR-361表達則能抑制HCC 細胞的增殖、侵襲、遷移以及EMT［4-6］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MHCC97H、MHCC97L細胞miR-361 表達明顯低于LO2細胞，并且MHCC97H細胞miR-361 表達明顯低于MHCC97L 細胞。經(jīng)LncBase V.2 在線軟件預(yù)測，lncRNA MIR31HG 存在與miR-361 的結(jié)合位點；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，lncRNA MIR31HG能夠與miR-361的3'UTR特異性結(jié)合，從而抑制其熒光素酶活性。結(jié)果提示，lncRNA MIR31HG 對HCC 細胞黏附、侵襲和遷移的影響可能與靶向調(diào)控miR-361有關(guān)。

綜上所述，HCC細胞lncRNA MIR31HG高表達；敲低lncRNA MIR31HG 則能抑制HCC 細胞的黏附、侵襲和遷移以及EMT，其機制可能與lncRNA MIR31HG能夠靶向調(diào)控miR-361有關(guān)。