常云麗，胥明，陳國裕，湯杰，陳玲玲，季潔如

上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 201299

結腸癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居前五位的惡性腫瘤，好發(fā)于40 歲以上中老年人，并且男性多于女性［1-2］。目前，針對結腸癌的治療方法有多種，但總體預后仍然較差［3］。因此，深入探索結腸癌發(fā)病的分子機制，從而實現(xiàn)精準治療，對提高患者預后具有重要意義［4］。既往研究報道，遺傳因素是導致結腸癌出現(xiàn)家族聚集的重要原因［5］。微小核糖核酸（miRNA）是一類長度為21～25 個核苷酸的非編碼小分子RNA，可在表觀遺傳學水平上調(diào)控基因的表達。miRNA 異常表達與多種腫瘤的惡性生物學行為密切相關，并對腫瘤干細胞的功能維持和分化方向具有重要的調(diào)節(jié)作用［6］。作為miRNA 家族成員之一，miR-7 能夠調(diào)控多種靶基因的表達，從而抑制肝癌、肺癌、胰腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［7］。Krüppe樣因子4（KLF4）是誘導多潛能干細胞形成所需的關鍵因子之一，在維持胚胎干細胞自我更新和多向分化潛能中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-7/KLF4 信號軸能夠參與牙周膜干細胞的成骨與分化［8］。但目前鮮見miR-7/KLF4 信號軸在結腸癌干細胞中作用的研究報道。2020年1月—2022年12月，本研究探討了miR-7靶向調(diào)控KLF4對結腸癌干細胞生物學行為的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 結腸癌干細胞，由本院外科手術切除的結腸癌組織中分離獲得，并于液氮罐中保存?zhèn)溆?。引物序列、miR-7 mimics 質(zhì)粒及其空載質(zhì)粒（NC mimics）均由上海生工生物工程股份有限公司設計合成。倒置顯微鏡，購自日本OLYMPUS 株式會社；微孔板閱讀器，購自美國GE HealthCare公司；iBright凝膠成像系統(tǒng)、流式細胞儀，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。原代細胞質(zhì)粒DNA 轉染試劑盒，購自湖北艾普蒂生物工程有限公司；CCK-8，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒，購自北京普利萊基因技術有限公司；RNA 轉錄、提取及熒光定量試劑盒，購自美國Sigma 公司；KLF4、β-actin 一抗，購自美國Abcam 公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗，購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 取出液氮罐中保存的結腸癌干細胞，37 ℃水浴復蘇。將復蘇后的結腸癌干細胞接種于含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。每3天更換一次培養(yǎng)基。當細胞生長至70%以上融合時，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代。

1.3 細胞轉染 取傳15代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的結腸癌干細胞，接種于6孔板，每孔1 × 106個，隨機分為對照組、NC mimics組、miR-7 mimics 組，每組設6 個復孔。將6 孔板置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h，按原代細胞質(zhì)粒DNA轉染試劑盒說明，NC mimics 組和miR-7 mimics 組分別轉染空載質(zhì)粒、miR-7 mimics 質(zhì)粒；對照組常規(guī)培養(yǎng)，不予轉染。轉染48 h，收集細胞，按RNA 提取試劑盒說明提取細胞總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。按RNA逆轉錄試劑盒說明，將總RNA 逆轉錄合成為cDNA。以cDNA為模板，按實時熒光定量PCR試劑盒說明進行PCR 擴增。引物序列：miR-7 上游引物5'-CGTAGTGCTGTAGCTAGTCGTA-3'、下游引物5'-TTGTGCTAGTGCTAGTCCGT-3'，GAPDH 上游引物5'-AACGTGAGATAGCTGCTGTGAT-3'、下游引物5'-CTGATGTGTTAATATTCGTGTCA-3'。PCR 反應體系共30 μL：SYBR Green qPCR SuperMix 15.00 μL，cDNA 模板3.50 μL，上下游引物各1.50 μL，DEPC水8.50 μL；反應條件：96 ℃ 3 min，96 ℃ 10 s、65 ℃ 4 s、72 ℃ 40 s共40個循環(huán)。PCR 擴增反應完成后，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.4 細胞活力檢測 采用CCK-8 法。收集各組轉染48 h 結腸癌干細胞，接種于96 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8 溶液10 μL，室溫孵育3 h。然后通過微孔板閱讀器檢測450 nm 波長處各孔的光密度（OD）值，按公式計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗孔OD450值-空白對照孔OD450值）/（對照孔OD450值-空白對照組OD450值） × 100%。

1.5 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。收集各組轉染48 h 結腸癌干細胞，按5 × 105/mL 密度接種于6孔板。將6孔板置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)48 h。用微量加樣器槍頭垂直在各培養(yǎng)孔中央作一劃痕。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下拍照觀察，按公式計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h 劃痕距離-48 h 劃痕距離）/0 h 劃痕距離 × 100%。

1.6 細胞侵襲能力檢測 采用改良Boyden 小室法。收集各組轉染48 h 結腸癌干細胞，取1 × 105個接種于用Matrigel 基質(zhì)膠包被的Boyden 小室上室，Boyden小室下室加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。然后將Boyden 小室放入6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出濾膜，用棉簽擦去上室面殘留細胞，甲醇固定，結晶紫染色，倒置顯微鏡下拍照，隨機選取5 個不重疊視野，計數(shù)每視野穿膜細胞數(shù)。

1.7 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術。收集各組轉染48 h 結腸癌干細胞，接種于6 孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h，用1 × Binding Buffer 重懸，制成密度為1 × 106/mL 細胞懸液。取細胞懸液100 μL，加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，室溫避光孵育15 min；再加入PI 10 μL混勻，4 ℃避光孵育5 min；最后加入1 × Binding Buffer 400 μL混勻，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 miR-7與KLF4的靶向結合位點預測與驗證 通過TargetScan 在線網(wǎng)站（http：//www.targetscan.org）預測miR-7 與KLF4 的結合位點。取傳15 代、對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的結腸癌干細胞，接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h，按原代細胞質(zhì)粒DNA 轉染試劑盒說明，將KLF4-WT（野生型）、KLF4-MUT（突變型）分別與NC mimics 或miR-7 mimics 共轉染結腸癌干細胞。轉染48 h，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明檢測熒光素酶活性。

1.9 KLF4 表達檢測 ①KLF4 mRNA 表達檢測：收集各組轉染48 h 結腸癌干細胞，采用RT-qPCR 法檢測KLF4 mRNA 相對表達量，具體步驟參照1.3。引物序列：KLF4 上游引物5'-GTTCGTAGCTGATCGTCGTAGCTA-3'、下游引物5'-TATGTAGTGTCGTGCTGTAGC-3'，GAPDH 上游引物5'-AACGTGAGATAGCTGCTGTGAT-3'、下游引物5'-CTGATGTGTTAATATTCGTGTCA-3'。②KLF4 蛋白表達檢測：收集各組轉染48 h結腸癌干細胞，提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA 法蛋白定量合格。加入上樣緩沖液，100 ℃水浴充分變性。取變性蛋白，SDS-PAGE 分離。電泳結束，轉印至PVDF 膜上。然后用脫脂奶粉室溫封閉，分別加入KLF4、β-actin 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育2 h，iBright凝膠成像系統(tǒng)曝光并分析結果。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染效率驗證結果 對照組、NC mimics 組、miR-7 mimics 組miR-7 相對表達量分別為1.00 ±0.00、1.02 ± 0.07、1.89 ± 0.17。miR-7 mimics 組miR-7相對表達量高于對照組和NC mimics組（P均＜0.05），而對照組與NC mimics組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.2 三組細胞活性、細胞遷移和侵襲能力以及細胞凋亡率比較 見表1。

表1 三組細胞活性、細胞遷移和侵襲能力以及細胞凋亡率比較（xˉ± s）

2.3 miR-7 與KLF4 的靶向結合位點預測與驗證結果 經(jīng)TargetScan在線網(wǎng)站預測，KLF4基因的3'非翻譯區(qū)存在miR-7的結合位點，見圖1。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，共轉染NC mimics 與KLF4-WT及共轉染miR-7 mimics 與KLF4-WT 的結腸癌干細胞熒光素酶活性分別為1.04 ± 0.05、1.53 ± 0.12，二者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；共轉染NC mimics 與KLF4-MUT 及共轉染miR-7 mimics 與KLF4-MUT 的結腸癌干細胞熒光素酶活性分別為1.01 ± 0.07、1.04 ± 0.06，二者比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 miR-7與KLF4的靶向結合位點示意圖

2.4 三組KLF4 mRNA和蛋白表達比較 見表2。

表2 三組KLF4 mRNA和蛋白相對表達量比較（xˉ± s）

3 討論

據(jù)報道，在全球范圍內(nèi)結腸癌是發(fā)病率和死亡率均居前五位的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例超過190萬例、死亡病例超過90 萬例［9］。我國是結腸癌負擔較重的國家，結腸癌的發(fā)病率為15/10 萬～25/10萬、死亡率為7/10 萬～13/10 萬［10］。目前對于結腸癌的發(fā)病機制尚未完全闡明。因此，深入探索結腸癌發(fā)病的分子機制，對尋找早期診斷的生物標志物和治療靶點具有重要意義。

遺傳因素在結腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。miRNA 是一類非編碼單鏈小RNA 分子，目前已證實其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。miR-7 是miRNA 家族成員之一，定位于人9 號染色體異構核蛋白K 基因的第一個內(nèi)含子中。miR-7 可在大腦、眼睛和胰腺等部位高表達，提示miR-7 在這些器官的發(fā)育中具有重要作用［11］。有研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)母細胞瘤中miR-7低表達，而miR-7過表達則可通過靶向EGFR、AKT 而抑制腫瘤細胞的增殖和遷移［12］。但目前鮮見miR-7 在結腸癌干細胞中作用的報道。本研究結果發(fā)現(xiàn)，miR-7 mimics組miR-7相對表達量高于對照組和NC mimics 組，而對照組與NC mimics組比較差異無統(tǒng)計學意義，提示該方法成功將miR-7轉染至結腸癌干細胞中。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-7 mimics組細胞存活率、細胞遷移率、穿膜細胞數(shù)均低于NC mimics組和對照組，細胞凋亡率高于NC mimics組和對照組；NC mimics 組與對照組細胞存活率、細胞遷移率、穿膜細胞數(shù)、細胞凋亡率比較差異均無統(tǒng)計學意義。結果表明，miR-7 能夠參與結腸癌干細胞的惡性生物學行為，上調(diào)miR-7 表達則可抑制結腸癌干細胞的增殖、侵襲、遷移并促進其凋亡。

KLF4 是誘導多潛能干細胞形成所需的關鍵因子之一，在維持胚胎干細胞自我更新和多向分化潛能中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-7/KLF4信號軸能夠參與牙周膜干細胞的成骨與分化［8］。但目前鮮見miR-7/KLF4 信號軸在結腸癌干細胞中作用的報道。本研究在篩選miR-7 作為靶基因后，發(fā)現(xiàn)miR-7 的下游靶點較多，如KLF4、EGFR、IRS-1、PAK-1、RAF-1 和SATB1 等，它們均參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的關鍵信號傳導［13］。因此，本研究將miR-7的調(diào)控機制鎖定在其上下游靶基因中。有研究報道，沉默KLF4 可降低腫瘤干細胞比例，而其過表達則可導致腫瘤干細胞比例增加，表明KLF4 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有強大的致癌作用，但其具體作用機制尚不清楚［14］。有研究在結腸癌中發(fā)現(xiàn)KLF4 過表達，并將其確定為早期侵襲性表型的標志［15］。作為一種轉錄因子，KLF4 可通過抑制p53 轉錄來阻止細胞衰老和凋亡，這可能是KLF4 過表達后腫瘤細胞凋亡率降低的原因之一［16］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，KLF4基因的3'非翻譯區(qū)存在miR-7 的結合位點；經(jīng)雙熒光素酶報告基因實驗驗證，miR-7 能夠靶向調(diào)控KLF4。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-7 mimics 組KLF4 mRNA 與蛋白相對表達量均低于NC mimics 組和對照組，而NC mimics 組與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義。提示miR-7 可能通過靶向下調(diào)KLF4 表達而抑制結腸癌干細胞的惡性生物學行為。

綜上所述，miR-7 可能通過靶向下調(diào)KLF4 表達而抑制結腸癌干細胞的增殖、侵襲、遷移并促進其凋亡。