王健，竇宗山，王娟，徐靖

1 天津市泰達(dá)醫(yī)院普外科，天津 300450；2 天津市人民醫(yī)院普通外科

結(jié)直腸癌（CRC）是消化道常見的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020 年全球CRC 新發(fā)病例超過190 萬例、死亡病例約93.5 萬例［1］。由于起病隱匿且早期癥狀不典型，大多數(shù)CRC 患者就診時(shí)已進(jìn)展至中晚期。目前，對于CRC 的治療通常采取以外科手術(shù)為主，輔以化療、放療的綜合治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)率和病死率較高，預(yù)后較差［2］。CRC 是一種異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今仍不完全清楚。因此，深入探索CRC 的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而尋找新的腫瘤標(biāo)志物，對其早期診斷和個(gè)體化治療意義重大。微小RNA（miRNA）是一類長度為19～23 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA 分子，可通過堿基互補(bǔ)配對的方式識(shí)別靶基因的3'非編碼區(qū)，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。miR-331-3p 定位于人染色體12q22，能夠降低絲裂原活化蛋白激酶7 mRNA的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮抑制絲裂原活化蛋白激酶通路及表皮生長因子受體信號(hào)通路的作用［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-331-3p 在胃癌、肝細(xì)胞癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β受體表達(dá)，激活下游Smad信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移［4-5］?；旌献V系白血病轉(zhuǎn)位輔因子10（MLLT10）基因定位于人染色體10p12.31，其亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域與淋巴樣髓樣網(wǎng)格蛋白裝配蛋白基因易位后表達(dá)融合蛋白，可參與染色體重排事件［6］。有研究表明，MLLT10 在肺癌、白血病細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移［7-8］。但目前miR-331-3p、MLLT10 mRNA在CRC 組織中的表達(dá)變化及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化關(guān)系的報(bào)道較少。鑒于此，本研究觀察了CRC 組織miR-331-3p、MLLT10 mRNA 表達(dá)變化，并探討其表達(dá)與臨床病理特征和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020 年4 月—2023 年1 月天津市泰達(dá)醫(yī)院普外科收治的CRC患者156例。所有患者經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合CRC 診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診；③接受CRC 根治術(shù)；④術(shù)前未接受放化療、靶向治療、免疫治療等抗腫瘤治療；⑤年齡＞18 歲；⑥臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他結(jié)直腸疾病者；②合并其他部位惡性腫瘤者；③合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病者；④妊娠期或哺乳期婦女。其中，男89 例，女67 例；年齡30～78（64.1 ± 7.2）歲，≤60歲75例、＞60歲81例；腫瘤最大徑：≤3 cm 98 例，＞3 cm 58 例；腫瘤位置：結(jié)腸94 例，直腸62 例；組織分化程度：高中分化101 例，低分化55 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期104 例，Ⅲ期52例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52 例。本研究經(jīng)天津市泰達(dá)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（審批編號(hào)：2023 倫字256號(hào)），所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 miR-331-3p、MLLT10 mRNA 表達(dá)以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail mRNA 表達(dá)檢測 取術(shù)中獲取的CRC 組織及其配對的癌旁組織（距腫瘤組織邊緣超過2 cm，經(jīng)組織病理檢查明確為正常結(jié)直腸組織），液氮下速凍，研缽內(nèi)研磨成粉末。采用TRIzol 法提取組織總RNA，經(jīng)NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì)鑒定，OD260/OD280為1.8～2.1。按Universal RT-PCR Kit 說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA為模板，按照2 × SYBR Green PCR Mastermix 試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。所有引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：miR-331-3p 上游引物5'-TCGGAAGCCTAACTACAGCGA-3'、下游引物5'-AGATGAGCATTGGCAGCGAG-3'，內(nèi)參U6 上游引物5'-ACTGCAACAAGGAATACCTCAG-3'、下游引物5'-GCACTGGTACTTCTTGACATCTG-3'；MLLT10 上游引物5'-GACGAGGTCTCCCATAGTATGAA-3'、下游引物5'-CCCGTCGCAATAAACCAGC-3'，E-cadherin 上游引物5'-TGTGACAAGGAATATGTGAGCC-3'、下游引物5'-TGAGCCCTCAGATTTGACCTG-3'，N-cadherin上游引物5'-CGAACTGGACACACATACAGTG-3'、下游引物5'-CTGAGGATCTCTGGTTGTGGT-3'，Snail上游引物5'-ACTGCGACAAGGAGTACACC-3'、下游引物5'-GAGTGCGTTTGCAGATGGG-3'，內(nèi)參GAPDH上游引物5'-TCAGGCTGTGGACATAGAAACC-3'、下游引物5'-GCTGTAAACGACTCTGGCACT-3'。PCR反應(yīng)體系共20 μL：2 × SYBR Premix Es Taq 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL、ddH2O 6.4 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 34 s、72 ℃30 s 共40 個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)在ABI 7500 熒光定量PCR 儀上完成。反應(yīng)結(jié)束，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以U6 或GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料經(jīng)Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以xˉ ±s表示，結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 組織與癌旁正常組織miR-331-3p、MLLT10 mRNA 表達(dá)以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因E-cadherin、N-cadherin、Snail mRNA表達(dá)比較 見表1。

表1 CRC組織與癌旁正常組織miR-331-3p、MLLT10 mRNA相對表達(dá)量以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因E-cadherin、N-cadherin、Snail mRNA相對表達(dá)量比較（xˉ ± s）

2.2 CRC 組織miR-331-3p、MLLT10 mRNA 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表2。

2.3 CRC 組織miR-331-3p、MLLT10 mRNA 表達(dá)的關(guān)系及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系Pearson 相關(guān)分析顯示，CRC 組織miR-331-3p表達(dá)與MLLT10 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.678，P＜0.05）；CRC 組織miR-331-3p 表達(dá)與E-cadherin mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.589，P＜0.05），與N-cadherin、Snail mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.712、-0.654，P均＜0.05）；CRC 組織MLLT10 mRNA 表達(dá)與E-cadherin mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.549，P＜0.05），與N-cadherin、Snail mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)（r分別為0.668、0.714，P均＜0.05）。

3 討論

CRC 是消化道常見的惡性腫瘤之一，在我國其年齡標(biāo)化發(fā)病率為23.7/10 萬、年齡標(biāo)化死亡率為10.9/10萬［9］。近年來，隨著我國居民生活水平提高和生活方式轉(zhuǎn)變，CRC 的發(fā)病率和死亡率呈不斷上升趨勢。CRC 起病隱匿且早期癥狀不典型，大多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，錯(cuò)過了最佳治療時(shí)機(jī)。目前，對于CRC 的治療通常采取以外科手術(shù)為主，輔以化療、放療的綜合治療，但術(shù)后復(fù)發(fā)率和病死率較高，預(yù)后較差［2］。CRC 是一種異質(zhì)性疾病，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今仍不完全清楚。因此，深入探索CRC 的發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而尋找新的腫瘤標(biāo)志物，對其早期診斷和個(gè)體化治療意義重大。

miRNA通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成初始miRNA，在RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物輔助下與靶mRNA的3'非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，繼而參與個(gè)體生長發(fā)育、衰老及炎癥等病理生理過程。miR-331-3p是近年發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制作用的miRNA，其表達(dá)下調(diào)能夠增強(qiáng)PH 結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸的重復(fù)蛋白磷酸酶表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，在CRC 組織中miR-331-3p 表達(dá)下調(diào)，miR-331-3p 可作為CRC 潛在的腫瘤標(biāo)志物［10］。miR-331-3p表達(dá)受非編碼RNA的表達(dá)調(diào)控。YI等［11］研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA-S100B-2 能夠作為分子海綿結(jié)合miR-331-3p，抑制miR-331-3p表達(dá)，從而抑制CRC細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其增殖、侵襲和免疫逃逸，最終導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展。有學(xué)者報(bào)道，miR-331-3p 能夠與癌基因ERBB2 結(jié)合，降低ERBB2 mRNA 穩(wěn)定性，抑制ERBB2 蛋白表達(dá)；腫瘤發(fā)生時(shí)，miR-331-3p表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致ERBB2 mRNA 穩(wěn)定性增加和蛋白過表達(dá)，激活下游Wnt/β連環(huán)蛋白通路，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)［12-13］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC 組織miR-331-3p相對表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織；CRC 組織miR-331-3p 表達(dá)與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤位置、組織分化程度無關(guān)。結(jié)果表明，miR-331-3p 低表達(dá)能夠促進(jìn)CRC的惡性進(jìn)展。Pearson 相關(guān)分析顯示，CRC 組織miR-331-3p 表達(dá)與E-cadherin mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)，與N-cadherin、Snail mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步證實(shí)，miR-331-3p 低表達(dá)可能通過促進(jìn)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)CRC 的惡性進(jìn)展。因此，miR-331-3p 能夠參與CRC 的發(fā)生、發(fā)展，并可作為CRC潛在的腫瘤標(biāo)志物。

MLLT10 是混合譜系白血病中的關(guān)鍵融合伴侶基因，可作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠參與急性淋巴細(xì)胞白血?。?］、卵巢癌［14］等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在CRC 中MLLT10 表達(dá)與Janus 激酶1 激活有關(guān)。有研究表明，急性髓系白血病、CRC 等惡性腫瘤中均存在Janus 激酶1/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 信號(hào)通路磷酸化激活現(xiàn)象，該信號(hào)通路激活能夠上調(diào)MLLT10 表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖［15-16］。有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，在CRC細(xì)胞中MLLT10表達(dá)升高能夠促進(jìn)CD11b+腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞浸潤，從而逃避腫瘤殺傷T 淋巴細(xì)胞的殺傷作用，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，最終導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展［8］。JING 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌SW620、HT29 細(xì)胞MLLT10 過表達(dá)可上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白、N-cadherin 表達(dá)，促進(jìn)腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；而敲低MLLT10 則能抑制間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白、N-cadherin 表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC 組織MLLT10 mRNA 相對表達(dá)量顯著高于癌旁正常組織；CRC 組織MLLT10 mRNA 表達(dá)與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤位置、組織分化程度無關(guān)。結(jié)果表明，MLLT10可能是一種新的促癌因子，其表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)CRC 的發(fā)生、發(fā)展。Pearson 相關(guān)分析顯示，CRC 組織MLLT10 mRNA 表達(dá)與E-cadherin mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與N-cadherin、Snail mRNA 表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)果提示，MLLT10 可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)CRC 的惡性進(jìn)展。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胚胎發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，還能參與炎癥、腫瘤等病理生理過程。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的重要機(jī)制。Snail 是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中重要的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，能夠與E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)的E盒結(jié)合下調(diào)E-cadherin 表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［17］。E-cadherin 和N-cadherin 均屬于鈣黏附素家族成員，表達(dá)于上皮細(xì)胞相連接的細(xì)胞膜上，二者異常表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的黏附力改變，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRC 組織N-cadherin、Snail mRNA 相對表達(dá)量高于癌旁正常組織，E-cadherin mRNA相對表達(dá)量低于癌旁正常組織。提示在CRC 細(xì)胞中存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，這可能是導(dǎo)致CRC惡性進(jìn)展的重要機(jī)制。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，CRC 組織miR-331-3p 表達(dá)與MLLT10 mRNA 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示在CRC 中MLLT10 mRNA 表達(dá)可能受miR-331-3p 調(diào)控。有研究表明，在CRC 細(xì)胞中miR-331-3p 能夠結(jié)合MLLT10 mRNA 的3'非編碼區(qū)，降低MLLT10 mRNA穩(wěn)定性，而miR-331-3p 表達(dá)下調(diào)則可導(dǎo)致MLLT10 mRNA 表達(dá)升高，促進(jìn)CRC 細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化以及侵襲和遷移［7］。但二者能否成為CRC的治療靶點(diǎn)有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，CRC 組織miR-331-3p 低表達(dá)、MLLT10 mRNA 高表達(dá)，二者表達(dá)與TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。但本研究存在一定不足之處，如未對miR-331-3p、MLLT10 促進(jìn)CRC 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制進(jìn)行探索，有待于今后深入研究。