陳琴，張志云，石西南，萬春平，朱云嬰，婁龍，徐瑞

1 昆明市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，昆明 650011；2 云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3 云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種慢性非特異性結(jié)直腸炎癥性疾病，隨著病情發(fā)展，有可能癌變?yōu)榻Y(jié)直腸癌（CRC）。這種“炎-癌”轉(zhuǎn)化形成的CRC 被稱為結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌（CAC），也是CRC 的一個(gè)重要亞型。有研究認(rèn)為，炎癥性腸病是CAC 發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素［1-2］。因此，阻止“炎-癌”轉(zhuǎn)化對(duì)預(yù)防CAC的發(fā)生至關(guān)重要。微小RNA（miRNA）是一類非編碼單鏈小RNA 分子，可在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達(dá)，能夠參與包括腫瘤在內(nèi)的許多病理生理過程。有研究報(bào)道，miRNA 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制可參與CAC 的發(fā)生、發(fā)展，并且能夠通過靶向關(guān)鍵miRNA 的表達(dá)來預(yù)防CAC［3］。miR-34a-5p是miR-34家族成員之一，具有抑制腫瘤作用。有研究報(bào)道，miR-34a-5p 在CRC 細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而其過表達(dá)則能抑制CRC 細(xì)胞的增殖和遷移［4］。白細(xì)胞介素6（IL-6）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號(hào)通路是與炎癥反應(yīng)有關(guān)的重要通路之一，在CRC 的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［5］。小檗堿（BBR）是從中藥黃連中提取的一種有效成分，具有多種藥理作用，如抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等［6］。但目前BBR 對(duì)UC 中miR-34a-5p 表達(dá)和IL-6/STAT3 信號(hào)通路的影響尚不清楚。2022年12月—2023年5月，本研究基于IL-6/STAT3信號(hào)通路探討了miR-34a-5p過表達(dá)對(duì)UC的影響及BBR的干預(yù)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司提供。BBR，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。miR-34a-5p mimics 及其陰性對(duì)照（NC mimics），購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購(gòu)自美國(guó)ABI公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)，購(gòu)自上海天能科技有限公司。Lipofectamine 3000、TRIzol，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒、TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ，購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；IL-6、STAT3、GAPDH 一抗，購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HT-29 細(xì)胞接種于含10% FBS、青鏈霉素雙抗的McCoy's 5A完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。每2天更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)，按1∶3傳代。取傳3代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HT-29細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 miR-34a-5p過表達(dá)對(duì)HT-29細(xì)胞的影響

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取傳3 代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HT-29 細(xì)胞，按1 × 105個(gè)/孔接種于24 孔板，用含10% FBS 的McCoy's 5A 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、NC mimics 組、miR-34a-5p mimics 組，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)，按Lipofectamine 3000 說明，NC mimics組和miR-34a-5p mimics 組分別轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-34a-5p mimics。于Opti-MEM培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染6 h，更換為含10% FBS 的McCoy's 5A 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，按cDNA 第一鏈合成試劑盒說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。以cDNA 為模板，按TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ說明進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：miR-34a-5p 上游引物5'-ACACTCCAGCTGGGTGGCAGTGTCTTAGCT-3'、下游引物5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'，U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR 反應(yīng)體系共20 μL：2 × SYBR Green Realltime PCR Master Mix 10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，DEPC 水7 μL；反應(yīng)條件：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 min共40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束，繪制熔解曲線，獲取循環(huán)閾值（CT）數(shù)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK-8法。收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h，每孔加入CCK-8溶液20 μL，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值。以O(shè)D450值代表細(xì)胞活力。

1.3.3 培養(yǎng)上清液IL-6、IL-1β、TNF-α含量檢測(cè) 采用ELISA 法。收集各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液，離心留取上清液，按IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒說明檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.3.4 細(xì)胞IL-6、STAT3 表達(dá)檢測(cè) ①細(xì)胞IL-6、STAT3 mRNA 表達(dá)檢測(cè)：采用RT-qPCR 法。引物序列：IL-6 上游引物5'-CTGGTCTTTTGGAGTTTGAGGT-3'、下游引物5'-TTTGTACTCATCTGCACAGCTC-3'，STAT3 上游引物5'-CGGAGAAGCATCGTGAGTGAGC-3'、下游引物5'-TGTTGCCGCCTCTTCCAGTCA-3'，GAPDH上游引物5'-CAAATTCCATGGCACCGTCA-3'、下游引物5'-AGCATCGCCCCACTTGATTT-3'。具體步驟參照1.3.1。②細(xì)胞IL-6、STAT3蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Western blotting法。收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)BCA法蛋白定量合格，然后加入上樣緩沖液，100 ℃水浴變性。取適量變性蛋白，SDS-PAGE分離。電泳結(jié)束，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。10% 脫脂牛奶室溫封閉30 min，分別加入IL-6、STAT3、GAPDH 一抗，4 ℃孵育過夜。次日，TBST 洗膜后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。TBST 洗膜后，ECL 發(fā)光，暗室內(nèi)曝光、顯影。采用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 BBR對(duì)UC細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá)及IL-6/STAT3信號(hào)通路的影響

1.4.1 UC 細(xì)胞模型構(gòu)建 取傳3 代、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HT-29 細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)12 h，加入10 ng/mL LPS 刺激48 h，建立UC 細(xì)胞模型［7］。

1.4.2 BBR濃度篩選 收集上述細(xì)胞，接種于96孔板，分別加入0、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL BBR 干預(yù)24 h。然后，每孔加入CCK-8 溶液20 μL，37 ℃孵育2 h。酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值。選擇不引起細(xì)胞活力顯著降低的BBR最高濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 培養(yǎng)上清液IL-6、IL-1β、TNF-α含量檢測(cè) 采用ELISA 法。收集上述UC 細(xì)胞，接種于6 孔板，隨機(jī)分為模型組和BBR組，然后置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至75%以上融合時(shí)，BBR 組予BBR 干預(yù)，模型組不予BBR 干預(yù)。干預(yù)24 h，收集兩組培養(yǎng)液，離心留取上清液，按IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒說明檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.4.4 細(xì)胞miR-34a-5p 以及IL-6、STAT3 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 取兩組上述干預(yù)24 h 細(xì)胞，采用RT-qPCR法檢測(cè)miR-34a-5p 以及IL-6、STAT3 mRNA 表達(dá)。具體步驟參照1.3。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-34a-5p過表達(dá)對(duì)HT-29細(xì)胞的影響

2.1.1 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證結(jié)果 空白對(duì)照組、NC mimics組、miR-34a-5p mimics 組miR-34a-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 ± 0.06、1.05 ± 0.04、46.06 ± 2.25，miR-34a-5p mimics 組miR-34a-5p 相對(duì)表達(dá)量高于NC mimics 組和空白對(duì)照組（P均＜0.05），NC mimics組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.1.2 各組細(xì)胞活力比較 空白對(duì)照組、NC mimics組、miR-34a-5p mimics 組細(xì)胞活力分別為1.74 ±0.02、1.77 ± 0.03、1.47 ± 0.05，miR-34a-5p mimics組細(xì)胞活力低于NC mimics 組和空白對(duì)照組（P均＜0.05），NC mimics 組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.1.3 各組培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比較 見表1。

表1 各組培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（pg/mL，±s）

表1 各組培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（pg/mL，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與NC mimics 組比較，#P＜0.05。

TNF-α 19.59 ± 0.46 19.20 ± 0.70 17.28 ± 0.74*#組別空白對(duì)照組NC mimics組miR-34a-5p mimics組IL-1β 22.96 ± 0.42 22.67 ± 0.38 19.15 ± 0.54*#IL-6 15.33 ± 0.45 15.50 ± 0.40 13.97 ± 0.42*#

2.1.4 各組IL-6、STAT3表達(dá)比較 見表2。

表2 各組IL-6、STAT3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 各組IL-6、STAT3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與NC mimics組比較，#P＜0.05。

組別IL-6 STAT3空白對(duì)照組NC mimics組miR-34a-5p mimics組蛋白0.79 ± 0.02 0.78 ± 0.03 0.77 ± 0.02 mRNA 1.00 ± 0.08 1.10 ± 0.10 0.73 ± 0.05*#蛋白0.79 ± 0.02 0.76 ± 0.01 0.68 ± 0.04*#mRNA 1.00 ± 0.09 1.23 ± 0.11 0.71 ± 0.06*#

2.2 BBR對(duì)UC細(xì)胞miR-34a-5p表達(dá)及IL-6/STAT3信號(hào)通路的影響

2.2.1 BBR 濃度篩選結(jié)果 0、2.5、5、10、20、40、80、160、320 μg/mL BBR 干預(yù)24 h UC細(xì)胞活力分別為1.78 ± 0.06、1.78 ± 0.03、1.78 ± 0.05、1.77 ±0.05、1.74 ± 0.02、1.59 ± 0.01、1.27 ± 0.0、1.07 ±0.01、0.80 ± 0.02。40、80、160、320 μg/mL BBR 干預(yù)24 h UC 細(xì)胞活力均高于0、2.5、5、10、20 μg/mL BBR干預(yù)24 h UC細(xì)胞（P均＜0.05）。故選擇20 μg/mL BBR進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 兩組培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6、TNF-α 含量比較 見表3。

表3 兩組培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（pg/mL，±s）

表3 兩組培養(yǎng)上清液IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（pg/mL，±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別模型組BBR組TNF-α 29.11 ± 1.24 23.06 ± 0.55*IL-1β 38.06 ± 0.59 27.98 ± 0.79*IL-6 25.75 ± 0.90 18.12 ± 0.49*

2.2.3 兩組miR-34a-5p 以及IL-6、STAT3 mRNA 表達(dá)比較 見表4。

表4 兩組miR-34a-5p以及IL-6、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 兩組miR-34a-5p以及IL-6、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05。

組別模型組BBR組STAT3 2.03 ± 0.04 1.16 ± 0.03*miR-34a-5p 0.51 ± 0.01 4.42 ± 0.12*IL-6 17.08 ± 0.36 1.93 ± 0.12*

3 討論

目前，全球大約有1 120 萬人受炎癥性腸病困擾，并且這一數(shù)字仍在持續(xù)增長(zhǎng)［8-9］。UC 作為一種常見的慢性非特異性結(jié)直腸炎癥性疾病，其病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)且難以完全治愈。UC 所引起的持續(xù)炎癥狀態(tài)能夠增加CAC 的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。CAC 形成通常遵循典型的“炎癥-非典型增生-癌變”路徑，即“炎-癌”轉(zhuǎn)化，而炎癥性腸病則是CAC 形成的始動(dòng)因素。因此，及早阻斷“炎-癌”轉(zhuǎn)化對(duì)預(yù)防CAC至關(guān)重要。

目前，UC 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，可能與遺傳傾向、免疫系統(tǒng)異常、腸道菌群失調(diào)等因素有關(guān)［10］。miRNA 是一類單鏈形式的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA 分子，在進(jìn)化上高度保守。有研究認(rèn)為，miRNA 是包括CRC 在內(nèi)諸多惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子［11］。miR-34a-5p 是一種具有抑癌作用的miRNA，可通過直接靶向與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的多個(gè)基因，如細(xì)胞周期調(diào)控因子、凋亡抑制因子和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控因子等，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究報(bào)道，miR-34a-5p 在CRC 組織中表達(dá)下調(diào)［12-13］。IL-6/STAT3 信號(hào)通路在炎癥性腸病至結(jié)直腸癌變過程中起關(guān)鍵作用［14］，阻斷此通路是防止“炎-癌”轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要策略［15］。因此，深入研究miR-34a-5p對(duì)IL-6/STAT3 信號(hào)通路的調(diào)控作用及其在炎癥性腸病至結(jié)直腸癌變中的影響，對(duì)理解CAC 的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療方法具有重要意義。

BBR 是從中藥黃連中提取出來的一種生物堿，具有多種生物學(xué)作用［6］。最近研究發(fā)現(xiàn)，BBR可減輕硫酸葡聚糖鈉引起的小鼠結(jié)腸炎［16］，其作用機(jī)制可能包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等［17］。有研究認(rèn)為，BBR延緩UC炎癥反應(yīng)可能是通過抑制IL-6/STAT3/NF-κB信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的［18］。在CRC 治療中，BBR 也展現(xiàn)出了多種功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、調(diào)控miRNA表達(dá)、減輕氧化應(yīng)激和調(diào)控炎癥反應(yīng)等［19］。然而，在UC中BBR對(duì)miR-34a-5p表達(dá)以及對(duì)IL-6/STAT3信號(hào)通路的影響尚不完全清楚。

本研究基于IL-6/STAT3 信號(hào)通路探討了miR-34a-5p 過表達(dá)對(duì)UC 的影響及BBR 的干預(yù)作用。結(jié)果顯示，miR-34a-5p 過表達(dá)能夠抑制HT-29細(xì)胞活力，降低培養(yǎng)上清液IL-6、IL-1β、TNF-α 含量，并下調(diào)IL-6、STAT3 表達(dá)。提示miR-34a-5p 過表達(dá)能夠通過抑制IL-6/STAT3 信號(hào)通路減輕UC 炎癥反應(yīng)，miR-34a-5p有可能是治療UC的關(guān)鍵靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，BBR 能夠顯著降低培養(yǎng)上清液IL-6、IL-1β、TNF-α 含量，抑制炎癥反應(yīng)；同時(shí)，BBR 還能顯著提高miR-34a-5p 表達(dá)，抑制IL-6、STAT3 活化。提示BBR 可能是通過上調(diào)miR-34a-5p 表達(dá)和抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路來發(fā)揮抗UC作用。

綜上所述，miR-34a-5p 過表達(dá)能夠通過抑制IL-6/STAT3 信號(hào)通路減輕UC 炎癥反應(yīng)；BBR 則能通過上調(diào)miR-34a-5p 表達(dá)和抑制IL-6/STAT3 信號(hào)通路，減輕UC 炎癥反應(yīng)，阻延UC 癌變。這一發(fā)現(xiàn)為UC 治療提供了新的思路和藥物選擇，尤其對(duì)于控制炎癥反應(yīng)和預(yù)防CAC 發(fā)生具有重要意義，今后需進(jìn)一步探索BBR在臨床治療中的應(yīng)用效果。