高 將,張寶軍,孫 悅,袁 濤

(1.江蘇建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院建筑智能學(xué)院,江蘇徐州 221116;2.中國礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測繪學(xué)院,江蘇徐州 221116;3.徐州市水處理工程技術(shù)研究中心,江蘇徐州 221116)

飲水安全是人類健康和生命安全的基本保障[1]。建筑物內(nèi)部給水橫支管稱為給水管網(wǎng)末梢,它通過角閥、編織軟管與用水附件直接相連。在不用水的狀態(tài)下,給水管網(wǎng)末梢中水是不流動的,往往在管網(wǎng)內(nèi)部及管道附件、連接管部位形成死水。研究[2]表明,有1/3的出廠水和末梢水消毒劑余量不達(dá)標(biāo),在給水管網(wǎng)末梢存在微生物富集的風(fēng)險(xiǎn),也有報(bào)道[2]稱部分農(nóng)村地區(qū)生活飲水存在一定的健康安全隱患。

給水管網(wǎng)末梢水質(zhì)一直是飲用水安全研究的熱點(diǎn),但多集中于管網(wǎng)內(nèi)部新污染物[3-5]、生物膜[6-8]以及消毒副產(chǎn)物[9-11]等方面,對閥門、龍頭等給水附件以及與之相連的編織軟管內(nèi)部微生物多樣性研究較少。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,宏基因組學(xué)(metagenomics)基因測序技術(shù)逐漸被應(yīng)用于飲用水微生態(tài)的研究[12-13],借助于該技術(shù),國內(nèi)外學(xué)者在供水系統(tǒng)微生物多樣性測序方面進(jìn)行了廣泛研究[14-16]。本研究基于宏基因組學(xué)測序技術(shù),對房齡超過10年的廚房給水管網(wǎng)末梢水進(jìn)行采樣測定,獲取建筑給水管網(wǎng)末梢中的菌落組成、KEGG功能、抗生素抗性基因(ARGs)、毒力因子,以期為給水管網(wǎng)末梢水質(zhì)安全及風(fēng)險(xiǎn)評估提供基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本采集于徐州市泉山區(qū)住宅廚房給水管道末梢,選取房齡10年以上住宅小區(qū)3個(gè),每個(gè)小區(qū)按照與加壓泵站距離的不同選擇2～3棟樓房,每一棟樓房再按照給水加壓分區(qū)的不同選擇低區(qū)和高區(qū)兩戶進(jìn)行采樣。泉山區(qū)位于徐州市西南部,分主城區(qū)和新城區(qū)兩個(gè)區(qū)域,轄區(qū)內(nèi)住宅類型多樣,老舊小區(qū)和新建住宅均有分布,可以很好地代表整個(gè)城市住宅情況。

分別從枝狀管網(wǎng)(H_ZW)、廚房龍頭(H_LT)以及凈水器(H_PP)提取水樣各10 L,置于無菌聚乙烯塑料桶中。在龍頭和凈水器水樣提取過程中,同時(shí)將龍頭、編織軟管、角閥、凈水器專用連接管以及凈水器進(jìn)行拆解,以無菌方式進(jìn)行表面清理,收集混合清洗后的廢液和原水樣。選取孔徑0.2 μm已滅菌的濾膜,將濾膜折疊放于抽濾瓶中,采用循環(huán)水真空泵進(jìn)行抽濾,直至濾膜上可見明顯覆蓋物,濾膜樣品置于-80 ℃冰箱保存。本次采集泉山區(qū)3個(gè)小區(qū)16戶,共48個(gè)樣本。

圖1 采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling Points

1.2 DNA提取及建庫

將濾膜置于滅過菌的管中,加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS),將膜上的富集物洗脫,離心富集至1 mL的離心管,加入蛋白酶K(10 mg/mL),50 μL的十二烷基磺酸鈉(SDS,20%),顛倒混勻,55 ℃水浴2 h。加入1 mL的混合溶液酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)至2 mL,充分混勻至懸濁液狀(整管呈乳白色),12 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min,去除蛋白。上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管,采用異丙醇沉淀的方法收集DNA,70%乙醇漂洗兩次去除雜質(zhì),最終DNA溶解在50 μL 的TE緩沖液中。采用Qubit?3.0熒光光譜儀(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)檢測DNA的濃度,1.2%瓊脂凝膠電泳檢測DNA樣品的質(zhì)量和完整性,電壓為5 V,時(shí)間為30 min。

利用超聲波儀Covaris M220 (Covaris, Woburn, MA, USA)將各基因組 DNA 樣本隨機(jī)打斷成300 bp左右的片段,隨后按照操作說明書,利用NEBNext?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina?(NEB,USA)進(jìn)行文庫構(gòu)建,采用Agencourt AMPure XP(Beckman,USA)進(jìn)行磁珠純化,并用GenNextTMNGS Library Quantification Kit(Toyobo,Japan)進(jìn)行定量,之后采用Illumina Novaseq 6000 PE150,于微基生物科技(上海)有限公司完成宏基因組測序。

1.3 序列質(zhì)控與組裝

使用FASTP軟件(版本0.22.0)進(jìn)行質(zhì)控過濾,去除質(zhì)量較低長度較小的reads,同時(shí)去掉接頭序列,對原始序列進(jìn)行優(yōu)化統(tǒng)計(jì),采用MEGAHIT軟件對序列進(jìn)行組裝。

1.4 基因預(yù)測及非冗余基因集構(gòu)建

采用METAProdigal進(jìn)行基因預(yù)測,預(yù)測所得基因序列,用CD-HIT軟件進(jìn)行聚類[參數(shù)為95%一致度(identity)、90%覆蓋度(coverage)],每個(gè)類取最長的基因作為代表序列,構(gòu)建非冗余基因集。采用BWA軟件將質(zhì)控后的reads比對到非冗余基因集,計(jì)算基因的豐度RPKM(每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù))。

1.5 基因注釋

在上述分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)行一系列群落結(jié)構(gòu)和功能注釋等的可視化。利用R語言(版本3.6.1)進(jìn)行柱狀圖、Heatmap展示。對廚房給水管網(wǎng)末梢微生物的物種組成、KEGG功能、ARGs、細(xì)菌毒力因子進(jìn)行注釋。

使用DIAMOND軟件[17]將基因集與NCBI的NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對[18](BLASTP比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1×10-5),選取相似性最高的序列信息作為該序列的物種信息,在界、門、綱、目、科、屬、種分類學(xué)水平上進(jìn)行物種注釋和相對豐度統(tǒng)計(jì)(將每個(gè)樣本注釋到的開放閱讀框架(ORF)進(jìn)行匯總,并均一化到100%)。根據(jù)住宅廚房給水管網(wǎng)末梢微生物可能富集的位置不同,對H_ZW、H_LT以及H_PP 3個(gè)部位的測序結(jié)果進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)。列出不同分類層級(門、綱、目、科、屬、種)相對豐度前25的物種(其余的合并為others),繪制出各對應(yīng)的相對豐度柱形圖。

使用DIAMOND軟件BLASTP命令,將基因集與KEGG數(shù)據(jù)庫、VFDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對[19](BLAST比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1×10-5),采用RGI(resistance gene identifier)軟件來對未知序列進(jìn)行抗性基因分析(使用perfect+strict參數(shù)),獲得基因?qū)?yīng)的抗生素抗性功能注釋信息,將比對上的ORF進(jìn)行功能信息注釋和相對基因豐度統(tǒng)計(jì)(將每個(gè)樣本注釋到的ORF進(jìn)行匯總,并均一化到100%)。

2 結(jié)果與分析

2.1 物種組成

基于48份標(biāo)本,宏基因組測序數(shù)據(jù)結(jié)果,共注釋4個(gè)界、143個(gè)門、192個(gè)綱、510個(gè)目、1 092個(gè)科、3 551個(gè)屬、15 909個(gè)種。以門(phylum)和屬(genus)兩個(gè)分類學(xué)水平上統(tǒng)計(jì)物種進(jìn)行展示,如圖2～圖3所示。

圖2 門水平相對豐度Fig.2 Horizontal Relative Abundance at Phylum Level

圖3 屬水平相對豐度Fig.3 Horizontal Relative Abundance at Genus Level

如圖2所示,在門分類學(xué)水平上,H_ZW、H_PP、H_LT樣品分別檢測出142、120、111個(gè)門。優(yōu)勢菌門為:變形菌門(Proteobacteria)(71.92%,68.20%～74.01%)、放線菌門(Actinobacteria)(8.94%,5.32%～11.36%)、奇古菌門(Thaumar-chaeota)(3.30%,0.03%～8.51%),浮霉菌門(Planctomycetes)(2.90%,1.82%～4.87%),其相對豐度均大于2.50%,平均相對豐度占總序列的87.07%(83.85%～89.94%)。子囊菌門(Ascomy-cota)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、脊索動物門(Chordata)平均相對豐度均大于1.00%。

變形菌門在H_ZW、H_PP、H_LT樣品中均有較大占比,該結(jié)果與Zhou等[20]的研究結(jié)果相符,分別為68.20%、73.55%和74.01%,奇古菌門在枝狀管網(wǎng)中的含量要明顯高于其他兩個(gè)樣品,廣古菌門(Euryarchaeota)及硅藻門(Bacillariophyta)在枝狀管網(wǎng)樣本中含量較高,在龍頭及人造化學(xué)纖維(PP棉)樣本中含量較低。奇古菌門及節(jié)肢動物門(Arthropoda)在枝狀管網(wǎng)和PP棉樣本中含量較高,在龍頭樣本中含量較低甚至接近0;裝甲菌門(Armatimonadetes)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)在龍頭樣本中含量較高,在枝狀管網(wǎng)及PP棉樣本中含量較低。

如圖3所示,在屬分類學(xué)水平上,H_ZW、H_PP、H_LT樣品分別檢測出3 381、3 061、2 972個(gè)屬。優(yōu)勢菌屬為:鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)(7.70%,0.85%～18.77%)、鐵元素菌屬(Ferrigenium)(4.26%,0.01%～12.74%)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)(4.19%,0.21%～6.48%)、不溶桿菌屬(Immundisolibacter)(3.61%,0.07%～10.70%)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)(3.22%,3.18%～3.27%),其相對豐度均大于3.00%,平均相對豐度占總序列的(22.97%,13.31%～32.90%)。其次為暫定分類亞硝化菌屬(Candidatusnitrosotenuis)、博斯氏菌屬(Bosea)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、單胞菌屬(Brevundimonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、微桿菌屬(Microbac-terium)、衣原體屬(Chlamydia)平均相對豐度均大于1.50%,其他菌屬的相對豐度合計(jì)為58.13%(47.62%～68.72%)。

鐵元素菌屬在H_ZW樣品中占比最高(12.74%),其含量也明顯高于其他兩個(gè)樣品,這與市政或小區(qū)管網(wǎng)采用金屬管材有一定關(guān)系,生絲微菌屬在H_PP樣品中占比最高(6.48%),鐵元素菌屬在H_PP樣品中幾乎沒有,鞘氨醇單胞菌在H_LT樣品中占比最高(18.77%),不溶桿菌屬在H_LT樣品中含量明顯高于其他兩個(gè)樣品。在H_PP樣品中檢測到生絲微菌屬具有最高占比,這說明凈水器作為直飲水的最后屏障,在過濾顆粒物、膠體甚至離子方面具有一定的優(yōu)勢,但仍有聚集微生物的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 KEGG功能注釋

KEGG功能基因注釋信息結(jié)果如圖4所示,所有樣品中微生物在數(shù)據(jù)庫中注釋到的基因序列表現(xiàn)出了豐度上的差異性和功能上的多樣性,但總體差異性不明顯,3組樣品中注釋到數(shù)量最多的通路是碳水化合物代謝(12.47%,12.30%～12.80%),這和文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致,其次是氨基酸代謝(10.58%,9.44%～11.55%)、能量代謝(6.80%,6.47%～7.35%)以及輔助因子和維生素的代謝(5.43%,5.10%～6.03%),4種注釋基因占總質(zhì)量的35.28%(34.24%～36.47%)。磷酸轉(zhuǎn)移酶(phosphotrans-ferase,MPH)在微生物介導(dǎo)碳水化合物的攝取、磷酸化以及調(diào)節(jié)細(xì)菌毒力與應(yīng)激反應(yīng)方面具有重要作用[22],其在H_ZW中較其他兩個(gè)樣本有較高含量(13.19%),這和枝狀管網(wǎng)余氯存有量較龍頭和凈化器高有很大關(guān)系。

2.3 ARGs注釋

與CARD(the comprehensive antibiotic resistance database)數(shù)據(jù)庫比對,注釋結(jié)果如圖5所示。根據(jù)最佳ARO抗性基因統(tǒng)計(jì)[圖5(a)],adeF平均相對豐度最高(15.71%,3.66%～28.48%),其次為mphO(4.42%,0.03%～13.06%)、IMI-8(3.48%,0.02%～9.62%)、Sed-1(3.24%,0.05%～8.65%)、Bsub_mprF(3.14%,0.86%～7.32%),平均相對豐度均超過3%,5種抗性基因平均相對豐度總和占總樣本的超30%。H_ZW樣品中平均相對豐度較高的基因是mphO(13.06%)、adeF(3.67%);H_PP樣品中平均相對豐度較高的基因是adeF(14.97%)、IMI-8(9.62%);H_LT樣品中adeF(28.48%)、bcrC(2.86%)兩種基因平均相對豐度較高;說明3組樣品中抗生素耐藥類型主要為外源泵類,其次為大環(huán)內(nèi)酯類。

圖5 抗性基因統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistics of ARGs

由AMR基因家族抗性基因統(tǒng)計(jì)[圖5(b)]可知,耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化家族(resistance-nodulation-cell division,RND)在所有樣品中相對豐度均為最高,平均相對豐度(23.72%,13.57%～37.73%),其他含量相對較高的抗性基因還有主要易化子超家族(macrolide major facilitator superfamily,MFS)(6.30%,3.57%～8.01%)、MPH(4.78%,0.39%～13.19%)、OXA型β-內(nèi)酰胺酶(OXA beta-lactamase)(4.69%,3.40%～6.23%)、防御素抗性雙功能細(xì)菌抗性蛋白(defensin resistant mprF)(4.03%,1.98%～7.51%),其相對豐度均大于4.0%,平均相對豐度占總序列的43.52%(34.72%～52.87%)。RND是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制[23],其能使得細(xì)菌對藥物的耐藥性迅速增加,最突出的是非腸道致病菌,可以推測龍頭較枝狀管網(wǎng)和凈化器有較高的ARGs污染風(fēng)險(xiǎn)。

由抗性基因統(tǒng)計(jì)圖5(c)可知,四環(huán)素類抗生素(12.88%,7.90%～18.49%)、氟喹諾酮類抗生素(10.96%,5.6%～17.18%)、頭孢菌素(10.67%,8.91%～12.21%)、青霉烷類抗生素(10.38%,8.23%～11.89%)、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(8.61%,6.05%～13.67%)、碳青霉烯抗生素(8.04%,5.78%～10.04%)、肽類抗生素(5.08%,4.41%～6.01%)的相對豐度均大于5.0%,平均相對豐度占總序列的66.63%(62.26%～69.11%)。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在樣品在H_ZW中明顯高于其他兩個(gè)樣品;氟喹諾酮類抗生素、四環(huán)素類抗生素在樣品在H_LT中有較高豐度值。3組樣品中藥物種類豐度最高的為四環(huán)素類和氟喹諾酮類抗生素,這與Li等[7]的研究結(jié)果一致,而耐藥基因數(shù)量最多的則為外排泵類和大環(huán)內(nèi)酯類,說明3組樣品中大部分最佳ARO抗性基因絕對豐度并不高。

由抗性基因統(tǒng)計(jì)圖5(d)可知,3組樣品中平均豐度較高的基因有抗生素滅活(39.97%,29.48%～51.02%)、抗生素外排泵(34.01%,25.31%～49.01%)、抗生素靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)改變(18.12%,15.98%～22.22%)三者平均相對豐度占樣品總豐度的92.10%(89.34%～94.64%);抗生素滅活在H_ZW和H_PP樣品中平均相對豐度較高,分別為51.02%和39.42%,H_LT樣品中,抗生素外排泵具有最高豐度值為49.01%。在ARO耐藥機(jī)制類型方面,抗生素失活、抗生素外排泵及抗生素靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)改變是主要類型[24],抗生素滅活在H_ZW和H_PP樣品中起主導(dǎo),H_LT樣品中抗生素外排泵更為關(guān)鍵。

2.4 毒力因子注釋

通過與細(xì)菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(virulence factor database,VFDB)比對,預(yù)測獲得的基因注釋結(jié)果如圖6所示?？芍?Type IV pili基因在所有樣品中含量最高,平均相對豐度為4.24%(3.14%～5.54%),其他平均相對豐度較高的基因主要有fbpABC(3.76%,2.65%～5.28%)、beta-hemolysin/cytolysin(3.39%,2.52%～4.33%)、LOS(2.98%,2.33%～3.89%)、Flagella(2.96%,2.28%～4.25%),其相對豐度均大于2.5%,平均相對豐度占總序列的17.33%(16.42%～18.85%)。Type IV pill、LOS在H_ZW中明顯高于其他兩個(gè)樣品;Flagella、Enterobactin含量較少。fbpABC、Flagella在H_PP中較高,Flagella、Beta-hemolysin/cytolysin在H_LT中較高。

圖6 VFDB數(shù)據(jù)庫豐度前20和VFDB豐度前50熱圖Fig.6 VFDB Top 20 Abundance Column Chart and VFDB_Top 50 Abundance Heat Map

毒力因子主要包括防御型毒力因子、毒力相關(guān)基因的調(diào)控、非特異性毒力因子和進(jìn)攻型毒力因子4種[25-26]。進(jìn)攻型毒力因子主要與黏附、分泌系統(tǒng)、侵襲、細(xì)菌毒素等相關(guān)[27]。防御型毒力因子主要與位相變異、血清抵抗、抗吞噬作用、應(yīng)激蛋白、酶等相關(guān)[28]。Type IV pili、LOS以及Flagella具有進(jìn)攻和防御雙重屬性,作為進(jìn)攻型毒力因子時(shí)主要與黏附及細(xì)菌毒素有關(guān),而作為防御型毒力因子時(shí),位相變異則起到主導(dǎo)作用。fbpABC和beta-hemolysin/cytolysin則全是進(jìn)攻型毒力因子,分別與黏附和細(xì)菌毒素有關(guān)。從病原體上進(jìn)一步分析,fbpABC基因的病原體多為腦膜炎雙球菌(N.meningitidis),Type IV pili基因的病原體多為土拉熱弗朗西斯菌(F.tularensis),LOS、Flagella以及beta-hemolysin/cytolysin則存在于多種病原菌體內(nèi)。可知,這些基因的病原體多與人類的流感、鼻竇炎、中耳炎、結(jié)膜炎、腦膜炎等相關(guān)。

3 結(jié)論與展望

(1)住宅廚房給水管網(wǎng)末梢中細(xì)菌群落的豐度值在不同分類學(xué)水平上具有一定差異性,住宅廚房給水管網(wǎng)末梢不同部位可能存在多種微生物,并且具備不同的特定功能,住宅廚房給水管網(wǎng)末梢不同部位均有微生物富集的風(fēng)險(xiǎn)。通過調(diào)控市政給水管網(wǎng)加氯量和增設(shè)小區(qū)管網(wǎng)自加氯系統(tǒng)等方式可以在一定程度上降低此類風(fēng)險(xiǎn),也建議居民將自來水燒開后再進(jìn)行飲用。

(2)碳水化合物代謝(12.47%,12.30%～12.80%)是住宅廚房給水管網(wǎng)末梢樣品中KEGG注釋到數(shù)量最多的通路。研究[4]表明,微生物自身及其新陳代謝中間產(chǎn)物與余氯反應(yīng)可能會產(chǎn)生新的消毒副產(chǎn)物,研究這些新污染物的轉(zhuǎn)化機(jī)制,探討其對住宅廚房給水管網(wǎng)末梢飲用水微生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)的影響具有重要意義。

(3)與飲用水源地、凈水廠、市政給水管網(wǎng)、小區(qū)給水管網(wǎng)、二次加壓水箱一樣,建筑物內(nèi)給水管網(wǎng)同樣存在ARGs污染情況,且龍頭較枝狀管網(wǎng)和凈化器有較高的ARGs污染風(fēng)險(xiǎn),并可能對公眾健康產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)。目前城市生活飲用水供水系統(tǒng)并不能有效去除ARGs污染,加強(qiáng)水源地保護(hù)、對凈水廠處理工藝進(jìn)行升級改造是控制此類新污染物的有效手段。

(4)進(jìn)攻型毒力因子是住宅廚房給水管網(wǎng)末梢細(xì)菌毒力的主要類型,type IV pili基因(4.24%,3.14%～5.54%)在住宅廚房給水管網(wǎng)末梢樣品中含量最高,住宅廚房給水管網(wǎng)末梢有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。未來應(yīng)重視飲水系統(tǒng)微生物毒力因子的測定,可進(jìn)一步研究某些特定毒力因子與水源性疾病之間的相關(guān)關(guān)系,以期更好地預(yù)防飲用水污染。

(5)開展給水管網(wǎng)附件、管件、接頭以及連接管道部位微生物學(xué)研究具有重要意義,本研究不僅揭示了住宅廚房給水管網(wǎng)末梢微生物物種組成、ARGs、毒力因子分布情況,而且還表明H_ZW、H_LT)以及H_PP等部位均有微生物富集風(fēng)險(xiǎn),可能對公眾健康安全產(chǎn)生影響。未來應(yīng)加強(qiáng)對給水管網(wǎng)系統(tǒng)末梢微生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的頻率和范圍,以防止水傳染疾病的發(fā)生。