劉平平 , 謝夢圓, 李文豪 , 郝彥儒, 王建龍, 王旭紅,徐曉靜*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院,內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010000;2. 內(nèi)蒙古自治區(qū) 動物疫病預防控制中心,內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010000)

牛腹瀉主要由病原引起,產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)是引起牛腹瀉的主要細菌性病原,可導致新生犢牛劇烈腹瀉和迅速脫水,造成犢牛生長發(fā)育不良,給養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。近些年來,我國由大腸桿菌引起牛腹瀉的發(fā)病率高達90%,病死率達40%～50%[1],其中由大腸桿菌K99引發(fā)的牛腹瀉最為嚴重。大腸桿菌K99通過促進細菌菌毛粘附于畜體空腸或回腸表面的糖蛋白上,定植產(chǎn)生腸毒素對畜體上皮細胞造成損害,導致腸內(nèi)液體分泌和電解質(zhì)紊亂,進而引發(fā)動物腹瀉脫水甚至死亡[2]。

近年來,學者們對牛腹瀉疾病的研究越來越多。Al Mawly等[3]對新西蘭 97 個奶牛場中1～5 日齡和 9～21 日齡犢牛1 283份糞便樣品進行標準化檢測;張坤[4]用 ELISA 方法和RT-PCR的方法對新疆北疆7個主要規(guī)范化奶牛場腹瀉犢牛進行輪狀病毒感染調(diào)查;岳山[5]對黑龍江不同地區(qū)肉牛場犢牛腹瀉糞樣分離鑒定的 71 株大腸桿菌進行毒力基因檢測,K99 和另2種獨立基因檢出率為1.41%。然而針對大腸桿菌K99引發(fā)的牛腹瀉調(diào)查較少。本研究從呼和浩特市周邊地區(qū)規(guī)?；霾杉瘶悠穼Υ竽c桿菌 K99的流行情況進行調(diào)查分析,為有效制定疫病防控措施,促進市養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

呼和浩特市周邊7個規(guī)?；鲭S機采集380份血樣和糞樣,記錄背景信息。血樣在室溫放置2 h或 4 ℃冰箱過夜,取上清備用。糞樣用生理鹽水稀釋備用。

1.2 主要試劑和儀器

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋技術股份有限公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;DNA提取試劑盒購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司;K99 ELISA抗體檢測試劑盒購自比利時BIO-X公司;標準菌株CVCC 209購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.3 引物合成

參考文獻[6]引物序列,由上海生物工程技術服務有限公司合成,目的片段314 bp。

1.4 規(guī)?；黾S樣大腸桿菌K99抗原檢測

采用PCR方法對380份糞樣進行K99菌毛基因特異性擴增。

按照DNA提取試劑盒說明書,提取糞樣DNA做為模板,用合成的引物進行PCR擴增。25 μL PCR反應體系為:DNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,Taq酶12.5 μL,無酶水8.5 μL。PCR反應條件為:預變性95 ℃ 5 min,變性94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,循環(huán)30次;延伸72 ℃ 10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 規(guī)模化牛場大腸桿菌K99血清抗體檢測

采用ELISA方法,按照K99 ELISA抗體檢測試劑盒說明書操作檢測380份血清樣品。

1.6 細菌分離鑒定

PCR檢測陽性的樣品涂于伊紅美藍培養(yǎng)基表面,37 ℃培養(yǎng)18 h;挑取單個菌落進行純化,革蘭氏染色鏡檢觀察菌體特征。

1.6.1 生化鑒定 將伊紅美藍培養(yǎng)基鑒定為陽性的菌株分別接種于側(cè)金盞花醇、葡萄糖(產(chǎn)氣)、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、木糖、尿素酶、棉子糖、山梨醇、三糖鐵、苯丙氨酸、半固體瓊脂、葡萄糖酸鹽、枸櫞酸鹽、硫化氫、MR-VP生化鑒定管,觀察反應管的現(xiàn)象,鑒定其生化特性。

1.6.2 PCR擴增與測序鑒定 按照DNA提取試劑盒說明書分離菌株,提取細菌DNA,進行PCR擴增。目的條帶PCR產(chǎn)物進行測序。

1.7 藥敏試驗

采用紙片擴散法(K-B法)進行藥敏試驗,根據(jù)臨床試驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 規(guī)?；黾S樣大腸桿菌K99抗原檢測結(jié)果

將380份糞樣進行大腸桿菌K99菌毛基因PCR擴增,25份樣品擴增出314 bp特異性片段,陽性率為6.58%(25/380)。部分PCR擴增結(jié)果如圖1、圖2。

圖1 糞樣PCR擴增結(jié)果 M:DL500bpMarker;1:參考菌株CVCC209;2:陰性對照;3～13:待檢樣品Fig. 1 PCR amplification results of fecal samples M. DL500bpMarker;1. Reference strain CVCC209;2. Negative control;3～13. Samples to be detected

圖2 糞樣PCR擴增結(jié)果 M:DL500bpMarker;1:參考菌株CVCC209;2:陰性對照;3～15:待檢樣品Fig. 2 PCR amplification results of fecal samples M: DL500bpMarker; 1: Reference strain CVCC209;2: Negative control; 3～15: Samples to be detected

2.2 規(guī)?；龃竽c桿菌K99血清抗體檢測結(jié)果

7個規(guī)?；霾杉?80份血清K99抗體檢測結(jié)果見表1。根據(jù)試劑盒說明書陽性判定標準,共檢出陽性血清99份,總陽性率為26%。其中 0～2月齡犢牛陽性率為48.28%,2～6月齡的陽性率為18.18%,6～18月齡的陽性率為10%,成母牛的陽性率為10.77%。

表1 不同月齡的血清樣品K99抗體檢測結(jié)果Table 1 Serum prevalence at different months of age detected by K99 antibody

2.3 規(guī)模化牛場大腸桿菌K99流行病學調(diào)查結(jié)果

7個規(guī)?；?80份樣品抗原抗體流行病學調(diào)查結(jié)果見表2。由表2可知,抗原陽性25份,陽性率為6.58%,抗體陽性99份,陽性率為26%?？乖贵w均為陽性12份,陽性率3.15%。

2.4 細菌分離鑒定結(jié)果

2.4.1 分離純化結(jié)果 從25份PCR檢測陽性樣品中分離出83株疑似大腸桿菌,觀察其在伊紅美藍平板上的形態(tài)。如圖3所示,菌落表面光滑濕潤,泛金屬光澤,邊緣整齊,整體輪廓為圓形凸起。鏡檢結(jié)果見圖4,鏡下可見呈紅色兩端鈍圓短桿菌。

表2 K99流行病學調(diào)查結(jié)果Table 2 K99 epidemiological survey results

圖3 伊紅美藍平板上大腸桿菌菌落形態(tài)Fig. 3 Morphology of strains on eosin methylene blue plate

圖4 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig. 4 Gram staining microscopic examination results

2.4.2 生化鑒定結(jié)果 將83株疑似大腸桿菌菌液接種于生化管,結(jié)果可見,83份樣品均不產(chǎn)生硫化氫、苯丙氨酸脫氨酶和尿素酶,不能利用枸櫞酸鹽,在半固體瓊脂上不能擴散生長;能使賴氨酸脫羧,但不能使鳥氨酸脫羧;能發(fā)酵山梨糖和木糖,但不能發(fā)酵側(cè)金盞花醇和棉子糖;甲基紅試驗和吲哚試驗均為陽性結(jié)果。以上反應結(jié)果均符合大腸桿菌的生化特性,說明83份菌液均為大腸桿菌。

2.4.3 PCR擴增結(jié)果 分離的83株疑似大腸桿菌中,采用PCR方法鑒定有8株含有K99菌毛基因,結(jié)果見圖5、6。

圖5 大腸桿菌K99 PCR擴增結(jié)果 M:DL500bpMarker;1:參考菌株CVCC209;2:陰性對照;3～12:不含K99菌毛基因;13～15:含K99菌毛基因Fig. 5 Amplification results of enterotoxin producing Escherichia coli k99PCR M: DL500bpMarker; 1: Reference strain CVCC209;2: Negative control; 3～12: Strains without K99 fimbriae gene; 13～15: Strains containing K99 fimbriae gene

圖6 大腸桿菌K99PCR擴增結(jié)果 M:DL500bpMarker;1:參考菌株CVCC209;2:陰性對照;3～7,11:含K99菌毛基因的分離株;8～10,12:不含K99菌毛基因菌株Fig. 6 Amplification results of enterotoxin producing Escherichia coli k99PCR M: DL500bpMarker; 1: Reference strain CVCC209;2: Negative control; 3～7, 11: Strains containing K99 fimbriae gene; 8～10,12: Strains without K99 fimbriae gene

2.4.4 測序結(jié)果 利用Megalign軟件與GenBank上登錄的參考菌株進行比對分析,結(jié)果見圖7。8株大腸桿菌K99分離株擴增目的基因序列與參考菌株的同源性在99.3%～100%之間,說明8株菌均攜帶菌毛抗原K99。

圖7 分離菌株菌毛基因序列的同源性比較 1-8:樣品,9、10:Genbank上公布的K99菌毛基因序列Fig. 7 Homogeneity comparison of the sequence of isolated strain hair genes 1-8: Samples, 9, 10:Sequence of K99 fimbriae gene published in Genbank

2.5 藥敏結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果如表3所示。根據(jù)臨床試驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準判定結(jié)果可知,分離到的8株大腸桿菌K99對慶大霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、丁胺卡那、卡那霉素敏感。

表3 藥敏試驗結(jié)果Table 3 Susceptibility test results

3 討 論

隨著呼和浩特市養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展,牛場養(yǎng)殖密度不斷增加,由大腸桿菌K99引發(fā)的牛腹瀉愈發(fā)嚴重。本研究從病原學和血清學2個方面對呼和浩特7個規(guī)模化養(yǎng)殖場進行K99流行情況調(diào)查,從380份糞樣檢測出25份疑似攜帶K99菌毛基因。通過對病原分離培養(yǎng)、生化鑒定、分子生物學鑒定,從25份PCR陽性樣品中分離出83株疑似大腸桿菌,其中8株鑒定含有K99菌毛基因。ELISA檢測K99血清抗體總陽性率為26%,其中 0～2月齡犢牛陽性率為48.28%,2～6月齡的陽性率為18.18%,6～18月齡的陽性率為10%,成母牛陽性率為10.77%。

通過對呼和浩特市周邊規(guī)模化牛場抗原抗體的流行情況進行調(diào)查,表明該地區(qū)牛場存在大腸桿菌K99的感染,且高發(fā)于0～2月齡的犢牛。K99感染可能與母體抗體減少導致新生犢牛免疫低下有關,剛出生的犢?？贵w保護尚不充分,若初乳飼喂不足,犢牛胃腸道吸收能力弱,更易受到大腸桿菌 K99的感染。犢牛補充日糧后,機體的蛋白質(zhì)能量充足,飼料中含的維生素如維生素A、維生素D、銅、硒、鐵等有助于犢牛機體對病原菌的抵抗[7]。DE LA FUENTE等[8]研究表明,GM3是小腸黏膜上主要的神經(jīng)節(jié)普脂,K99附著于此。隨著月齡的增加,GM3的表達量減少,所以2～6月齡、6～18月齡、成母牛的抗體陽性率都低于0～2月齡,這可能也是K99容易引起犢牛腹瀉的原因之一。

大腸桿菌K99引發(fā)的腹瀉嚴重影響犢牛的生長發(fā)育和存活率,不及時治療會造成犢牛死亡,導致育肥牛場經(jīng)濟損失。本研究中,呼和浩特市周邊地區(qū)牛場存在大腸桿菌K99的感染,高發(fā)于0～2月齡犢牛。養(yǎng)殖戶也應注意新生犢牛的初乳喂養(yǎng)和管理因素。新生犢牛對大腸桿菌感染的被動免疫和抵抗力與初乳喂養(yǎng)密切相關[9],通過初乳被動獲得免疫是預防犢牛腹瀉病的主要因素。同時也要加強牛場飼養(yǎng)管理,如畜群規(guī)模和環(huán)境溫度、消毒牛群喂養(yǎng)設備。正確認識牛腹瀉的發(fā)病原因,對因處理,對癥治療,重視預防,加強飼養(yǎng)管理,才能從根本上減少牛腹瀉的發(fā)生。

4 結(jié) 論

呼和浩特市周邊規(guī)?；龃嬖诖竽c桿菌K99的感染,病原陽性率6.58%,血清陽性率為26%,陽性血樣多集中于0～2月齡犢牛。菌毛基因PCR測序鑒定出8株K99菌株,分離株對慶大霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、丁胺卡那、卡那霉素敏感。