呂向坤 張堃 焦艾麗 劉洋 劉雪靜

頸項透明層(nuchal translucency,NT)是指超聲檢查在孕婦孕早期(11～13+6周)所測得的胎兒頸椎矢狀切面最大厚度,大量研究已經(jīng)證實NT增厚與胎兒染色體異常之間存在密切聯(lián)系,因此常將NT值作為早孕期產(chǎn)前超聲篩查的一種重要指標[1]。目前臨床上一般認為NT≥2.5 mm或NT≥3.0 mm者即屬于NT值增厚,但針對NT增厚具體截斷值仍存在一定爭議[2]。細胞G顯帶染色體核型分析是目前臨床上評估孕期高危孕婦胎兒染色體異常的金標準,已經(jīng)在產(chǎn)前診斷中廣泛使用,但由于以往普通G顯帶核型分析技術(shù)具有細胞培養(yǎng)周期長、污染風險大且分辨率不高等眾多缺陷,使其應(yīng)用逐漸受限[3]。染色體拷貝數(shù)異常作為導(dǎo)致胎兒結(jié)構(gòu)畸形、先天性生長發(fā)育遲緩以及其他各類遺傳綜合征的發(fā)病基礎(chǔ),對染色體異常部分進行測序的產(chǎn)前診斷模式已經(jīng)成為近年來研究的熱點和難點[4]。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)不斷進步,染色體拷貝數(shù)變異測序(copy number variation sequencing,CNV-seq) 已成功應(yīng)用于臨床,該技術(shù)以大規(guī)模平行測序技術(shù)為測定基礎(chǔ),并表現(xiàn)出良好的檢測性能,可以實現(xiàn)染色體測序分辨率精確至0.1 Mb,有助于提高出生缺陷胎兒的產(chǎn)前篩查準確率,且最新指南已將CNV-seq作為產(chǎn)前診斷一線檢查方案[5]。本研究對我院128例產(chǎn)前超聲篩查顯示為NT增厚的胎兒基因進行核型分析以及CNV-seq分析,旨在探討核型分析與CNV-seq在NT值異常胎兒的產(chǎn)前遺傳診斷中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2020年12月在醫(yī)院就診的128例早孕期(孕11～13+6周)超聲篩查提示胎兒NT≥2.5 mm的孕婦為研究對象,孕婦年齡20～42歲,平均(31.47±3.25)歲,孕周17+2～22+6周;平均(20.1±1.21)周;均為單胎妊娠。所有孕婦夫妻雙方在知情同意書上簽字,該研究方案已得到我院倫理委員會準許。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①早孕期(孕11～13+6周)超聲篩查提示胎兒NT≥2.5 mm;②均為單胎妊娠;③患者均無高血壓、糖尿病等嚴重妊娠期合并疾病;④無惡性腫瘤或病史;⑤符合羊膜腔穿刺手術(shù)指征;⑥患者均簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：患者合并其他嚴重系統(tǒng)性疾病或嚴重心、肝、腎功能不全者。

1.3 方法 對孕婦進行羊膜腔穿刺手術(shù)并抽取適量羊水,并開展CNV-seq及核型分析。(1)取5 ml羊水外送至深圳華大基因公司進行CNV-seq,主要檢測>100 kb的CNV、染色體非整倍體變異,評估致病性。(2)20 ml羊水離心后接種于獨立的培養(yǎng)體系中,培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃,培養(yǎng)第7天換液,于第8天加入50 μl秋水仙素(200 μg/ml),培養(yǎng)30 min后獲取細胞,按照標準流程進行G顯帶染色法顯帶。

2 結(jié)果

2.1 NT增厚胎兒核型異常類型 入組的128例NT增厚胎兒中共檢出異常22例(17.19%),其中21三體14例,21三體嵌合1例,性染色體異常3例,18三體2例,其他染色體異常2例。見表1。

表1 NT增厚胎兒核型異常類型及占比

2.2 不同 NT值胎兒核型異常情況比較 2.5 mm≤NT<3.5 mm76例,3.5 mm≤NT<4.5 mm23例,NT≥4.5 mm組15例,核型異常檢出率分別為10.53%、21.21%和36.84%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同 NT值胎兒核型異常情況比較 例(%)

2.3 不同指征胎兒核型異常情況比較 入組的128例NT增厚胎兒中單純NT增厚98例,NT增厚合并其他指征(包括血清學(xué)篩查異常、其他超聲異常、夫妻雙方染色體異常、不良孕產(chǎn)史)30例。2組核型異常檢出率分別為12.24%、33.33%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同指征胎兒核型異常情況比較 例(%)

2.4 核型聯(lián)合CNV-seq染色體異常結(jié)果分析 128例NT增厚胎兒均進行羊水CNV-seq檢測,25例(19.53%)檢測出可疑致病性或已知致病性CNVs。其中核型正常的NT增厚胎兒中有4例為可疑致病性或已知致病性CNVs,存在微缺失/微重復(fù)片段位置以及關(guān)鍵基因臨床表型,2例核型檢測出平衡易位、羅氏易位等,而CNV-seq未檢出。見表4、5。

表5 CNV-seq無法檢測羅氏易位、平衡易位等胎兒情況及隨訪結(jié)果

3 討論

產(chǎn)前篩查和診斷作為優(yōu)生優(yōu)育的重要手段,對于有效預(yù)防先天缺陷患兒出生具有重要意義。影像學(xué)和分子生物學(xué)是目前臨床上產(chǎn)前篩查胎兒染色體異常和結(jié)構(gòu)畸形的關(guān)鍵技術(shù)手段,孕11～13+6周的NT超聲測量即為早孕期篩查和評估胎兒染色體異常的重要指標[7]。既往研究結(jié)果證實,75%左右21三體綜合征胎兒伴有孕早期NT增厚[8]。但近年來有研究發(fā)現(xiàn)18三體綜合征、Turner綜合征等先天性缺陷性疾病的發(fā)生也與NT增厚存在密切聯(lián)系。本研究納入的128例產(chǎn)前超聲提示NT≥2.5 mm孕婦,G顯帶核型分析結(jié)果表明,21三體綜合征在胎兒染色體異常中的占比為10.94%,其他類型的染色體異常占比為6.25%,主要包括18三體綜合征、性染色體異常等。提示NT增厚不僅可導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)21三體綜合征,也可能出現(xiàn)其他染色體異常。另外薛淑雅等[9,10]通過對NT增厚胎兒的染色體核型進行分析,證實胎兒染色體異常檢出率與NT厚度之間存在顯著正相關(guān),即NT厚度越大,染色體異常檢出率風險明顯上升。本研究結(jié)果顯示,不同NT厚度組胎兒的核型異常檢出率差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且隨著NT厚度增加,染色體異常檢出率逐漸增高,與前人研究結(jié)果具有可比性。彭亞琴等[11]研究結(jié)果顯示相較于單純性NT增厚,當其他產(chǎn)前異常產(chǎn)前診斷指征如高齡、不良生育史、夫妻雙方染色體異常以及血清學(xué)篩查高風險等與NT增厚同時合并存在時,胎兒致病性染色體異常的檢出率將大大提高。本研究發(fā)現(xiàn)NT增厚合并其他指征的核型異常檢出率33.33%,明顯高于單純NT增厚(12.24%),表明NT增厚合并高齡、夫妻雙方染色體異常、不良孕產(chǎn)史等病例時,可能增加核型異常風險,提高致病性染色體異常檢出率,同時黎昱等[12]研究也證實NT 增厚合并其他異常的致病性染色體異常檢出率高于單純性NT增厚。

染色體微重復(fù)/微缺失綜合征是指患者存在染色體的微小片段重復(fù)或者缺失,導(dǎo)致正常基因組部分的片段拷貝數(shù)發(fā)生異常,進而產(chǎn)生具有復(fù)雜臨床表現(xiàn)的遺傳性疾病[13,14]。該類疾病一般為散發(fā),且重復(fù)或者缺失的片段基本低于5 Mb,因此常規(guī)G顯帶核型分析檢測準確率較低。CNV-seq技術(shù)可用于大片段缺失/重復(fù)、覆蓋全染色體非整倍體及全基因組的基因組拷貝數(shù)測序。特別是高通量CNV-seq可以對全基因組進行均勻覆蓋,致病性CNVs檢出率可高達100%,有助于提高臨床意義未明的CNVs陽性率[15]。魏友華等[16]采用核型分析及CNV-seq檢測分析NT增厚胎兒染色體,發(fā)現(xiàn)在核型分析基礎(chǔ)上l聯(lián)合CNV-seq法可多發(fā)現(xiàn)1.11%的明確致病性CNVs,降低核型分析時無法檢出的染色體微重復(fù)/微缺失綜合征,利于產(chǎn)前遺傳咨詢。本研究128例NT增厚胎兒中,傳統(tǒng)核型分析檢出22例核型異常(17.19%),而CNV-seq檢出24(18.75%)例已知致病性及可疑致病性CNVs,其中核型正常的NT增厚胎兒中有3例為可疑致病性或已知致病性CNVs,存在微缺失/微重復(fù)片段位置以及關(guān)鍵基因臨床表型。1例核型為46,XY,t(14;21)(q10;q10),+21的患者,CNV-seq檢測顯示47,XN,+21．(21)×3,46,XX,t(9;17)(q12;p11.2)的患者,CNV-seq并未檢測出平衡易位,提示為疑似致病,表明CNV-seq無法檢測平衡易位、羅氏易位,目前仍需以染色體核型分析作為金標準。

綜上所述,當NT增厚特別是合并其他風險指征時,胎兒發(fā)生染色體異常的風險明顯升高。將G顯帶核型聯(lián)合CNV-seq分析應(yīng)用于NT增厚胎兒產(chǎn)前診斷,可以有效提高胎兒染色體異常檢出率和準確率,減少染色體微缺失/微重復(fù)綜合征缺陷兒的出生,更有利于產(chǎn)前遺傳咨詢。