張玉杰 李佳慧 司宇光

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽黏膜的上皮性癌,發(fā)病率高,常見(jiàn)于鼻咽部咽隱窩,早期表現(xiàn)為鼻出血、回縮性血涕等,由于其惡性程度高、淋巴轉(zhuǎn)移早、發(fā)生位置隱匿,極易侵犯淋巴、顱內(nèi)、骨、肝、肺組織[1]。鼻咽癌的治療手段包括放療、化療、中醫(yī)藥、外科手術(shù)和免疫治療等,但治療總周期比較長(zhǎng),且預(yù)后不佳[2]。此外,腫瘤免疫逃逸是癌細(xì)胞在體內(nèi)生存和增殖的關(guān)鍵,也是治療腫瘤的重要突破口[3]。因此,探索減少腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的靶向制劑是臨床上改善患者預(yù)后的有效途徑。楊梅素是楊梅科植物楊梅樹(shù)葉、皮、根的提取物,能夠抑制肝癌、胃癌、乳腺癌等多種癌細(xì)胞增殖[4],并且能夠靶向抑制Janus激酶(JAK)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)-干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF1)軸,降低肺癌細(xì)胞的活性,減少免疫逃逸[5]。本研究擬通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),觀察楊梅素對(duì)鼻咽癌細(xì)胞免疫逃逸的影響以及對(duì)JAK-STAT-IRF1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與動(dòng)物：人鼻咽癌CNE1細(xì)胞,購(gòu)自上海通派生物科技有限公司;40只健康雄性BALB/c裸鼠(體重18～22 g),購(gòu)自北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司,生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)-2020-0007。

1.1.2 藥物、試劑與儀器：①楊梅素(純度≥98%)、Broussonin E、紫杉醇(純度≥98%),購(gòu)自美國(guó)MCE公司;Hoechst染色試劑盒,購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司;RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基、4%多聚甲醛(PFA)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、RIPA裂解液、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液、TritonX-100、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗和結(jié)晶紫溶液購(gòu)自碧云天生物;MTT細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定試劑盒,購(gòu)自美國(guó)Merck;Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自翌圣生物;一抗叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)、維甲酸相關(guān)孤核受體γt(RORγt)、磷酸化(p)- JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1、IRF1、程序性死亡受體1配體(PD-L1)和GAPDH,購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。②CO2培養(yǎng)箱,購(gòu)自德國(guó)Memmert公司;細(xì)胞板、移液槍、超凈工作臺(tái)、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀,購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;熒光顯微鏡,購(gòu)自日本Keyence公司;電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀,購(gòu)自北京鴻濤基業(yè)科技;Tanon 1600全自動(dòng)凝膠成像分析儀,購(gòu)自天能集團(tuán)。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與處理：①?gòu)?fù)蘇CNE1細(xì)胞后轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基中,置于CO2培養(yǎng)箱(5% CO2,37℃)中培養(yǎng),定期更換培養(yǎng)液,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②CNE1細(xì)胞重懸后接種于96孔板,調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105個(gè)/孔,隨機(jī)分為5組,分別為對(duì)照組、楊梅素L組、楊梅素M組、楊梅素H組和楊梅素H+Broussonin E組,每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔。楊梅素L、M、H組分別向每孔中加入25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L楊梅素[6],楊梅素H+Broussonin E組向每孔中加入75 μmol/L楊梅素+20 μmol/L Broussonin E[7],共同培養(yǎng)24 h。

1.2.2 MTT法檢測(cè)CNE1細(xì)胞的增殖能力：將1.2.1中各組細(xì)胞傳代培養(yǎng)于96孔板中,并調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105個(gè)/孔,每孔加入10%體積的MTT溶液,37℃孵育4 h,棄去上清,加入與初始體積等量的Formazan Solvent溶液,搖床震蕩、移液槍吹打使MTT甲臜結(jié)晶物完全溶解后,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下各孔細(xì)胞的光密度(OD)細(xì)胞增殖能力與OD值成正比。

1.2.3 Hoechst法檢測(cè)CNE1細(xì)胞凋亡情況：將1.2.1中各組CNE1細(xì)胞接種于6孔板中,每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞,用40 g/L的PFA溶液固定0.5 h,TritonX-100透明處理,加入5 mg/L Hoechst熒光材料染色,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min,在熒光顯微鏡下拍照記錄。高亮藍(lán)色是凋亡細(xì)胞,低熒光強(qiáng)度為未凋亡細(xì)胞,使用ImageJ 1.47分析各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞Foxp3、RORγt、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1、IRF1蛋白表達(dá)：收集1.2.1中各組CNE1細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,使用BCA試劑盒定量蛋白濃度,隨后采用Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。配制SDS-PAGE凝膠,樣品上樣量為10 μg,電泳參數(shù)設(shè)置為80 V通電30 min后,轉(zhuǎn)為120 V通電1 h。取下凝膠,轉(zhuǎn)膜儀參數(shù)設(shè)置為200 V,將已分離的條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜。封閉后的PVDF膜分別置于Foxp3、RORγt、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1、IRF1(稀釋比例為1∶1 000)和GAPDH(稀釋比例為1∶2 000)過(guò)夜,再經(jīng)過(guò)二抗(稀釋比例為1∶500)和ECL超敏化學(xué)發(fā)光液孵育,使用Tanon 1600軟件拍照并分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鼻咽癌裸鼠模型建立：取1.2.1對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE1細(xì)胞備用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境為SPF級(jí)動(dòng)物房無(wú)菌室,12 h/12 h光暗循環(huán),溫度(24±1)℃,濕度(50±10)%,自由攝食、飲水。建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型：裸鼠側(cè)背部皮下注射1.0×107個(gè)/ml CNE1細(xì)胞懸液,注射10 d時(shí)出現(xiàn)綠豆大小的腫瘤塊,注射21 d時(shí)腫瘤體積≥100 mm3表示建模成功[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序已通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)操作如注射、取材等均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室相關(guān)規(guī)定。

1.3.2 裸鼠分組：建模成功后,將鼻咽癌模型裸鼠隨機(jī)分為模型組、楊梅素低劑量組、楊梅素中劑量組、楊梅素高劑量組和紫杉醇組,每組8只。第1天至第7天,楊梅素低、中、高劑量組裸鼠每日分別灌胃楊梅素10、20、40 mg/kg,紫杉醇組裸鼠腹腔注射2.0 mg/kg紫杉醇,模型組灌胃適量0.9%氯化鈉溶液[9,10]。

1.3.3 裸鼠巨噬細(xì)胞分離：藥物干預(yù)完成后,頸部脫臼法處死裸鼠,剖開(kāi)腹部,使用0.9%氯化鈉溶液沖洗腹腔并收集灌洗液,以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,收集細(xì)胞,RPMI 1640重懸后接種于6孔板中,置于CO2培養(yǎng)箱(5% CO2,37℃)中無(wú)菌培養(yǎng)2 h,清洗細(xì)胞,加入含有10% PBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)：巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,以2 000 r/min離心10 min,重懸后加入加入PD-L1抗體,避光孵育15 min,加入400 μl結(jié)合緩沖液混勻。流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD-L1的表達(dá),使用FlowJo 7.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 裸鼠瘤體：裸鼠被處死后,剝離移植瘤體,拍照并稱(chēng)重。

1.3.6 Western blot檢測(cè)各組裸鼠Foxp3、RORγt、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1、IRF1蛋白表達(dá)：取1.3.5中腫瘤組織,提取瘤體蛋白,按照1.2.4方法檢測(cè)Foxp3、RORγt、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1、IRF1蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 5組CNE1細(xì)胞增殖情況比較 與對(duì)照組比較,楊梅素L、M、H組細(xì)胞的增殖能力顯著降低(P<0.05);與楊梅素H組相比,楊梅素H+Broussonin E組細(xì)胞的增殖能力顯著提高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 5組CNE1細(xì)胞OD450值比較 n=6,

2.2 5組CNE1細(xì)胞凋亡率比較 對(duì)照組和楊梅素H+Broussonin E組亮藍(lán)色細(xì)胞較少,細(xì)胞均勻分布;楊梅素L、M、H組高亮藍(lán)色細(xì)胞隨劑量升高而增多,且細(xì)胞呈現(xiàn)分葉、碎片狀。分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,楊梅素L、M、H組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);與楊梅素H組相比,楊梅素H+Broussonin E組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)圖1,表2。

對(duì)照組 楊梅素L組 楊梅素M組 楊梅素H組 楊梅素H+Broussonin E組

表2 5組CNE1細(xì)胞凋亡率比較 n=6,%,

2.3 5組裸鼠巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)比較 與模型組比較,楊梅素低、中、高劑量組和紫杉醇組裸鼠巨噬細(xì)胞中PD-L1表達(dá)水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。見(jiàn)表3。

表3 5組裸鼠巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)比較 n=8,%,

2.4 5組CNE1細(xì)胞蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比,楊梅素L、M、H組細(xì)胞中RORγt、p-JAK1/JAK1、p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1、IRF1蛋白表達(dá)水平顯著下降,Foxp3蛋白表達(dá)增加(P< 0.05);與楊梅素H組比較,楊梅素H+Broussonin E組細(xì)胞中RORγt、p-JAK1/JAK1、p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1、IRF1蛋白表達(dá)水平增加,Foxp3蛋白表達(dá)水平顯著減少(P< 0.05)。見(jiàn)表4,圖2。

圖2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Foxp3、RORγt、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1、IRF1蛋白的表達(dá);A 對(duì)照組;B 楊梅素L組;C 楊梅素M組;D 楊梅素H組;E 楊梅素H+Broussonin E組

表4 細(xì)胞中Foxp3、RORγt、p-JAK1/JAK1、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、IRF1蛋白表達(dá)水平比較 n=6,

2.5 5組裸鼠瘤體質(zhì)量比較 與模型組比較,楊梅素低、中、高劑量組和紫杉醇組裸鼠瘤體體積縮小,瘤體質(zhì)量顯著降低(P< 0.05)。5組裸鼠移植瘤大體形態(tài)見(jiàn)圖3,表5。

圖3 5組裸鼠移植瘤大體形態(tài)

表5 5組裸鼠瘤體質(zhì)量比較 n=8,%,

2.6 5組裸鼠蛋白表達(dá)水平比較 與模型組相比,楊梅素低、中、高組劑量組和紫杉醇組裸鼠RORγt、p-JAR1/JAK1、p-JAR2/JAK2、p-STAT1/STAT1、IRF1蛋白表達(dá)水平顯著下降,Foxp3蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。見(jiàn)圖4,表6。

圖4 Western blot檢測(cè)裸鼠中Foxp3、RORγt、p-JAK1、JAK1、p-JAK2、JAK2、p-STAT1、STAT1、IRF1蛋白的表達(dá);A 對(duì)照組;B 楊梅素低劑量組;C 楊梅素中劑量組;D 楊梅素高劑量組;E 紫杉醇組

表6 5組裸鼠Foxp3、RORγt、p-JAK1/JAK1、p-JAK2/JAK2、p-STAT1/STAT1、IRF1蛋白表達(dá)水平比較 n=8,

3 討論

隨著生活方式的不斷改變和生活環(huán)境的日益惡化,鼻咽癌的發(fā)病率逐年升高,由于癌細(xì)胞增殖迅速、易轉(zhuǎn)移,鼻咽癌已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的重大疾病之一[2]。近年來(lái),越來(lái)越多的證據(jù)指示,免疫抑制性腫瘤微環(huán)境會(huì)導(dǎo)致癌癥生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性[11]。癌細(xì)胞免疫逃逸是腫瘤前體細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變的必經(jīng)階段,貫穿癌癥發(fā)病與進(jìn)展的全過(guò)程,也是免疫治療的基礎(chǔ)[12]。腫瘤微環(huán)境中免疫相關(guān)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫抑制在癌細(xì)胞逃逸免疫應(yīng)答中發(fā)揮了重要作用[11]。PD-L1是B7家族細(xì)胞表面糖蛋白,也是維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要蛋白質(zhì),癌細(xì)胞上的PD-L1與免疫細(xì)胞上的程序性細(xì)胞死亡1(PD-1)結(jié)合,有助于癌癥免疫逃逸[13]。本研究通過(guò)構(gòu)建鼻咽癌CNE1細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,采用不同濃度楊梅酸干預(yù)后提取巨噬細(xì)胞檢測(cè)PD-L1的表達(dá)水平,結(jié)果顯示：楊梅酸下調(diào)巨噬細(xì)胞PD-L1的表達(dá),減小瘤體體積,說(shuō)明楊梅酸可以抑制巨噬細(xì)胞PD-L1的表達(dá),減少癌細(xì)胞免疫逃逸,近而抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。

Foxp3是調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Tregs)分化和功能的調(diào)控因子[14]。在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中,下調(diào)Foxp3的表達(dá)可以預(yù)防癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[15]。RORγt是對(duì)T輔助細(xì)胞(Th17)分化起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子,腫瘤細(xì)胞炎癥反應(yīng)引起RORγt表達(dá)增加,Th17細(xì)胞激活加劇炎癥,而Tregs細(xì)胞抑制炎癥,維持機(jī)體自身免疫平衡[16]。因此,Foxp3和RORγt的表達(dá)決定了T細(xì)胞分化為T(mén)regs或Th17的方向,二者的平衡決定了機(jī)體免疫狀態(tài)的穩(wěn)定。有研究發(fā)現(xiàn),鼻咽癌患者癌組織Foxp3活性下降,上調(diào)腫瘤間質(zhì)中Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量與預(yù)后呈正相關(guān)[17]。本研究也發(fā)現(xiàn),楊梅素能夠上調(diào)CNE1細(xì)胞和鼻咽癌裸鼠中Foxp3表達(dá)水平、降低RORγt表達(dá)水平,可能降低了鼻咽癌腫瘤微環(huán)境中Treg主導(dǎo)的免疫耐受現(xiàn)象。

本研究還討論了楊梅素對(duì)鼻咽癌JAK-STAT-IRF1信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。在腫瘤微環(huán)境中,免疫應(yīng)答刺激JAK1/2磷酸化,隨后JAK1/2磷酸化的受體招募并磷酸化STAT1,活化的STAT1遷移到細(xì)胞核并轉(zhuǎn)錄激活誘導(dǎo)基因IRF1,下調(diào)JAK-STAT-IRF1信號(hào)通路可減少腫瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)[18]。本研究中,楊梅素干預(yù)CNE1細(xì)胞和鼻咽癌裸鼠后,p-JAR1/JAK1、p-JAR2/JAK2、p-STAT1/STAT1、IRF1蛋白表達(dá)水平顯著下降,說(shuō)明楊梅素可以抑制JAK-STAT-IRF1信號(hào)通路。楊梅素減少鼻咽癌細(xì)胞免疫逃逸的作用可能是通過(guò)抑制JAK-STAT-IRF1通路實(shí)現(xiàn)的。為了驗(yàn)證這一假設(shè),我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中增加設(shè)置了楊梅素H+Broussonin E組。Broussonin E是JAK激活劑[7],相較于楊梅素H組,楊梅素H+Broussonin E組CNE1細(xì)胞增殖能力及RORγt、p-JAR1/JAK1、p-JAR2/JAK2、p-STAT1/STAT1、IRF1蛋白表達(dá)水平增加,調(diào)亡率和Foxp3蛋白表達(dá)水平降低,表明Broussonin E干預(yù)增強(qiáng)了CNE1免疫逃逸能力及JAK-STAT-IRF1信號(hào),也印證了楊梅素抑制鼻咽癌細(xì)胞的免疫逃逸能力與其抑制JAK-STAT-IRF1信號(hào)激活有關(guān)。

綜上所述,楊梅素抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖,抑制瘤體生長(zhǎng),其機(jī)制可能與其降低腫瘤微環(huán)境巨噬細(xì)胞的PD-L1活性,激活Foxp3并抑制RORγt和JAK-STAT-IRF1通路,進(jìn)而減少腫瘤細(xì)胞免疫逃逸有關(guān)。本研究中未能在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中找到JAK-STAT-IRF1信號(hào)通路的激活劑,故不能完美地與體外實(shí)驗(yàn)一一對(duì)應(yīng),后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步完善。