羅傳超 王佳星 朱勤偉

糖尿病(DM)是指機(jī)體常年處于血糖、碳水化合物和脂肪代謝紊亂的一種代謝性疾病[1]。近年來,隨著經(jīng)濟(jì)物質(zhì)水平的提高,DM的發(fā)病率逐年上升,成為全世界國(guó)家的常見疾病,嚴(yán)重威脅著人類健康[2]。2型糖尿病(T2DM)占DM總數(shù)90%以上,約60%的T2DM患者合并有心血管并發(fā)癥,約80%死于大血管病變[3]。因此DM的防治,特別是T2DM大血管并發(fā)癥的防治具有重大意義。近年來的研究認(rèn)為氧化應(yīng)激是導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙的重要原因[4]。低密度脂蛋白(LDL)與氧自由基發(fā)生反應(yīng)之后產(chǎn)生氧化低密度脂蛋白(oxLDL),oxLDL發(fā)揮毒性作用需要與其受體LOX-1介導(dǎo)[5-7]。LOX-1表達(dá)上調(diào)之后,oxLDL與LOX-1結(jié)合增加,進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞,ROS含量相應(yīng)升高,激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB),導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生紊亂[8],形成泡沫細(xì)胞,最后將形成動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊[9]。梓醇是地黃中主要的藥理成分,具有抗炎、抗氧化的作用,可以預(yù)防和治療多種氧化應(yīng)激性損傷[10,11]。李文濤等[12]研究表明梓醇可減輕高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞DNA的損傷。因此,本研究主要在T2DM大鼠模型上給予梓醇干預(yù)治療,觀察其對(duì)DM大血管病變的保護(hù)作用,并探討與oxLDL/LDL及NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取健康180～200 g雄性Wistar大鼠50只,購自安領(lǐng)生物醫(yī)藥(深圳)有限公司,合格證號(hào)：SYXK(粵)2021-0268,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,自由取食和飲水,環(huán)境溫度(22±2)℃,相對(duì)濕度(60±5)%,自然晝夜采光。

1.1.2 主要試劑與儀器：梓醇購自上海澄紹生物科技有限公司;二甲雙胍購自丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司;STZ購自上海雅吉生物科技有限公司;蛋白提取試劑盒購自艾美捷科技有限公司;CX41顯微鏡、AU2700全自動(dòng)生化分析儀均購自日本Olympus公司;LOX-1、NF-κB p65、MCP-1單抗及二抗均購自美國(guó)Abcam公司;Trizol試劑均購自廣州威佳科技有限公司;總RNA提取試劑盒購自上海海方生物技術(shù)有限公司;RT-PCR試劑盒購自上海西格生物科技有限公司;MCP-1和oxLDL試劑盒均購自伊艾博(武漢)科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：從50只雄性Wistar大鼠中隨機(jī)選取10只作為對(duì)照組,剩余40只進(jìn)行造模。造模組喂以高糖高脂飼料,4周后大鼠按照25 mg/kg的劑量一次性腹腔內(nèi)注射STZ[13],繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng),對(duì)照組喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料,并注射等量0.9%氯化鈉溶液,檢測(cè)第7天餐后2 h血糖值,血糖值>11.1 mmol/L的大鼠為造模成功,選取其中30只大鼠作為后續(xù)研究對(duì)象。

1.2.2 分組及給藥：將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組、梓醇組,每組10只,繼續(xù)喂以高糖高脂飼料,同時(shí)二甲雙胍組每天給予二甲雙胍(134 mg·kg-1·d-1)[13],梓醇組每天給予梓醇(10 mg·kg-1·d-1)[14],對(duì)照組和模型組給予同體積的0.9%氯化鈉溶液,給藥方式為灌胃,1次/d,喂養(yǎng)4周。

1.2.3 大鼠血清空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)檢測(cè)：治療結(jié)束后,禁食12 h,采取靜脈血4 ml,3 500 r/min速度離心10 min取上清,全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 血清MCP-1、oxLDL的測(cè)定：取50 μl血清于相應(yīng)反應(yīng)板中,按照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 RT-PCR法檢測(cè)主動(dòng)脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1mRNA表達(dá)：取4組鼠動(dòng)脈組織100 mg,剪碎,勻漿,使用Trizol試劑提取主動(dòng)脈壁總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。LOX-1、NF-κB p65和MCP-1 mRNA以β-actin為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt方法計(jì)算LOX-1、NF-κB p65和MCP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物：LOX-1：正向：5’-AAAAAGTCGGGAGAATTGCCTATC-3’;反向5’-CCGGGTTTTTGCTTCTGGTCTT-3’;NF-κB p65：正向：5’-AAGAGGACTGGGCCGGGATGAG-3’;反向：5’-GTTCCCACTTCAAGACCCACCT-3’;MCP-1：正向：5’-ATAGCAGCCACCTTCATTCC-3’;反向：5’-GCTTCTTTGGGACACTTGCT-3’;β-actin：正向：5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’;反向：5’-GTCCTCCTGCTTGCTGATCC-3’。

1.2.6 Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達(dá)：取4組大鼠主動(dòng)脈組織,加入組織裂解液和PMSF,并使用細(xì)胞破碎儀將細(xì)胞破碎,低溫裂解。離心后收集上清,測(cè)定蛋白濃度。另取適量蛋白變性,電泳進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)膜,用封閉液封閉待用。加入LOX-1、NF-κB p65和MCP-1(稀釋1∶2 000)一抗,4℃搖床過夜,洗膜,然后再分別加入相應(yīng)的二抗(稀釋1∶5 000)孵育2 h,ECL顯影,用Image-Pro Plus進(jìn)行定量分析。

1.2.7 染色觀察大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)：切取大鼠主動(dòng)脈(約1 cm),3%戊二醛固定,清洗,1%四氧化鋨二次固定,乙醇脫水,環(huán)氧樹脂浸透、包埋、切片(70 nm左右),醋酸鈾和檸檬酸鉛染色,于透射電鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠血清TG、FBG、TC、LDL、HDL的表達(dá) 與對(duì)照組比較,模型組FBG、TC、TG、LDL顯著性升高(P<0.05),HDL無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和梓醇組FBG、TC、TG、LDL顯著性降低(P<0.05),HDL比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠血清代謝指標(biāo)比較 n=10,

2.2 4組血清MCP-1、oxLDL比較 與對(duì)照組比較,模型組大鼠血清MCP-1和oxLDL顯著升高(P<0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和梓醇組MCP-1和oxLDL顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清MCP-1和oxLDL指標(biāo)比較 n=10,

2.3 4組大鼠主動(dòng)脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1 mRNA表達(dá)比較 與對(duì)照組比較,模型組大鼠主動(dòng)脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和梓醇組LOX-1、NF-κB p65、MCP-1 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠主動(dòng)脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1 mRNA表達(dá)比較 n=10,

2.4 Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較,模型組LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達(dá)量均顯著性升高(P<0.05);與模型組比較,二甲雙胍組和梓醇組LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達(dá)量均顯著性降低(P<0.05)。見圖1,表4。

圖1 4組大鼠主動(dòng)脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達(dá)

表4 Western blot檢測(cè)主動(dòng)脈壁LOX-1、NF-κB p65、MCP-1蛋白表達(dá) n=10,

2.5 4組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)圖 對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,胞漿、線粒體形態(tài)正常,細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則完好。模型組內(nèi)皮細(xì)胞顯著腫脹,連續(xù)性中斷、見空泡,部分內(nèi)皮細(xì)胞有顯著的脫落,細(xì)胞核褶皺變形,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度腫脹,嵴腫脹紊亂或溶解,見脂滴、糖原顆粒。二甲雙胍組和梓醇組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)輕微腫脹,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞核輕微變形,部分內(nèi)皮細(xì)胞有輕微脫落,損傷程度顯著輕于模型組。見圖2。

圖2 4組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變圖(HE×5 000)

3 討論

隨著人類社會(huì)經(jīng)濟(jì)物質(zhì)水平的不斷提高,高糖高脂食物的過量攝入,DM逐漸成為人類的一種慢性代謝性疾病。近年來,DM的患病率呈逐漸增加的趨勢(shì),其死亡率僅次于心血管疾病和癌癥,位居第三位[15]。T2DM是DM的主要分型,占DM比例的90%,其病理基礎(chǔ)為高血糖和脂代謝紊亂,均與血管內(nèi)皮功能障礙有關(guān),其主要是誘因氧化應(yīng)激導(dǎo)致。因此,抗氧化有望成為治療糖尿病血管病變的新方向[16]。本研究通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)和腹腔注射STZ復(fù)合因素建立T2DM大鼠模型,結(jié)果顯示,模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞顯著腫脹,連續(xù)性中斷、見空泡,部分內(nèi)皮細(xì)胞有顯著的脫落現(xiàn)象,細(xì)胞核褶皺變形,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中度腫脹,嵴腫脹紊亂或溶解,見脂滴、糖原顆粒,血液中FBG、TC、TG、HDL和LDL水平顯著升高,提示造模成功,糖尿病大鼠血管發(fā)生病變。

梓醇是一種環(huán)烯醚萜類物質(zhì),主要存在于地黃中,梓醇具有抗氧化、抗糖尿病、抗炎等作用[17]。有研究表明,梓醇可上調(diào)糖尿病小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽過氧化物酶(GSH)活性,下調(diào)丙二醛(MDA),減輕氧化損傷,增強(qiáng)糖尿病肝臟抗氧化能力[18]。還有研究表明,梓醇顯著降低DM大鼠血清中ROS和MDA,提高SOD活性,改善糖和脂肪的代謝紊亂,激活Nrf/HO-1抗氧化通路,減輕糖尿病并發(fā)癥大血管病變氧化損傷[19]。本研究結(jié)果表明梓醇可以降低FBG、TC、TG、LDL水平,發(fā)揮大血管病變的保護(hù)作用。顯微結(jié)構(gòu)結(jié)果也表明梓醇組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)輕微腫脹,線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞核輕微變形,部分內(nèi)皮細(xì)胞有輕微脫落,損傷程度顯著輕于模型組,也證明上述論斷。

胞內(nèi)氧化應(yīng)激主要是高血糖造成的病理損害誘導(dǎo)所致。oxLDL是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物,也是誘發(fā)血管內(nèi)皮功能紊亂的主要因子,其可降低血管舒張功能,誘導(dǎo)血栓形成和炎性反應(yīng)[20]。oxLDL主要通過與蛋白受體LOX-1結(jié)合發(fā)揮作用,還可以激活NF-κB,在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1表達(dá)。有研究表明LOX-1在高糖高脂飼料喂養(yǎng)的AS兔中過表達(dá)并在血管內(nèi)皮功能障礙中發(fā)揮重要作用[21]。Zhu等[22]研究表明梓醇可以降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血糖、TC、TG、MDA含量,提高SOD、CAT和GSH-Px活性。本研究結(jié)果也表明,模型組大鼠LOX-1、NF-κB p65和MCP-1 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平,MCP-1和oxLDL顯著升高,表明T2DM大鼠大血管病變與oxLDL/LOX-1和NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。梓醇治療后,LOX-1、NF-κB p65和MCP-1 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)水平,MCP-1和oxLDL顯著性降低,表明梓醇可通過抑制oxLDL/LOX-1和NF-κB信號(hào)通路,對(duì)大鼠大血管進(jìn)行保護(hù)。

綜上所述,梓醇可以減輕糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激,其作用機(jī)制可能與抑制oxLDL/LDL和NF-κB信號(hào)通路有關(guān),其具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。