尹江 唐平 張慧 楊森

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是一種常見的頭頸部癌癥[1,2]。OSCC是由口腔上皮潛在惡性疾病異常增生發(fā)展成的,近年來其發(fā)病率呈上升趨勢[3]。OSCC患者雖然通過手術、化療等方法得到一定的治療,但是其復發(fā)率高,致使確診后五年內的生存率很低[4,5]。了解OSCC的發(fā)病機制,尋找新的相關生物標志物,確定新的治療靶點至關重要。環(huán)狀RNA(circular RNAs,circRNAs)是一類共價封閉環(huán)狀RNA分子,由于不受RNA外切酶的影響,而比線性RNA更穩(wěn)定[6]。越來越多的研究證實circRNAs與包括癌癥在內的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。circRNAs已經成為OSCC藥物干預的新靶點[7,8]。circPARD3為circRNA之一,研究顯示,circPARD3通過海綿miR-5194,增加ENO1的表達,促進OSCC增殖與遷移[9]。但circPARD3在OSCC的作用機制有待進一步研究。有研究顯示miR-326在OSCC發(fā)揮抑癌作用,上調miR-326的表達顯著抑制OSCC增殖與遷移[10]。而CXCL3在OSCC中高表達,抑制CXCL3表達,可顯著抑制癌細胞增長[11]。經生物學分析顯示,miR-326與circPARD3、CXCL3有結合位點。推測circPARD3可能通過調節(jié)miR-326/CXCL3軸影響OSCC的發(fā)生發(fā)展。本研究探索circPARD3對OSCC細胞遷移、侵襲、上皮質轉化及miR-326/CXCL3軸的影響及其機制,為OSCC的靶向治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人正?？谇患毎?NHOK)和人口腔鱗狀細胞癌(CAL-27)購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。si-NC、si-circPARD3、anti-NC、anti-miR-326的序列由廣州市銳博生物科技有限公司設計合成,circPARD3、miR-326、CXCL3、U6、GADPH引物由上海吉瑪基因股份有限公司設計合成。Trizol試劑盒(15596-018)、RIPA裂解液(R0010)、SYBR Green PCR Master Mix(SR1120)購于北京Solarbio公司。Transwell小室(3422)購于美國Corning Costar。雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(YT273)、Lipofectamine 3000(QN2876)購于百奧萊博科技有限公司。E-cadherin(AF0138)和N-cadherin(AF0243)、Vimentin(AF0318)購于上海碧云天公司;GAPDH單抗(5174)多抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 標本來源：經本院倫理委員會批準,采集40例OSCC患者癌組織和癌旁組織(距離腫瘤5 cm),患者術前均未接受放療或化療,組織在液氮中迅速冷凍,并保持在-80℃。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與處理：將人正常口腔細胞(NHOK)和人口腔鱗狀細胞癌(CAL-27)培養(yǎng)在DMEM(10% FBS)培養(yǎng)基中,放置在培養(yǎng)箱(5% CO2、37℃、濕度飽和)中培養(yǎng)48 h,提取RNA,檢測circPARD3和miR-326的表達水平。

1.2.3 分組：將上述培養(yǎng)的細胞進行分組,分別為Control組、si-NC組、si-circPARD3組、si-circPARD3+anti-NC組、si-circPARD3+anti-miR-326組,然后按照Lipofectamine 3000制造商的方案轉染相對應的質粒48 h,然后進行后續(xù)實驗。

1.2.4 qRT-PCR檢測circPARD3、miR-326、CXCL3表達水平：將上述各組細胞使用TRIzol試劑提取RNA,逆轉錄、擴增。GAPDH、U6為內參,計算circPARD3、miR-326、CXCL3相對表達量。circPARD3上游引物5’-3’：CACCUGUAGACAGGUAAAUAC,下游引物5’-3’：GUAUUUACCUGUCUACAGGUG;miR-326上游引物5’-3’：CTCTGGGCCCTTCCTC,下游引物5’-3’：GAACATGTCTGCGTATCT C;CXCL3上游引物5’-3’：TTCACCTCAAGAACATCCAAAGTG,下游引物5’-3’：TTCTTCCC ATTCTTGAGTGTGGC;GAPDH上游引物5’-3’：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG,下游引物5’-3’：ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA;U6上游引物5’-3’：CTCGCTTCGGCAGCACAT,下游引物5’-3’：TTTGCGTGTCATCCTTGCG。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測：使用Starbase和targetscan數(shù)據(jù)庫靶向預測,發(fā)現(xiàn)circPARD3、CXCL3與miR-326之間存在靶向結合位點。將野生型(WT)circPARD3/突變型(MUT)circPARD3或野生型(WT)CXCL3/突變型(MUT)CXCL3質粒克隆到pMIRREPORT載體中,然后分別與miR-NC、miR-326 mimics共同轉染CAL-27細胞中48 h,然后雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)評估相對熒光素酶活性。

1.2.6 平板克隆形成實驗：將轉染細胞接種于6孔板,每孔放置1 000個細胞。培養(yǎng)14～18 d,然后用10%甲醛固定30 min,0.5%結晶紫染色30 min,最后對細胞菌落進行拍照計數(shù)。

1.2.7 劃痕實驗：將轉染后的各組CAL-27細胞長滿培養(yǎng)皿后,用200 μl槍頭垂直劃痕,拍照記錄劃痕情況,繼續(xù)在培養(yǎng)基(胎牛血清)培養(yǎng)24 h,拍照記錄各組細胞愈合情況,分析計算遷移率。

1.2.8 Transwell侵襲實驗：使用無血清培養(yǎng)基調整轉染后的各組CAL-27的細胞濃度為5×106個/ml。Transwell上室添加Matrigel凝膠,200 μl細胞懸液,下室添加500 μl培養(yǎng)基(10%胎牛血清),37℃ 5% CO2環(huán)境下孵育24 h。取出小室,10%甲醛固定10 min,0.5%結晶紫室溫下染色20 min,然后使用光學顯微鏡觀察,并隨機抽取6個視野拍照計數(shù)。

1.2.9 蛋白免疫印跡分析實驗：各組CAL-27細胞使用RIPA裂解液低溫裂解分別獲得總蛋白,檢測蛋白濃度。然后使用SDS-PAGE電泳分離裂解、轉PVDF膜、5%脫脂奶粉封閉,隨后加入一抗E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)和GADPH(1∶1 000),4℃環(huán)境下孵化過夜,繼續(xù)添加相應的二抗(1∶5 000),室溫孵育,2 h后加入ECL,暗室曝光顯影,并通過Image J軟件評估條帶灰度值。

1.2.10 裸鼠移植瘤：4周齡BALB/c裸鼠由中國科學院上海藥物研究所提供[生產許可SCXK(滬)2020-0005]。先適應性飼養(yǎng)1周,將小鼠分成2組,每組10只,皮下注射100 μl攜帶si-NC或si-circPARD3感染的CAL-27細胞2×107個/ml,每3天觀察移植瘤的生長。3周后結束觀察并處死大鼠分離腫瘤,測量腫瘤質量與體積,檢測移植瘤組織中circPARD3、miR-326、CXCL3表達情況。

2 結果

2.1 circPARD3和miR-326在OSCC組織和細胞中的表達 與癌旁組織比較,癌組織中circPARD3表達顯著升高,miR-326表達顯著降低(P<0.05)。與人正?？谇患毎鸑HOK比較,CAL-27細胞中circPARD3表達顯著升高,miR-326表達顯著降低(P<0.05)。見表1、2。

表1 circPARD3和miR-326在各組織中的表達比較

表2 circPARD3和miR-326在各細胞中的表達比較

2.2 circPARD3、CXCL3與miR-326靶向關系驗證 生物信息學分析顯示,circPARD3與miR-326及CXCL3與miR-326有靶向結合位點。與circPARD3-WT+miR-NC組比較,circPARD3-WT+miR-326 mimics組CAL-27細胞中相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05);與CXCL3-WT+miR-NC組比較,CXCL3-WT+miR-326 mimics組CAL-27細胞中相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與miR-NC組比較,miR-326 mimics組CAL-27細胞中miR-326表達上調,CXCL3表達下調(P<0.05)。見圖1、2,表3～5。

圖1 2組細胞CXCL3蛋白表達

圖2 circPARD3與miR-326及CXCL3與miR-326有靶向結合位點預測

表3 雙熒光素酶檢測circPARD3與miR-326靶向關系

表4 雙熒光素酶檢測CXCL3與miR-326靶向關系

表5 2組細胞miR-326、CXCL3蛋白表達 n=6,

2.3 5組細胞circPARD3、miR-326 和CXCL3表達水平情況 與si-NC組比較,si-circPARD3組circPARD3、CXCL3表達明顯下降,miR-326表達明顯上升(P<0.05);與si-circPARD3+anti-NC組比較,si-circPARD3+anti-miR-326組miR-326表達明顯下降,CXCL3表達明顯上升(P<0.05)。見圖3,表6。

圖3 Western blot檢測5組細胞CXCL3蛋白表達;A Control組;B si-NC組;C si-circPARD3組;D si-circPARD3+anti-NC組;E si-circPARD3+anti-miR-326組

表6 5組細胞circPARD3、miR-326和CXCL3表達水平 n=6,

2.4 circPARD3靶向調控miR-326對細胞集落形成影響 與si-NC組比較,si-circPARD3組細胞集落形成數(shù)量明顯減少(P<0.05);與si-circPARD3+anti-NC組比較,si-circPARD3+anti-miR-326組細胞集落形成數(shù)量明顯增加(P<0.05)。見圖4,表7。

圖4 5組細胞集落形成

表7 5組細胞集落形成數(shù)比較 n=6,

2.5 circPARD3靶向調控miR-326對細胞遷移的影響 與si-NC組比較,si-circPARD3組細胞劃痕愈合率明顯減少(P<0.05);與si-circPARD3+anti-NC組比較,si-circPARD3+anti-miR-326組組細劃痕愈合率明顯增加(P<0.05)。見表8,圖5。

圖5 5組細胞遷移(結晶紫染色×200)

表8 5組細胞劃痕愈合率比較 n=6,

2.6 circPARD3靶向調控miR-326對細胞侵襲的影響 與si-NC組比較,si-circPARD3組細胞侵襲數(shù)量明顯減少(P<0.05);與si-circPARD3+anti-NC組比較,si-circPARD3+anti-miR-326組細胞侵襲數(shù)量明顯增加(P<0.05)。見圖6,表9。

圖6 5組細胞侵襲(結晶紫染色×200)

表9 5組細胞侵襲數(shù)量比較 n=6,

2.7 circPARD3靶向調控miR-326對細胞EMT相關蛋白表達的影響 與si-NC組比較,si-circPARD3組N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平下降,E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05);與si-circPARD3+anti-NC組比較,si-circPARD3+anti-miR-326組N-cadherin、Vimentin蛋白表達水平升高,E-cadherin蛋白表達下降(P<0.05)。見圖7,表10。

圖7 Western blot檢測各組細胞N-cadherin、Vimentin及E-cadherin蛋白表達;A Control組;B si-NC組;C si-circPARD3組;D si-circPARD3+anti-NC組;E si-circPARD3+anti-miR-326組

表10 5組細胞N-cadherin、Vimentin、E-cadherin蛋白表達比較 n=6,

2.8 circPARD3對裸鼠移植瘤生長的影響 與si-NC組比較,小鼠體內注射轉染si-circPARD3的細胞后,移植瘤體積生長緩慢。與si-NC組比較,si-circPARD3組移植瘤中circPARD3、CXCL3表達水平下降,miR-326表達水平升高(P<0.005)。免疫組化檢測結果顯示,si-circPARD3組移植瘤中,CXCL3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖8、9,表11。

圖8 裸鼠移植瘤生長情況;與si-NC組比較,*P<0.05

圖9 移植瘤組織中CXCL3蛋白表達(免疫組化×200)

表11 circPARD3對裸鼠移植瘤生長及circPARD3、miR-326、CXCL3蛋白表達的影響 n=6,

3 討論

circRNA的表達具有組織和細胞特異性,在各種生理病理過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用[12]。circRNA可以作為microRNA(miRNA)海綿,特異性地結合miRNA,從而緩解miRNA對下游靶基因的抑制作用,從而上調靶基因的表達水平[13]。有研究顯示,在OSCC細胞中,circPARD3表達上調,下調circPARD3的表達,增加ENO1的表達,從而促進OSCC增殖與遷移[9]。本文研究結果顯示在OSCC組織與細胞中,circPARD3表達上調,在CAL-27細胞中下調circPARD3的表達,可促進miR-326的表達,抑制OSCC細胞增殖遷移與侵襲,與之前的研究結果一致。另外有研究circPARD3在LSCC細胞中表達上調,circPARD3表達下調可以抑制LSCC細胞的增殖、遷移與侵襲[14]。CircPARD3在鼻咽癌細胞中表達上調,抑制circPARD3表達可以抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移與侵襲[15]。N-cadherin及Vimentin與細胞遷移和侵襲相關。E-cadherin蛋白表達上升,細胞遷移量顯著下降。本研究在CAL-27細胞中干擾circPARD3表達,結果顯示,N-cadherin、Vimentin表達水平顯著降低,E-cadherin表達水平顯著升高,OSCC細胞遷移及侵襲細胞量顯著下降,說明下調circPARD3可抑制OSCC細胞的遷移、侵襲及EMT。

miRNA的異常表達參與了多種人類癌癥的生理和病理過程,其中miR-326是參與各種生理和病理過程的最重要的miRNA之一,在多種腫瘤中充當抑癌因子。miRNA-326在肺腺癌中的表達異常低,miRNA-326過表達可以抑制肺腺癌細胞的增殖[16]。miR-326在OSCC中表達下調,上調miR-326的表達有助于抑制OSCC的增殖與遷移[17]。本研究通過生物學預測、雙熒光素酶檢測和熒光定量證明,circPARD3與miR-326存在結合位點。miR-326在OSCC中表達下調,抑制miR-326的表達可部分逆轉抑制circPARD3表達對OSCC的遷移與侵襲的抑制作用。揭示circPARD3可通過調控miR-326的表達調控OSCC的遷移與侵襲。

CXCL3是CXC趨化因子亞家族的一員,也被稱為生長調節(jié)癌基因,在血管生成、腫瘤發(fā)生、細胞侵襲和遷移中起著關鍵作用。目前已有多項研究證實CXCL3在子宮癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中高表達[18,19]。CXCL3在OSCC細胞中高表達,抑制CXCL3表達可以抑制OSCC細胞的增殖和遷移[20]。經生物信息學分析和雙熒光素酶檢測證明CXCL3與miR-326存在靶向關系,而且在CAL-27細胞中miR-326過表達可以顯著下調CXCL3表達。本研究結果顯示,在CAL-27細胞中circPARD3、CXCL3表達上調,miR-326表達下調,下調miR-326表達,CXCL3表達上調,說明circPARD3可抑制miR-326表達,上調CXCL3表達。

綜上所述,在OSCC細胞中下調circPARD3通過調節(jié)miR-326/CXCL3信號軸,抑制OSCC細胞遷移、侵襲及上皮間質轉化。然而,本研究還存在一些局限性,首先,本研究表明circPARD3靶向調控miR-326的表達,但并沒有確定其他的circPARD3相關的miRNA是否參與OSCC進展;本文只研究了miR-326的靶向蛋白CXCL3,并未研究miR-326的其他靶向蛋白對OSCC細胞的影響。因此,需要進一步研究circPARD3在OSCC細胞中的作用機制。