陳仕 黎慧娟 許若思 張彩英 陳露

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌,也是我國第二大最常見的惡性腫瘤[1,2]。肝癌細(xì)胞具有侵襲性與轉(zhuǎn)移性,這是造成肝癌發(fā)病率和死亡率不斷上升的主要原因[3],導(dǎo)致肝癌患者確診后的5年生存率很低[4]。近年來,通過手術(shù)、靶向治療和免疫治療肝癌的診斷和治療取得了一定的進(jìn)展,但肝癌的發(fā)生機(jī)制尚不明確,且肝癌對(duì)多種治療藥物產(chǎn)生耐藥性,所以尋找新的分子靶標(biāo)對(duì)肝癌治療具有重要的意義[5]。長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是一組>200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本,已被確定為許多生理和病理過程的關(guān)鍵決定因素,特別是在癌癥的惡性進(jìn)展中。lncRNA參與肝癌的發(fā)生發(fā)展并已經(jīng)成為肝癌藥物干預(yù)的新靶點(diǎn)。例如lncRNA NHG5在肝癌細(xì)胞中高表達(dá),抑制lncRNA NHG5的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖[6]。而lncRNA CBR3-AS1屬于lncRNA,有研究顯示lncRNA CBR3-AS1在膽管癌中高表達(dá),抑制lncRNA CBR3-AS1的表達(dá)可以抑制膽管癌細(xì)胞的增殖與侵襲[7]。研究顯示,miR-409-3p在肝癌組織中的表達(dá)降低,miR-409-3p過表達(dá)能夠減少肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[8]。核不均一核糖蛋白A2B1(hnRNPA2B1)在肝癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),下調(diào)hnRNPA2B1的表達(dá),促進(jìn)Hep G2細(xì)胞凋亡[9]。經(jīng)生物學(xué)分析顯示,miR-409-3p與lncRNA CBR3-AS1、hnRNPA2B1之間具有靶向結(jié)合位點(diǎn)。推測(cè)LncRNA CBR3-AS1可能通過調(diào)節(jié)miR-409-3p/hnRNPA2B1軸對(duì)肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。本研究探索LncRNA CBR3-AS1對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲及miR-409-3p/hnRNPA2B1軸的影響,為肝癌的靶向治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞(Hep G2)購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。si-NC、si-CBR3-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-409-3p、miR-NC、miR-409-3p mimics、pcDNA、hnRNPA2B1的序列及LncRNA CBR3-AS1、miR-409-3p、hnRNPA2B1、U6、GADPH引物均由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。SYBR Green PCR Master Mix(SR1120)、Trizol試劑盒(15596-018)、RIPA裂解液(R0010)購于北京Solarbio;雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(YT273)、Lipofectamine 3000(QN2876)購于百奧萊博科技有限公司。Annexin V-FITHCA/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(SB-F6012)購于上海Share-Bio;Transwell小室(3422)購于美國Corning Costar。GAPDH單抗(5174)、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2(3498)、P21(2947)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)(41162)一抗購于美國Cell Signaling Technology公司。細(xì)胞核增殖抗原標(biāo)記物Ki67(sc-23900)抗體購于圣克魯斯生物技術(shù);MMP-2(AF0234)、MMP-9(AF5234)抗體購于上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本來源：經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),采集30對(duì)肝癌患者癌組織及距離腫瘤5 cm的癌旁組織,儲(chǔ)存于液氮中。上述組織已獲得每位患者的知情同意,且患者術(shù)前均未接受過放射療法或化學(xué)療法。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理：Hep G2細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基(10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素)在5% CO2、37℃、濕度飽和培養(yǎng)箱培養(yǎng),待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后收集細(xì)胞。將si-NC、si-CBR3-AS1、si-CBR3-AS1+anti-miR-NC、si-CBR3-AS1+anti-miR-409-3p、miR-NC、miR-409-3p mimics、miR-409-3p mimics+pcDNA、miR-409-3p mimics+hnRNPA2B1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞中,分別記為si-NC組、si-CBR3-AS1組、si-CBR3-AS1+anti-miR-NC組、si-CBR3-AS1+anti-miR-409-3p組、miR-NC組、miR-409-3p mimics組、miR-409-3p mimics+pcDNA組、miR-409-3p mimics+hnRNPA2B1組。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)LncRNA CBR3-AS1、miR-409-3p、hnRNPA2B1表達(dá)水平：提取各組細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,PCR擴(kuò)增。GAPDH、U6為內(nèi)參,相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。LncRNA CBR3-AS1上游引物5’-3’：CAGTGGGGAACTCTGACTCG,下游引物5’-3’：GTGCCTGGTGCTCTCTTACC;miR-409-3p上游引物5’-3’：CGGAATGTTGC TCGGTGA,下游引物5’-3’：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT;GAPDH上游引物5’-3’：GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG,下游引物5’-3’：ACCACCCTGTT GCTGTAGCCAA;U6上游引物5’-3’：CTCGCTTCGGCAGCACAT,下游引物5’-3’：TTTGC GTGTCATCCTTGCG。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)：Starbase預(yù)測(cè)LncRNA CBR3-AS1、hnRNPA2B1與miR-409-3p之間有靶向結(jié)合位點(diǎn)。將LncRNA CBR3-AS1和hnRNPA2B1的野生型(WT)和突變型(MUT)熒光素酶表達(dá)載體分別與miR-NC和miR-409-3p mimics共同轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞,37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.2.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)14～18 d,固定染色后對(duì)細(xì)胞菌落進(jìn)行拍照計(jì)數(shù)。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：轉(zhuǎn)染后Hep G2細(xì)胞用結(jié)合緩沖液重懸,參照Annexin V-FITHCA/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說明書操作,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)：取長滿培養(yǎng)皿的轉(zhuǎn)染后各組Hep G2細(xì)胞,用200 μL槍頭垂直劃痕,拍照記錄劃痕情況,在含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)1 d,拍照記錄各組細(xì)胞愈合情況,分析計(jì)算劃痕愈合率。

1.2.8 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell上室鋪上基質(zhì)膠后,添加200 μL細(xì)胞懸液,下室添加500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基,37℃孵育24 h。取出小室固定染色,光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)抽取6個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)。

1.2.9 蛋白免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)：在轉(zhuǎn)染后的各組Hep G2細(xì)胞懸液中加入RIPA裂解液,10% SDS-PAGE電泳分離蛋白,結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,然后用50 g/L 脫脂奶粉封閉,1 h后加入一抗,4 ℃下孵育24 h,洗膜后加入二抗,室溫2 h,滴加ECL,暗室曝光顯影,應(yīng)用Quantityone軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.2.10 裸鼠移植瘤：20只4周齡BALB/c裸鼠由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供[生產(chǎn)許可SCXK：(滬)2020-0005],適應(yīng)飼養(yǎng)一段時(shí)間,將小鼠平均分成2組分別注射si-NC或si-CBR3-AS1感染的Hep G2細(xì)胞,每5天觀察1次移植瘤的生長。30 d后結(jié)束觀察并處死大鼠分離腫瘤,測(cè)量腫瘤質(zhì)量與體積,檢測(cè)移植瘤組織中LncRNA CBR3-AS1、miR-409-3p、hnRNPA2B1的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA CBR3-AS1、miR-409-3p在癌旁組織和肝癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較,癌組織中LncRNA CBR3-AS1表達(dá)顯著升高,miR-409-3p表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 LncRNA CBR3-AS1和miR-409-3p在癌旁組織和肝癌組織中的表達(dá)比較 n=30,

2.2 LncRNA CBR3-AS1靶向調(diào)控miR-409-3p表達(dá) StarBase預(yù)測(cè)顯示LncRNA CBR3-AS1與miR-409-3p有靶向結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示,miR-409-3p mimics與LncRNA CBR3-AS1-WT共轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與si-NC組比較,si-CBR3-AS1組LncRNA CBR3-AS1表達(dá)明顯下降,miR-409-3p表達(dá)明顯上升(P<0.05);與si-CBR3-AS1+anti-miR-NC組比較,si-CBR3-AS1+anti-miR-409-3p組miR-409-3p表達(dá)明顯下降(P<0.05)。見圖1,表2、3。

圖1 LncRNA CBR3-AS1與miR-409-3p結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

表2 雙熒光素酶檢測(cè)LncRNA CBR3-AS1與miR-409-3p靶向關(guān)系 n=6,

表3 4組細(xì)胞LncRNA CBR3-AS1、miR-409-3p表達(dá)水平 n=6,

2.3 LncRNA CBR3-AS1靶向miR-409-3p對(duì)HCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)影響 與si-NC組比較,si-CBR3-AS1組Hep G2細(xì)胞集落形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞凋亡率及P21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與si-CBR3-AS1+anti-miR-NC組比較,si-CBR3-AS1+anti-miR-409-3p組Hep G2細(xì)胞集落形成數(shù)、劃痕愈合率、侵襲數(shù)量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞凋亡率及P21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4 4組細(xì)胞集落形成、凋亡、劃痕愈合率、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)比較 n=6,

2.4 miR-409-3p靶向調(diào)控hnRNPA2B1表達(dá) 生物信息學(xué)分析顯示miR-409-3p與hnRNPA2B1有靶向結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示,miR-409-3p mimics與hnRNPA2B1-WT共轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與miR-NC組比較,miR-409-3p mimics組miR-409-3p表達(dá)明顯上升,hnRNPA2B1表達(dá)明顯下降(P<0.05);與miR-409-3p mimics+pcDNA組比較,miR-409-3p mimics+hnRNPA2B1組hnRNPA2B1表達(dá)明顯上升(P<0.05)。見圖2,表5、6。

圖2 miR-409-3p與hnRNPA2B1結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

表5 雙熒光素酶檢測(cè)miR-409-3p與hnRNPA2B1靶向關(guān)系 n=6,

表6 4組細(xì)胞miR-409-3p和hnRNPA2B1表達(dá)水平 n=6,

2.5 miR-409-3p靶向hnRNPA2B1對(duì)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)影響 與miR-NC組比較,miR-409-3pmimics組細(xì)胞集落形成、劃痕愈合率、侵襲數(shù)量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞凋亡率及P21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與miR-409-3p mimics+pcDNA組比較,miR-409-3p mimics+hnRNPA2B1組細(xì)胞集落形成、劃痕愈合率、侵襲數(shù)量及Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞凋亡率及P21、Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表7。

表7 4組細(xì)胞集落形成、凋亡、劃痕愈合及相關(guān)蛋白表達(dá)比較 n=6,

2.6 LncRNA CBR3-AS1對(duì)裸鼠移植瘤生長的影響 與si-NC組比較,小鼠注射轉(zhuǎn)染si-CBR3-AS1的細(xì)胞后,移植瘤體積生長緩慢。與si-NC組比較,si-CBR3-AS1組移植瘤中LncRNA CBR3-AS1表達(dá)水平下降,miR-409-3p表達(dá)水平升高(P<0.005)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示,si-CBR3-AS1組移植瘤中,hnRNPA2B1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.005)。見圖3,表8。

圖3 免疫組化檢測(cè)移植瘤組織中hnRNPA2B1蛋白表達(dá)(×400)

表8 LncRNA CBR3-AS1對(duì)裸鼠移植瘤生長及LncRNA CBR3-AS1、miR-409-3p、hnRNPA2B1蛋白表達(dá)的影響 n=10,

3 討論

越來越多的研究表明,長鏈非編碼RNA(lncRNAs)在許多人類癌癥中起著重要的調(diào)節(jié)作用。最近發(fā)現(xiàn)CBR3-AS1是與癌癥相關(guān)的lncRNA。目前l(fā)ncRNA CBR3-AS1在肝癌中的作用機(jī)制尚未研究,但在其他癌癥的發(fā)展進(jìn)程中已經(jīng)有研究。在胃癌細(xì)胞中,lncRNA CBR3-AS1表達(dá)上調(diào),抑制lncRNA CBR3-AS1的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[10]。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中,敲低lncRNA CBR3-AS1可顯著抑制CRC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,促進(jìn)CRC細(xì)胞的凋亡[11]。在骨肉瘤細(xì)胞中,lncRNA CBR3-AS1表達(dá)上調(diào),抑制lncRNA CBR3-AS1的表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖[12]。本文研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CBR3-AS1在肝癌組織中表達(dá)上調(diào),下調(diào)lncRNA CBR3-AS1的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲,促進(jìn)凋亡,與lncRNA CBR3-AS1在其他癌組織中的研究結(jié)果一致。本研究在Hep G2細(xì)胞中干擾lncRNA CBR3-AS1的表達(dá),miR-409-3p表達(dá)上調(diào),肝癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲細(xì)胞量顯著下降,細(xì)胞凋亡率顯著升高,且Ki67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低,P21、Bax表達(dá)水平顯著升高。Ki67是DNA合成相關(guān)酶,其表達(dá)水平的高低可以用以判斷細(xì)胞增殖活性,而P21可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期,抑制肝癌細(xì)胞增殖[13,14]。Bcl-2是抗凋亡蛋白可抑制細(xì)胞凋亡,而Bax屬于促凋亡蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MMP-2、MMP-9均屬于MMP家族,參與肝癌細(xì)胞遷移和侵襲[15]。說明下調(diào)lncRNA CBR3-AS1可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。

MicroRNAs(miRNAs)在多種人類癌癥的生理和病理過程發(fā)揮重要作用。有研究顯示,miR-409-3p在肝癌組織中的表達(dá)降低,上調(diào)miR-409-3p表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[16]。本文研究發(fā)現(xiàn)miR-409-3p在肝癌組織中表達(dá)下調(diào),上調(diào)miR-409-3p表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲,與之前的研究結(jié)果一致。另外研究發(fā)現(xiàn)miR-409-3p還在結(jié)直腸癌癌、胃癌等多種癌癥中充當(dāng)抑癌因子[17-19]。越來越多的文章表明,位于細(xì)胞質(zhì)中的lncrna總是以序列特異性的方式與mirna競爭,發(fā)揮著分子海綿的作用。有研究顯示,lncRNA CBR3-AS1通過調(diào)節(jié)miR-409-3p表達(dá)調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的生長[20]。本研究通過生物學(xué)預(yù)測(cè)、雙熒光素酶檢測(cè)和熒光定量證明,lncRNA CBR3-AS1與miR-409-3p之間存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-409-3p在肝癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),抑制miR-409-3p的表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)抑制lncRNA CBR3-AS1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用。揭示lncRNA CBR3-AS1可通過調(diào)控miR-409-3p的表達(dá)調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。

hnRNPA2B1是一種RNA結(jié)合蛋白,參與異質(zhì)核RNA加工成成熟mRNA、RNA剪接、基因表達(dá)、蛋白翻譯調(diào)控等多種生物學(xué)過程。有研究表明,hnRNPA2B1在肝癌細(xì)胞中高表達(dá),抑制hnRNPA2B1的表達(dá),可抑制肝癌細(xì)胞增殖與遷移[21,22]。本研究通過生物學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶檢測(cè)證明,miR-409-3p與hnRNPA2B1之間存在結(jié)合位點(diǎn),在Hep G2細(xì)胞中miR-409-3p過表達(dá)可顯著下調(diào)hnRNPA2B1的表達(dá),hnRNPA2B1過表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)中miR-409-3p過表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的抑制作用。本研究還顯示,在Hep G2細(xì)胞中,下調(diào)lncRNA CBR3-AS1表達(dá)可顯著上調(diào)miR-409-3p的表達(dá),上調(diào)miR-409-3p的表達(dá)可顯著下調(diào)hnRNPA2B1的表達(dá),說明下調(diào)lncRNA CBR3-AS1表達(dá)可促進(jìn)miR-409-3p的表達(dá),進(jìn)而抑制hnRNPA2B1的表達(dá)。

綜上所述,在肝癌細(xì)胞中,下調(diào)lncRNA CBR3-AS1通過調(diào)節(jié)miR-409-3p/hnRNPA2B1軸抑制肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。本研究還存在一定的局限性,lncRNA CBR3-AS1是否可以通過調(diào)節(jié)其他的miRNA來參與肝癌的惡性進(jìn)展,miR-409-3p的其他靶向蛋白是否也參與肝癌細(xì)胞的進(jìn)展過程。因此,需要進(jìn)一步研究lncRNA CBR3-AS1在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。