摘要：發(fā)酵過程的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件是影響黑曲霉產(chǎn)淀粉酶產(chǎn)量的關(guān)鍵。為提高黑曲霉F223 的產(chǎn)酶水平，首先通過單因素實(shí)驗(yàn)及Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)篩選出了顯著影響淀粉酶酶活的成分：豆粕、玉米漿及可溶性淀粉。通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以及中心組合實(shí)驗(yàn)獲取回歸建模數(shù)據(jù)集，以淀粉酶酶活為響應(yīng)變量，分別利用傳統(tǒng)的多項(xiàng)式回歸以及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)回歸擬合方法，建立了培養(yǎng)基組成與酶活之間的回歸模型，得到了黑曲霉F223 生產(chǎn)淀粉酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的最優(yōu)解。結(jié)果表明，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法在數(shù)據(jù)擬合和預(yù)測(cè)能力方面優(yōu)于多項(xiàng)式回歸方法，用該算法為基礎(chǔ)優(yōu)化得到的培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，最終淀粉酶產(chǎn)量達(dá)到5 566.79 U/mL，相比于未優(yōu)化培養(yǎng)方案提升了92.6%。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；淀粉酶；響應(yīng)面方法；機(jī)器學(xué)習(xí)；人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)

中圖分類號(hào)：Q815 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

α-淀粉酶是一種重要的酶制劑，現(xiàn)已在食品加工、飼料、造紙及紡織等工業(yè)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，具有巨大的商業(yè)價(jià)值和市場(chǎng)需求[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，α-淀粉酶作為工業(yè)用酶，其產(chǎn)值于2020 年已達(dá)到7.5×109 USD，應(yīng)用前景良好[2]。目前α-淀粉酶主要的生產(chǎn)商有羅氏（瑞士）、諾維信（丹麥）、杜邦（美國(guó)）等公司。

工業(yè)用α-淀粉酶根據(jù)其來(lái)源可以分為兩類：細(xì)菌α-淀粉酶和真菌α-淀粉酶，二者具有不同的酶學(xué)特點(diǎn)[3]，其中真菌來(lái)源的淀粉酶具有直接水解生淀粉的能力，并且在糖化工藝的應(yīng)用中，真菌來(lái)源的α-淀粉酶可以代替β-淀粉酶作為糖化劑，用于生產(chǎn)高麥芽糖漿，成為高麥芽糖漿生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵酶制劑。黑曲霉是優(yōu)良的酶蛋白表達(dá)宿主[4]，其酶蛋白產(chǎn)物分泌到胞外，易于提取、發(fā)酵培養(yǎng)基成本低、對(duì)于pH 和溫度的穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。目前真菌α-淀粉酶的生產(chǎn)主要采用霉菌固態(tài)發(fā)酵的方式，存在發(fā)酵效率低、過程調(diào)控難等問題，如Premalatha 等[5] 以溜曲霉作為生產(chǎn)宿主，通過固態(tài)發(fā)酵進(jìn)行α-淀粉酶生產(chǎn)，產(chǎn)量最高達(dá)到519.40 u/g；Mahmood 等[6] 通過黑曲霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶，通過培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基優(yōu)化，產(chǎn)量達(dá)到1 298.12 u/g。少數(shù)液態(tài)發(fā)酵多采用未經(jīng)改造的原始霉菌菌株，發(fā)酵最終酶活較低，低于2 000 U/mL[7-8]。本研究所用菌株為經(jīng)代謝工程改造的黑曲霉F223 菌株，該菌株通過CRISPR/Cas技術(shù)在基因組上定點(diǎn)敲除了糖化酶基因，并整合來(lái)源于米曲霉的α-淀粉酶基因表達(dá)盒AmyA，可高效表達(dá)米曲霉α-淀粉酶。

微生物發(fā)酵過程中可變因素與產(chǎn)量之間的關(guān)系是復(fù)雜非線性的，若僅通過單因素或正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，則需要花費(fèi)較大的時(shí)間成本，此時(shí)生物過程的建模與優(yōu)化對(duì)于高效經(jīng)濟(jì)地開發(fā)生物發(fā)酵工藝非常重要[9-10]。相比于傳統(tǒng)的建模方法，通過機(jī)器學(xué)習(xí)方法進(jìn)行回歸建模提供了一種獨(dú)立于傳統(tǒng)模型的靈活處理方法[11]。機(jī)器學(xué)習(xí)算法可分為有監(jiān)督算法和無(wú)監(jiān)督算法兩類[12]，其中有監(jiān)督算法主要用于挖掘特征值與目標(biāo)值之間的相關(guān)性，以實(shí)現(xiàn)基于特征值輸入來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)應(yīng)的目標(biāo)值。有監(jiān)督學(xué)習(xí)算法在發(fā)酵工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，包括培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵建模過程、控制優(yōu)化以及發(fā)酵分批補(bǔ)料等，已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一[13-14]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artificial NeuralNetwork，ANN）是一種常用的有監(jiān)督學(xué)習(xí)算法，其將輸入數(shù)據(jù)集所得到的響應(yīng)與目標(biāo)值進(jìn)行比較，修改內(nèi)部權(quán)值來(lái)校正偏離的響應(yīng)，并通過迭代訓(xùn)練過程模擬變量之間的非線性變化，以此分析復(fù)雜系統(tǒng)中存在的非線性關(guān)系。

因此，本研究基于ANN 算法搭建了新的黑曲霉產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)方案優(yōu)化流程，由初始培養(yǎng)基出發(fā)，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察不同組分及條件對(duì)于產(chǎn)酶的影響，由Plackett-Burman（PB）實(shí)驗(yàn)和最陡爬坡實(shí)驗(yàn)初步確定對(duì)于淀粉酶生產(chǎn)影響顯著的因素及對(duì)應(yīng)濃度范圍，最后基于中心組合實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)集，利用多項(xiàng)式回歸建模結(jié)合最小二乘回歸算法尋優(yōu)和ANN 回歸建模結(jié)合遺傳算法尋優(yōu)，解析培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件與產(chǎn)量之間的非線性關(guān)系，優(yōu)化影響淀粉酶產(chǎn)量關(guān)鍵因素的水平，以期確定最優(yōu)的黑曲霉培養(yǎng)方案，為后續(xù)黑曲霉產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

黑曲霉（Aspergillus niger） F223 由中國(guó)農(nóng)科院提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖、木糖、麥芽糖、果糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；麥芽糊精、玉米糊精：分析純，上海源葉生物科技有限公司；酵母粉：分析純，安琪酵母股份有限公司；培養(yǎng)基用金屬離子鹽、無(wú)機(jī)鹽：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；可溶性淀粉：分析純，凌峰化學(xué)試劑有限公司；玉米漿：分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司；豆粕：分析純，北京索萊寶科技有限公司； 3、5-二硝基水楊酸（DNS） 試劑： Codow氪道-廣州和為醫(yī)藥科技有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）：碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1） PDA（Potato Dextrose Agar）培養(yǎng)基（g/L） ：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂15；

（2）種子培養(yǎng)基及初始發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：豆粕30，玉米漿20，蔗糖50，硫酸鎂1。

1.2 測(cè)試與表征

pH 計(jì)（梅特勒-托利多公司），ZHWY-3212 型旋轉(zhuǎn)式搖床（上海智城公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司），AL204 型分析天平（梅特勒-托利多公司），PYXDHS-40*50 型培養(yǎng)箱（中國(guó)躍進(jìn)醫(yī)療器械公司） ，BHS-4 型水浴鍋（中國(guó)群安實(shí)驗(yàn)儀器公司），STY-1-ADK 型滲透壓儀（中國(guó)天大天發(fā)科技有限公司公司），GZX-9420MBE 型鼓風(fēng)烘箱（華連醫(yī)療器械公司）

1.3 黑曲霉的活化與培養(yǎng)

將?20 ℃ 冰箱保藏的A.Niger F223 甘油管解凍，無(wú)菌接種環(huán)蘸取后劃線于PDA 平板，于30 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 得到單菌落，挑取單菌落并接種至液體種子培養(yǎng)基活化培養(yǎng)60 h，待鏡檢可見完整菌絲，并且離心菌絲體體積（PMV）達(dá)到40% 以上，即可接種至發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

微生物培養(yǎng)基主要成分有以下幾類：碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、金屬離子等；影響菌株生長(zhǎng)及生產(chǎn)的培養(yǎng)條件主要有：滲透壓、pH、接種量、接種種齡等。本研究通過單因素實(shí)驗(yàn)，在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，依次改變一種培養(yǎng)基組分，初步篩選發(fā)酵培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件[15]。

遲效氮源：豆粕（Soybean meal，SM）、大豆蛋白胨（Soy Peptone，SP）、胰蛋白胨（Tryptone，TRY），添加量均為30 g/L； 速效氮源： 玉米漿（Corn SteepLiquor， CSL） 、牛肉膏（Beef Extract， BE） 、酵母粉（Yeast Extract，YE），添加量均為20 g/L；10 種供試碳源（葡萄糖、木糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、麥芽糊精、玉米糊精）添加量均為50 g/L；5 種供試緩沖鹽（磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈣），添加量均為1 g/L；6 種供試金屬離子（鈣、鐵、鎂、鋅、鈷、鎳離子），添加量均為20 mmol/L。

1.5 PB 實(shí)驗(yàn)

研究使用Design expert 10.0.1 設(shè)計(jì)PB 實(shí)驗(yàn)，篩選由OFAT 實(shí)驗(yàn)中所獲得的8 種培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件，其中A、B、C、D、E、F、G、H 分別代表磷酸二氫鉀、豆粕、玉米漿、可溶性淀粉、滲透壓、接種量、氯化鈣、初始pH 8 個(gè)變量因素，所有因素都在高（+1）、低（?1）兩水平上進(jìn)行12 次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1 所示。

1.6 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)（Steepest Ascent Experiment，SAE）

在PB 實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的一階模型中，得到顯著影響因子的系數(shù)，以此計(jì)算最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的步長(zhǎng)[16]，在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)（表2）中所得到最高淀粉酶酶活所對(duì)應(yīng)的顯著變量水平，即作為后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化的中心點(diǎn)。

1.7 中心組合實(shí)驗(yàn)（Central Composite Design， CCD）

研究中使用Design expert 10.0.1 設(shè)計(jì)CCD 實(shí)驗(yàn)，如表3 所示，其中包括6 組失擬項(xiàng)測(cè)試的中心點(diǎn)和14 個(gè)非中心點(diǎn)，共20 次實(shí)驗(yàn)。20 組完全隨機(jī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.8 回歸擬合建模

（1）多項(xiàng)式回歸建模

將CCD 實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的參數(shù)以及在實(shí)驗(yàn)中得到的不同參數(shù)組合所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值，使用Design expert10.0.1 軟件進(jìn)行二項(xiàng)式回歸擬合[17]。

（2）人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模

本研究中使用MATLAB 2020a 中的DeepLearningToolbox 14.6 進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合，將CCD 實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果作為數(shù)據(jù)集進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練，訓(xùn)練過程中數(shù)據(jù)按70%、15%、15% 的比例分為訓(xùn)練集、驗(yàn)證集及測(cè)試集，其中輸入變量為顯著因素豆粕、玉米漿和可溶性淀粉的質(zhì)量濃度，響應(yīng)變量為淀粉酶酶活。

1.9 生化參數(shù)檢測(cè)方法

1.9.1 PMV測(cè)定

由于培養(yǎng)基中含有不溶性成分，本實(shí)驗(yàn)采用PMV 作為菌體生長(zhǎng)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[18]，發(fā)酵過程中定點(diǎn)取樣1 mL，12 000 r/min 離心5 min，將菌絲體與發(fā)酵上清分離，將沉淀菌絲體的體積除以取樣發(fā)酵液總體積來(lái)計(jì)算PMV。

1.9.2 酶活檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用二硝基水楊酸（DNS）法進(jìn)行淀粉酶酶活檢測(cè)[1]，每分鐘生成1 μmol還原糖需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（1U），單位體積酶活即為1 U/mL。于發(fā)酵終點(diǎn)取樣1 mL 進(jìn)行酶活力測(cè)定，離心后取上清，稀釋一定倍數(shù)后與1 mL的10 g/L可溶性淀粉溶液混勻，于50 ℃ 恒溫水浴鍋反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后加入2 mL DNS 試劑，沸水浴5 min 進(jìn)行顯色，顯色結(jié)束后冷卻至室溫，用超純水將反應(yīng)體系定容至25 mL，使用酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)下讀取吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。

1.9.3 蛋白濃度測(cè)定

研究中使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒對(duì)發(fā)酵體系中的蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.9.4 滲透壓測(cè)定

研究中使用冰點(diǎn)滲透測(cè)定壓儀對(duì)發(fā)酵體系的滲透壓進(jìn)行測(cè)定。

1.10 數(shù)據(jù)處理

本研究每個(gè)樣品分析設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，采用Graphpad Prism 8.2.4 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖表繪制；使用Design Expert 10.0.1 進(jìn)行PB 實(shí)驗(yàn)和CCD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和二項(xiàng)式回歸建模分析；使用MATLAB 2021a進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)回歸建模及遺傳算法求解。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基的初篩

2.1.1 不同培養(yǎng)條件及菌株活化方法對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖1 所示各組單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，當(dāng)滲透壓為2 060 kPa、初始pH 為7 時(shí)分別達(dá)到各組實(shí)驗(yàn)的最高產(chǎn)酶量。由圖1（a）可得，較高的滲透壓通過增加黑曲霉胞內(nèi)外的滲透壓差，從而促進(jìn)淀粉酶的胞外分泌，產(chǎn)量提高，但過高的滲透壓又會(huì)影響菌株生長(zhǎng)，故最適初始滲透壓應(yīng)設(shè)為2 060 kPa。pH 是發(fā)酵過程調(diào)控的關(guān)鍵參數(shù)之一[19]，由圖1（b）和（c）可得，黑曲霉F223 產(chǎn)淀粉酶過程較合適的pH 值為6.5～7.0、接種量為2% 時(shí)，可以較好地維持菌株生長(zhǎng)代謝，同時(shí)對(duì)于中性α-淀粉酶可以更好地發(fā)揮酶的催化活性。

2.1.2 不同碳氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

研究選擇了多種碳、氮源進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)分析，不同成分所對(duì)應(yīng)的發(fā)酵終點(diǎn)酶活如圖2 所示。

由圖2（a）可得，相比于對(duì)照碳源蔗糖，葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖、果糖、麥芽糊精、半乳糖、甘露糖和玉米糊精作為碳源時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)產(chǎn)量皆有不同程度的提高。其中葡萄糖、麥芽糖及果糖作為還原糖，通過提高菌體生長(zhǎng)代謝活力來(lái)促進(jìn)產(chǎn)物合成；可溶性淀粉、玉米糊精及麥芽糊精則對(duì)于淀粉酶蛋白表達(dá)有誘導(dǎo)作用[20]，通過提高淀粉酶的誘導(dǎo)表達(dá)效率提高產(chǎn)量。考慮到發(fā)酵成本及實(shí)際生產(chǎn)過程中經(jīng)濟(jì)效益，最終選擇了成本較低且誘導(dǎo)表達(dá)效果較好的可溶性淀粉作為碳源，其作為碳源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)酶活最高可達(dá)4 567 U/mL。

由圖2（b）、圖2（c）可得，豆粕和玉米漿分別作為最理想的遲效和速效氮源，且當(dāng)豆粕與玉米漿質(zhì)量比為3∶2 時(shí)，酶活可達(dá)3 524 U/mL（圖2（c））。結(jié)果表明，優(yōu)化后的氮源濃度配比對(duì)黑曲霉在發(fā)酵過程中的前期菌體生長(zhǎng)和后期的產(chǎn)物合成有直接影響[21]。

2.1.3 不同緩沖鹽及金屬離子對(duì)產(chǎn)酶的影響

本研究考察在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加緩沖鹽和金屬離子對(duì)發(fā)酵終點(diǎn)酶活產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。由圖可得，添加磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀作為緩沖鹽時(shí)酶活提高了約15%，表明磷酸鹽的添加除了pH 調(diào)節(jié)以外，還可能促進(jìn)參與輔酶、核酸等多種微生物生長(zhǎng)代謝關(guān)鍵元素的合成，以及改善培養(yǎng)環(huán)境的pH，優(yōu)化了菌株生長(zhǎng)[22]。此外，鈣離子的補(bǔ)充使得終點(diǎn)酶活提高了13%。已有文獻(xiàn)[23-24] 表明培養(yǎng)體系中的鈣離子可以改善細(xì)胞膜通透性，使發(fā)酵終點(diǎn)淀粉酶酶活有所提高。綜上，本研究選擇了磷酸二氫鉀以及鈣離子作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽及金屬離子成分。

2.2 PB 實(shí)驗(yàn)

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行PB 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以考察發(fā)酵條件中的8 個(gè)因素對(duì)于黑曲霉產(chǎn)淀粉酶的影響并篩選顯著影響因子，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析如表4 所示，其中*為Plt;0.05，**為Plt;0.01。PB 實(shí)驗(yàn)所得模型的P 值為0.024 9，小于0.05，表明該模型顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型的線性回歸方程為Y =2 767.29 + 142.91A + 342.68B + 364.92C + 273.60D ?254.93E + 85.37F + 28.01G + 141.38H。其中豆粕、玉米漿及可溶性淀粉的P 值分別為0.010 8、0.009 5、0.016 7，均小于0.05，表明三者對(duì)于黑曲霉產(chǎn)淀粉酶的發(fā)酵影響顯著，重要性順序?yàn)橛衩诐{gt;豆粕gt;可溶性淀粉。其中滲透壓雖然P 值同樣小于0.05，但在模型中表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，結(jié)果表明，高滲環(huán)境不適用于黑曲霉進(jìn)行淀粉酶蛋白的生產(chǎn)代謝，故選擇豆粕、玉米漿及可溶性淀粉3 個(gè)因素進(jìn)行后續(xù)最陡爬坡及優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5 所示，隨著3 個(gè)因素水平的逐漸增加，淀粉酶酶活呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，其中實(shí)驗(yàn)編號(hào)4 的淀粉酶酶活達(dá)到最高，因此以豆粕48.17 g/L、玉米漿40 g/L 以及可溶性淀粉52.5 g/L 作為后續(xù)CCD 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

2.4 多項(xiàng)式回歸擬合

以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)所確定的水平中心點(diǎn)，進(jìn)行中心組合實(shí)驗(yàn)并擬合響應(yīng)曲面，擬合結(jié)果如表6所示。經(jīng)Design Expert 10 軟件對(duì)CCD 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合得回歸方程為Y = 5 055.44+415.92A+292.44B+407.92C?210.04AB+42.01AC?306.28BC?637.56A2?621.89B2?671.58C2。由表6 的分析（ANOVA）結(jié)果所示，模型回歸系數(shù)R2 = 0.912 1，表示回歸模型的預(yù)測(cè)性能良好，P 值為0.000 3（P lt; 0.01），表明該模型顯著且擬合效果好。失擬項(xiàng)的P 值為0.067 4（P gt;0.05），表明所得回歸模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合時(shí)，非正常誤差占比小，由此表明所得模型可以較好地預(yù)測(cè)黑曲霉產(chǎn)淀粉酶的最優(yōu)培養(yǎng)方案。模型中A2、B2 及C2 所對(duì)應(yīng)的P 值均小于0.01，表明所對(duì)應(yīng)的因素對(duì)于響應(yīng)值的單獨(dú)影響極顯著，但各因素的交互作用對(duì)于響應(yīng)值影響不顯著。

二維等高線圖及三維響應(yīng)曲面圖（圖4）可以進(jìn)一步分析各因素之間的相互作用，以及因素水平變化對(duì)于淀粉酶酶活的影響。

由擬合的響應(yīng)曲面可得，隨著各培養(yǎng)基成分濃度的降低，培養(yǎng)過程中可利用的營(yíng)養(yǎng)成分減少，影響黑曲霉菌株的生長(zhǎng)及生產(chǎn)，淀粉酶酶活均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。淀粉酶酶活隨著培養(yǎng)基成分濃度的增加而提高，但進(jìn)一步增加則會(huì)影響淀粉酶產(chǎn)量。其中，不溶性成分豆粕，其濃度過高會(huì)影響液體發(fā)酵過程的溶氧含量，導(dǎo)致黑曲霉生長(zhǎng)受限，影響產(chǎn)酶?？扇苄缘矸蹪舛冗^高將導(dǎo)致前期碳源利用過度，耗糖產(chǎn)酸導(dǎo)致pH 快速降低。玉米漿作為復(fù)合氮源，其主要成分中含有較多有機(jī)酸[25]，分解代謝釋放乳酸會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境偏酸性，影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成。

通過二次多項(xiàng)擬合得到回歸方程后，以淀粉酶酶活作為響應(yīng)值，利用最小二乘回歸求解使響應(yīng)值最大的最優(yōu)解，結(jié)果表明：當(dāng)豆粕38 g/L、玉米漿31 g/L、可溶性淀粉49 g/L 時(shí)，模型預(yù)測(cè)該條件下淀粉酶酶活達(dá)到5 196.45 U/mL。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以上述配比的培養(yǎng)基進(jìn)行黑曲霉菌株的發(fā)酵生產(chǎn)，搖瓶發(fā)酵7 d 后淀粉酶酶活達(dá)到5 084.68 U/mL，略低于預(yù)測(cè)值，但對(duì)比初始培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)量（2 889.38 U/mL）提高了75%。

2.5 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)回歸擬合

采用二項(xiàng)式回歸擬合雖可以快速建立響應(yīng)面模型，所得模型具有易理解、所需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，但受限于模型訓(xùn)練算法和尋優(yōu)算法，二項(xiàng)式回歸模型無(wú)法在全局范圍內(nèi)尋優(yōu)，為了更好地?cái)M合培養(yǎng)基成分與產(chǎn)量之間的復(fù)雜非線性關(guān)系，本研究還采用了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法進(jìn)行回歸擬合。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合的過程中通過數(shù)據(jù)特征提取，與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的權(quán)重相互作用，神經(jīng)元對(duì)輸入變量組合進(jìn)行非線性變化后，使得神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具備針對(duì)多變量復(fù)雜關(guān)系的非線性表征能力，可以更好地?cái)M合非線性關(guān)系并在全局范圍內(nèi)尋優(yōu)[26-27]。

研究將CCD 實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)集用于ANN 模型的訓(xùn)練，使用 MATLAB?神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)工具箱改變輸入層中神經(jīng)元的數(shù)量，結(jié)果表明當(dāng)隱藏層節(jié)點(diǎn)數(shù)為8 時(shí)，產(chǎn)生了最佳的學(xué)習(xí)和泛化性能，表現(xiàn)為最低的均方誤差（MSE）和最高的 R2 值（圖5）。

以最優(yōu)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模型訓(xùn)練，綜合所有數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估并得到模型的總體回歸擬合效果。模型擬合結(jié)果、模型性能驗(yàn)證結(jié)果如圖6 所示。其中訓(xùn)練集、驗(yàn)證集、測(cè)試集以及總體數(shù)據(jù)的R2 分別達(dá)到0.992 1、0.999 8、0.989 9 及0.986 2，表明該模型可以準(zhǔn)確描述培養(yǎng)基成分與淀粉酶產(chǎn)量之間的非線性關(guān)系。

此外，圖7 展示了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練過程，通過多次迭代優(yōu)化模型性能，使模型預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際值之間的均方誤差逐步降低。由圖可得，經(jīng)3 次迭代訓(xùn)練后，模型在3 組數(shù)據(jù)集上的預(yù)測(cè)誤差均降至最低，表明模型的預(yù)測(cè)性能此時(shí)已至最佳狀態(tài)。

基于構(gòu)建好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，研究采用遺傳算法進(jìn)行尋優(yōu)，通過找到最佳的培養(yǎng)基成分配比使產(chǎn)量達(dá)到最高。將人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)所擬合的回歸方程作為遺傳算法尋優(yōu)的適應(yīng)度函數(shù)，經(jīng)遺傳算法求解后得到的最優(yōu)培養(yǎng)基條件為（g/L） ：豆粕36、玉米漿33、可溶性淀粉56。以該成分配比進(jìn)行黑曲霉菌株的培養(yǎng)及產(chǎn)物發(fā)酵，最終酶活達(dá)到5 566.79 U/mL，對(duì)比二次多項(xiàng)回歸模型所優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的終點(diǎn)酶活（5 084.68 U/mL）提高了9%，對(duì)比初始黑曲霉培養(yǎng)基的終點(diǎn)酶活（2 889.38 U/mL）提高了92.6%。

由回歸擬合結(jié)果來(lái)看，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法擬合所得模型總體回歸系數(shù)R2 為0.986 2，對(duì)比響應(yīng)面法所得回歸模型的回歸系數(shù)R2 為0.912 1，前者擬合效果更佳，基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法具有收斂速度快、計(jì)算時(shí)間短以及統(tǒng)計(jì)分析能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，所得模型可以更好描述培養(yǎng)基成分與產(chǎn)量之間的復(fù)雜關(guān)系，同時(shí)利用魯棒性強(qiáng)、尋優(yōu)性能更佳的遺傳算法在約束內(nèi)搜索尋優(yōu)，可以更好地找到使響應(yīng)值最大的最優(yōu)解[28]，在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證中也表現(xiàn)出更好的產(chǎn)酶水平。

2.6 不同擬合模型所得優(yōu)化配方發(fā)酵結(jié)果對(duì)比

將二次多項(xiàng)回歸模型（RSM）與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型（ANN）求最優(yōu)解后所得的培養(yǎng)基配方，用于黑曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)，并結(jié)合菌濃（PMV）、淀粉酶酶活及胞外蛋白濃度3 個(gè)參數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果如圖8 所示。

由圖8 所示，利用初始培養(yǎng)基、二項(xiàng)式回歸模型優(yōu)化培養(yǎng)基以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化培養(yǎng)所進(jìn)行黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)，可見培養(yǎng)基的成分差異和濃度差異對(duì)于黑曲霉的生長(zhǎng)及生產(chǎn)都有影響。初始培養(yǎng)基以蔗糖為碳源并且未進(jìn)行微量元素和培養(yǎng)工藝優(yōu)化，雖然菌濃可以生長(zhǎng)至優(yōu)化后水平（PMV 約為36%），但淀粉酶酶活及蛋白濃度較低。成分優(yōu)化后的兩種配方更適用于淀粉酶的高效誘導(dǎo)表達(dá)，酶活和蛋白濃度顯著提高。

相較于二項(xiàng)式回歸模型，通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型結(jié)合遺傳算法優(yōu)化配方發(fā)酵效果更佳。具體而言，前者在于減少了豆粕的濃度并且增加了玉米漿濃度，產(chǎn)量提高9%。這是由于豆粕作為不溶性成分，在供氧條件有限的搖瓶培養(yǎng)過程中[29]，其濃度過高易導(dǎo)致供氧不足，氧限情況在黑曲霉這種好氧菌株的發(fā)酵過程中不利于菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶。此外，人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化配方中，提高可溶性淀粉的濃度，有利于在搖瓶發(fā)酵中維持菌株的生產(chǎn)代謝活性，促進(jìn)淀粉酶的生產(chǎn)。不同配方培養(yǎng)時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)的生物量不同，表明底物代謝流傾向于生產(chǎn)而非生長(zhǎng)，從而使得產(chǎn)物得率更高。本研究所采用的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法適用于黑曲霉產(chǎn)淀粉酶發(fā)酵這種高度非線性的生物系統(tǒng)，所建立的模型具有較高的仿真精度。

3 結(jié) 論

本研究考察了多種碳氮源、無(wú)機(jī)鹽及金屬離子對(duì)于黑曲霉產(chǎn)淀粉酶的影響，并通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了初始發(fā)酵培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件。由PB 實(shí)驗(yàn)確定豆粕、玉米漿及可溶性淀粉為影響淀粉酶產(chǎn)量的顯著因素后，進(jìn)一步構(gòu)建多項(xiàng)式回歸模型以及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)回歸模型以擬合3 個(gè)組分的濃度與淀粉酶產(chǎn)量之間的非線性關(guān)系，通過尋優(yōu)得到產(chǎn)量最大的培養(yǎng)基配方，其中，豆粕、玉米漿及可溶性淀粉的濃度分別為（g/L）：38，31，49 或者是36，33，56。搖瓶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型所得優(yōu)化配方發(fā)酵效果較好，其淀粉酶酶活可達(dá)5 566.79 U/mL，比優(yōu)化前提高了92.6%；蛋白濃度可達(dá)29 g/L，比優(yōu)化前提高了51.5%，具有較好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：王曉麗）

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