汪保 朱夢婷 楊華 楊永林 余乾 張文喆

摘要［目的］研究MyoD基因與鵪鶉生長性狀的相關(guān)性。［方法］以朝鮮鵪鶉為研究對象，應(yīng)用HRM技術(shù)檢測群體中MyoD基因的多態(tài)性，測定其生長性狀，并進行關(guān)聯(lián)分析；qPCR檢測3種基因型胚胎肌肉組織中MyoD基因的表達量。［結(jié)果］MyoD基因在群體中存在AA、Aa和aa 3種基因型，AA和Aa基因型個體的胸圍顯著高于aa基因型（P＜0.05）。胚胎發(fā)育的7～15 d均能檢測到MyoD基因表達，MyoD基因的表達量從11 d開始升高，15 d達到峰值。AA和Aa基因型MyoD基因表達量提高速度高于aa基因型。［結(jié)論］MyoD基因A等位基因為朝鮮鵪鶉胚胎生長發(fā)育的優(yōu)勢基因，可用于生長發(fā)育快的個體基因型育種選擇。

關(guān)鍵詞鵪鶉；MyoD基因；多態(tài)性；生長性狀；相關(guān)性分析

中圖分類號S 837文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2023）24-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.24.020

The Polymorphism Detection of MyoD Gene and Correlation Analysis with Growth Traits in Quail

WANG Bao1，ZHU Mengting2，3，YANG Hua2，3 et al

（1.The 4th division ChuangJin Agricultural Development Group Co.，Ltd.of Xinjiang Production and Construction Corps，Kekedala，Xinjiang 835209;2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science，Shihezi，Xinjiang 832000;3.College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003）

Abstract［Objective］The purpose of this study was to explore the correlation between the different genotypes of MyoD gene and growth traits in quails.［Method］Korean quails were chosen as the research object，HRM technology was used to detect the polymorphism of MyoD gene in quails，and the growth traits were measured.The correlation analysis between growth traits and MyoD gene were analyzed.The mRNA expression of MyoD three genotypes were analyzed by qPCR in muscle tissue in embryonic stage of quail.［Result］The results showed that three genotypes（AA，Aa and aa） of MyoD gene were detected in the quail population.The chest circumference was significantly higher in AA and Aa genotype than aa genotype（P＜0.05）.The results of qPCR showed that MyoD gene expression could be detected at 7-15 d of embryonic development，the level of MyoD gene expression was increased on day 11，and reached a peak on day 15 of embryonic development.The expression level of AA and Aa genotypes was significantly faster than that of aa genotype.［Conclusion］It is speculated that A allele of MyoD gene may be the dominant genotype during the embryonic growth and development of Korean quail，and can be used to genotype selection for rapid growth in quail breeding.

Key wordsQuail;MyoD gene;Polymorphism;Growth trait;Correlation analysis

鵪鶉作為第二大禽類肉制品，在我國及世界各地都有廣闊的市場。隨著消費者對于肉質(zhì)要求的日益多樣化，人們不再一味地追求瘦肉率，而是喜歡獨特的口感。鵪鶉具有肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值高及獨特的風味，深受消費者歡迎［1］。動物肌肉組織的生長發(fā)育從微觀的角度分析是蛋白質(zhì)增加和細胞增長分化的結(jié)果，其過程相對較為復(fù)雜，涉及多基因的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程。MyoD是生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors，MRFs）基因家族成員中唯一在所有的肌細胞中都能夠表達的基因，參與成肌細胞的分化和特化過程，是一種對肌肉組織的生長發(fā)育具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子［2］。

研究表明，MyoD基因參與早期成肌細胞分化和發(fā)育，在家禽早期細胞發(fā)育中起著重要作用［3］。張久盤等［4］對固原雞CDS區(qū)的SNP進行檢測，發(fā)現(xiàn)MyoD基因126A>C突變位點可能是影響固始雞生長發(fā)育的重要SNP。朝鮮鵪鶉的肌肉纖維早在胚胎時期就已經(jīng)發(fā)育完成，可能受到MyoD等相關(guān)基因的調(diào)控，但有關(guān)其作用機理的研究較少［5］。因此，筆者以朝鮮鵪鶉為研究材料，研究MyoD基因的多態(tài)性，分析不同基因型與生長性狀的相關(guān)性，利用qPCR技術(shù)檢測子代MyoD基因型胚胎肌肉組織中的mRNA表達水平，探討MyoD基因與鵪鶉胚胎肌肉發(fā)育之間的關(guān)系，以期為鵪鶉的分子育種提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗動物與飼養(yǎng)管理120只體重接近、健康狀況良好的8周齡朝鮮鵪鶉購自莒南縣鵪鶉養(yǎng)殖場，包括公鵪鶉20只和母鵪鶉100只。公母分籠飼養(yǎng)，待母鵪鶉體內(nèi)精液排盡之后用于后續(xù)試驗。采用50 cm×60 cm×40 cm折疊式飼喂籠，飼養(yǎng)密度為0.3 m2/只，自由采食和飲水（開始飼喂的前飲水中添加多維緩解應(yīng)激），鵪鶉日糧為天康飼料科技有限公司的全價配合飼料進行喂養(yǎng)。日糧組成：玉米63.45%，豆粕28.40%，骨粉2.00%，石粉2.00%，預(yù)混料1.00%，魚粉3.00%，DL-蛋氨酸0.15%；營養(yǎng)成分：鈣3.00%，總磷0.30%，粗纖維2.00%，粗蛋白19.85%，代謝能11.56 MJ/kg。

夜間提供光照，舍內(nèi)溫度維持20～23 ℃，每天清掃一次并用消毒劑殺菌，保證良好的空氣質(zhì)量，確保相同的飼喂環(huán)境。試驗期間每日10：00和20：30定時定量飼喂，確保每日剩余飼料量不超過飼喂量的5％。

1.2主要儀器與試劑電子天平（賽多利斯有限公司，德國），PCR儀（SeneoQuest公司，德國），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），電泳儀（北京六一生物科技有限公司，北京），高速臺式離心機（日立公司，日本），Light Cycler96熒光定量PCR儀（Roche公司，美國），DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，中國），LC Green飽和熒光染料（Idaho公司，美國）。

1.3樣品采集和指標測定試驗開始第1天隨機分籠后佩戴腳標，并在禁食12 h后測定生長性狀（體重、體斜長、龍骨長、胸圍、脛長、脛圍）。具體測定方法參考《NY/T 823—2004 家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計方法》進行［6-8］。第20天開始將公鵪鶉與母鵪鶉進行自然交配，并于配種后7 d內(nèi)開始收集種蛋，分批收集不同分組的種蛋，并轉(zhuǎn)移到孵化箱內(nèi)。在7～15日胚齡開始采集胚胎肌肉組織，并迅速轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱備用。

1.4引物的設(shè)計與合成參照雞MyoD基因序列（GenBank登錄號：XM_046943766.1），選取β-actin基因作為內(nèi)參基因。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計4對引物，其中MyoD-1、MyoD-2用于多態(tài)性分析，MyoD-3用于qRT-PCR試驗，引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.5MyoD基因多態(tài)性檢測翅下靜脈采集親本朝鮮鵪鶉1 mL全血，參照DNA提取試劑盒的說明書提取血液基因組DNA，通過高分辨率溶解曲線（HRM）分析MyoD基因的群體多態(tài)性。PCR反應(yīng)體系：PCR Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，LC Green飽和熒光染料0.3 μL，dd H2O 12.7 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s，引物對應(yīng)的退火溫度30 s，72 ℃延伸 30 s，共40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。HRM程序：95 ℃變性5 min；40 ℃冷卻1 min 形成雜合體；從 60 ℃ 開始升至95 ℃進行熒光信號的收集，每秒收集25次信號。收集完后冷卻至40 ℃，所有反應(yīng)只重復(fù)1次。

選取3個有多態(tài)性的基因PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果與MyoD基因序列進行對比分析。

1.6MyoD基因表達的qRT-PCR分析將公鵪鶉與母鵪鶉進行雜交試驗，根據(jù)基因型組建 Ⅰ 組（AA和Aa基因型）和 Ⅱ 組（aa基因型）子代胚胎，采集胚胎肌肉樣品，使用Trizol法提取組織總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系：5×PrimeScript RT Master Mix 8 μL，RNA約1 800 ng（根據(jù)濃度計算），加入RNase-free ddH2O補至40 μL。cDNA合成的條件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；合成的cDNA置于4 ℃保存。

利用qRT-PCR檢測MyoD基因的相對表達量。20 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix ExTaq （2×）10 μL、cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循壞，每個樣品設(shè)3次重復(fù)。

1.7數(shù)據(jù)分析構(gòu)建最小二乘線性模型：Yij= μ+ Gi+ eij，其中，Yij為性狀觀察值，μ為群體性狀均值，Gi為基因型固定效應(yīng)，eij為隨機誤差。使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對基因型與生長性狀進行關(guān)聯(lián)分析。2組基因型MyoD基因表達量采用t檢驗進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1親本鵪鶉MyoD基因多態(tài)性從圖1可見，HRM分型結(jié)果，公母鵪鶉群體中MyoD基因均存在AA、Aa和aa 3種基因型。

2.2MyoD基因測序結(jié)果對MyoD基因PCR產(chǎn)物測序結(jié)果進行比對，發(fā)現(xiàn)MyoD基因存在A700G的同義突變（圖2）。

2.3MyoD基因的遺傳多態(tài)性由表2可知，在親本鵪鶉群體中，AA基因型個體數(shù)高于其他基因型，為優(yōu)勢基因型，AA基因型頻率為0.56。而母鵪鶉的AA、Aa和aa的基因型頻率分別為0.56、0.28和0.16。親本公母鵪鶉的等位基因A為優(yōu)勢等位基因，基因頻率分別為0.67和0.70。χ2檢驗表明，公母鵪鶉該基因座偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

2.4MyoD基因多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析由表3可知，對朝鮮鵪鶉MyoD基因AA、Aa和aa 3種基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，AA和Aa基因型個體的胸圍顯著高于aa基因型個體（P＜0.05），3種基因型個體的體斜長、龍骨長、脛長和脛圍均差異不顯著（P＞0.05）。

2.5子代鵪鶉胚胎期MyoD基因的相對表達量從圖3可見，Ⅰ 組和 Ⅱ 組鵪鶉在胚胎肌肉發(fā)育的7～15 d均檢測到MyoD基因的表達，第7～10天表達水平較低，從11 d開始顯著升高，在15 d達到最高峰；Ⅰ 組（AA和Aa基因型）鵪鶉在11 d之后的表達量增長顯著高于 Ⅱ 組（aa基因型）個體（P＜0.05）。

3討論

MyoD是典型的肌肉發(fā)育調(diào)節(jié)因子，其表達水平與胎兒胚胎期的肌肉生長發(fā)育密切相關(guān)。MyoD基因調(diào)控自身的表達，與其他的生肌因子互相作用，控制或抑制彼此的表達［2，8-9］。MyoD的基因型與基因頻率對肌纖維的發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié)作用，并對產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)有重要影響。魏岳［10］對邊雞MyoD基因多態(tài)性和生長和屠宰性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，MD-4位點對生長性狀有顯著或極顯著的影響，且AA和CC為優(yōu)勢基因型。該研究通過檢測朝鮮鵪鶉MyoD基因多態(tài)性，測序發(fā)現(xiàn)MyoD基因存在A700G的同義突變位點存在AA、Aa和aa 3種基因型。關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，MyoD基因不同基因型與生長性狀之間有一定相關(guān)性，AA和Aa基因型個體的胸圍顯著高于aa基因型個體。因此，推測AA基因型是參與調(diào)控鵪鶉胚胎期肌肉發(fā)育的優(yōu)勢基因型，這與魏岳［10］的研究一致。

在家禽胚胎早期，肌纖維的分化就已經(jīng)完成，MyoD基因控制成肌細胞分化和發(fā)育［11-13］。Mok等［14］研究發(fā)現(xiàn)，在體節(jié)中Myf5首先在HH第9階段的體節(jié)和近軸中胚層中表達，隨后在HH 第12階段表達MyoD，在HH第14階段表達Mgn和MRF4；在四肢肌肉中HH第22階段前肢中首先檢測到Myf5表達，在HH第23階段檢測到MyoD表達，在HH第24階段檢測到Mgn表達，在HH第30階段檢測到MRF4表達。該研究結(jié)果表明，Ⅰ 組鵪鶉和 Ⅱ 組鵪鶉在胚胎肌肉發(fā)育的7～15 d均檢測到MyoD基因表達，但7～10 d表達水平較低，從11 d開始顯著升高，在15 d達到最高峰。AA和Aa基因型鵪鶉在11 d之后MyoD基因的表達量顯著高于aa基因型個體，并且2組個體MyoD基因的表達均表現(xiàn)出相似的增長趨勢，但AA和Aa基因型的增長幅度較為顯著。

4結(jié)論

朝鮮鵪鶉MyoD基因存在A700G同義突變位點，AA和Aa基因型個體的胸圍顯著高于aa基因型個體，MyoD基因在胚胎肌肉發(fā)育的11 d以后開始發(fā)揮作用，攜帶A等位基因的個體MyoD基因表達量高，生長發(fā)育快。

參考文獻

［1］劉佩，龐有志，張小輝，等.朝鮮鵪鶉OCA2基因克隆及其多態(tài)性與羽色的相關(guān)性［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2020，48（2）：7-14，25.

［2］ 范心鳳，金四華，高斌，等.不同日齡皖南三黃雞肌肉中MyoD基因表達及相關(guān)分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2019，46（5）：785-790.

［3］ 何明亮，張欣超，陳福祥，等.京海黃雞MyoD基因外顯子1多態(tài)性對生長和繁殖性狀的遺傳效應(yīng)［J］.中國家禽，2019，41（24）：53-55.

［4］ 張久盤，王錦，張娟，等.固原雞生肌調(diào)節(jié)因子MyoD基因克隆及其組織表達分析［J］.中國家禽，2018，40（21）：11-16.

［5］ YANG Z Q，QING Y，ZHU Q，et al.Genetic effects of polymorphisms in myogenic regulatory factors on chicken muscle fiber traits［J］.AsianAustralasian journal of animal sciences，2015，28（6）：782-787.

［6］ FENG X，WANG Z Y，WANG F，et al.Dual function of VGLL4 in muscle regeneration ［J］.Embo journal，2019，38（17）：1-16.

［7］ 陳寬維，高玉時，王志躍，等.中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準? 家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計方法［J］.中國禽業(yè)導(dǎo)刊，2006，23（15）：45-46.

［8］ 家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計方法［C］//中國畜牧業(yè)協(xié)會禽業(yè)分會.首屆中國黃羽肉雞行業(yè)發(fā)展大會會刊.廣州：中國畜牧業(yè)協(xié)會，2008：240-246.

［9］ VELLEMAN S G，COY C S，EMMERSON D A.Effect of the timing of posthatch feed restrictions on broiler breast muscle development and muscle transcriptional regulatory factor gene expression［J］.Poultry science，2014，93（6）：1484-1494.

［10］ 魏岳.邊雞MSTN基因、MyoD家族部分基因和Smad3基因多態(tài)性與生長和屠體性狀的相關(guān)性分析以及表達的研究［D］.揚州：揚州大學(xué)，2014.

［11］ MCFARLAND D C，PESALL J E，COY C S，et al.Effects of 17βestradiol on turkey myogenic satellite cell proliferation，differentiation，and expression of glypican1，MyoD and myogenin［J］.Comparative biochemistry and physiology.Part A：Molecular and integrative physiology，2013，164（4）：565-571.

［12］ COLE N J，HALL T E，MARTIN C I，et al.Temperature and the expression of myogenic regulatory factors（MRFs） and myosin heavy chain isoforms during embryogenesis in the common carp Cyprinus carpio L.［J］.Journal of experimental biology，2004，207（24）：4239-4248.

［13］ ALVES H J，ALVARES L E，GABRIEL J E，et al.Influence of the neural tube/notochord complex on MyoD expression and cellular proliferation in chicken embryos［J］.Brazilian journal of medical and biological research，2003，36（2）：191-197.

［14］ MOK G F，MOHAMMED R H，SWEETMAN D.Expression of myogenic regulatory factors in chicken embryos during somite and limb development［J］.Journal of anatomy，2015，227（3）：352-360.