許歡歡，苗春霖，宋穎，何愛民，吉洋洋，牟德華，高山*

（1.河北科技大學 食品與生物學院，河北 石家莊 050018；2.河北綠嶺康維食品有限公司，河北 邢臺 054300；3.河北?。ㄐ吓_）核桃產業(yè)技術研究院，河北 邢臺 054300）

核桃分心木（Diaphragma juglandis Fructus，DJF）是一類常見的核桃副產品，存在于核桃內的木質橫隔膜，別名分心木、胡桃夾、胡桃隔，因其味道苦澀，在食品加工中經常被丟棄[1]。DJF 也被廣泛用于傳統(tǒng)醫(yī)藥中，包括治療和預防糖尿病、腎虛、腹瀉和泌尿生殖系統(tǒng)疾病等[2]。DJF 中含有豐富的多糖、黃酮、多酚、甾類、單寧、膳食纖維、不飽和脂肪酸等多種成分[3-6]，具有廣泛的生物活性。大孔樹脂吸附-解吸工藝因其易于擴展、價格低廉、可重復使用、無毒、不產生二次污染等優(yōu)點被開發(fā)并廣泛應用于天然產物提取物的分離純化[7]，如酚類、黃酮類、糖苷和皂苷[8-9]。

目前，對DJF 的研究主要集中在粗提物或某些化學成分的定性和定量分析[10]，對核桃分心木多酚（Diaphragma juglandis Fructus polyphenols，DJF-P） 分離純化的研究較少，一定程度上影響了DJF-P 資源的開發(fā)利用。前期試驗中發(fā)現(xiàn)DJF 可有效抑制炎癥因子NO的釋放，推測核桃分心木發(fā)揮抗炎作用的主要成分是槲皮素[11]。槲皮素具有廣泛的生理作用，特別是在誘導細胞凋亡、抑制轉移和抗增殖作用等方面[12-13]。為提高DJF-P 中槲皮素的純度，本試驗篩選出適用于純化分離DJF-P 的大孔樹脂，并優(yōu)化靜態(tài)吸附解吸的工藝條件，以期為開發(fā)利用DJF-P、提高核桃資源附加值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DJF：河北省綠嶺康維有限公司；AB-8、HPD-20、D101、HPD-400、ADS-17 型大孔樹脂：天津市天大化工實驗廠；蘆丁、綠原酸、阿魏酸、沒食子酸、槲皮素、兒茶素：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

AR64CN 分析天平、DFT-200 高速萬能粉碎機：上?；茖嶒炂鞑挠邢薰?；CRE-2000A 旋轉蒸發(fā)器：鞏義市英峪高科儀器廠；KQ5200DE 數(shù)控超聲清洗機：昆山超聲儀器有限公司；V-500 分光光度計：上海元析儀器有限公司；LC-20 高效液相色譜分析：日本島津公司；Diamonsil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：北京迪科馬科技有限公司；TDL-5-A 離心機：上海安亭科學儀器廠；CHA-S 恒溫搖床：常州冠軍儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DJF 預處理

將DJF 放入高速萬能粉碎機中進行粉碎，每次打粉15 s，為防止溫度過高兩次打粉間隔1 min，共打粉3 次，過80 目篩得到DJF 粉。

1.3.2 DJF-P 制備

將預處理后的DJF 粉用55%乙醇按照一定料液比[1∶5、1∶15、1∶25（g/mL）]在室溫下浸提24 h，過濾，收集濾液。濾液在60 ℃下負壓旋蒸，濃縮到原體積的1/4，收集濃縮液。將濃縮液用無水乙醇沉淀（體積比為1∶4），在4 ℃冰箱過夜，收集濾液，除去析出的多糖沉淀，得到DJF-P 濃縮液。將DJF-P 濃縮液用55%乙醇稀釋10、20、30 倍，共制備出9 種DJF-P 溶液，在4 ℃下保存?zhèn)溆?，制備? 種DJF-P 溶液見表1。

表1 制備的9 種DJF-P 溶液Table 1 Preparation of nine types of DJF-P solutions

表2 核桃分心木酚類物質HPLC 梯度洗脫程序Table 2 HPLC gradient elution procedure for Diaphragma juglandis Fructus polyphenols

1.3.3 總酚含量的測定

采用楊文娟等[14]的方法，將沒食子酸標準品作為對照，以含量x（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。將DJF-P 濃縮液和DJF-P 溶液按相同方法測定吸光值，根據(jù)標準曲線計算總酚含量。

1.3.4 大孔樹脂預處理

參照巫永華等[15]的方法，在使用前，去除在生產過程中殘留在樹脂孔隙中的合成單體、引發(fā)劑和致孔劑[16]。取AB-8、HPD-20、D101、HPD-400、ADS-17 5 種不同型號的大孔樹脂，分別加入體積分數(shù)為95%乙醇浸泡24 h，再用去離子水洗滌至無醇味。將處理好的大孔樹脂用體積分數(shù)為6%的HCl 浸泡3 h，用去離子水洗至中性，再用體積分數(shù)為6%的NaOH 溶液浸泡3 h，用去離子水洗至中性，備用。

1.3.5 大孔樹脂的篩選

準確稱取處理過的AB-8、HPD-20、D101、HPD-400、ADS-17 5 種不同型號的大孔樹脂各1 g，放入150 mL 錐形瓶中。分別加入30 mL DJF-P 5# 溶液提取料液比為[1∶15（g/mL）、稀釋20 倍]，將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上以100 r/min 的頻率振蕩24 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（1）計算各大孔樹脂吸附率（P，%）。

抽濾上述吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗去除樹脂表面殘留溶液，將已達吸附平衡的樹脂分別放入150 mL 錐形瓶中，加入85%乙醇溶液30 mL，將錐形瓶置于25 ℃水浴搖床中以100 r/min 的頻率振蕩解吸12 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（2）計算各大孔樹脂的解吸率（D，%）[17]。

式中：C0為吸附前DJF-P 的原始濃度，μg/mL；C1為大孔樹脂吸附后DJF-P 的濃度，μg/mL；C2為解吸液中DJF-P 的濃度，μg/mL；V1為粗提物溶液體積，mL；V2為用于解吸的乙醇溶液體積，mL。

1.3.6 AB-8 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸試驗

1.3.6.1 吸附時間對靜態(tài)吸附量的影響

稱取4 份經過預處理的AB-8 樹脂各1 g，放入150 mL 錐形瓶中。分別加入30 mL DJF-P 5# 溶液（提取料液比為1∶15（g/mL）、稀釋20 倍），將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上以100 r/min 的頻率分別振蕩4、6、8、12 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（1）計算AB-8 大孔樹脂吸附率。

抽濾上述吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗去除樹脂表面殘留溶液，將已達吸附平衡的樹脂分別放入150 mL 錐形瓶中，加入85%乙醇溶液30 mL，將錐形瓶置于25 ℃水浴搖床中以100 r/min 的頻率振蕩解吸4、6、8、12 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（2）計算各大孔樹脂的解吸率。

1.3.6.2 上樣液料液比對靜態(tài)吸附量的影響

稱取3 份經過預處理的AB-8 樹脂各1 g，放入150 mL 錐形瓶中。分別加入30 mL DJF-P 2#、5#、8# 溶液[提取料液比為1∶5、1∶15、1∶25（g/mL），稀釋20 倍]，將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上以100 r/min 的頻率振蕩8 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（1）計算AB-8 大孔樹脂吸附率。

抽濾上述吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗去除樹脂表面殘留溶液，將已達吸附平衡的樹脂分別放入150 mL 錐形瓶中，加入85%乙醇溶液30 mL，將錐形瓶置于25 ℃水浴搖床中以100 r/min 的頻率振蕩解吸8 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（2）計算各大孔樹脂的解吸率。

1.3.6.3 DJF-P 稀釋倍數(shù)對靜態(tài)吸附量的影響

稱取4 份經過預處理的AB-8 樹脂各1 g，放入150 mL 錐形瓶中。分別加入30 mL 的DJF-P 濃縮液和DJF-P 4#、5#、6# 溶液[提取料液比為1∶15（g/mL），稀釋10、20、30 倍]，將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上以100 r/min 的頻率振蕩8 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（1）計算AB-8 大孔樹脂吸附率。

抽濾上述吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗去除樹脂表面殘留溶液，將已達吸附平衡的樹脂分別放入150 mL 錐形瓶中，加入85%乙醇溶液30 mL，將錐形瓶置于25 ℃水浴搖床中以100 r/min 的頻率振蕩解吸8 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（2）計算各大孔樹脂的解吸率。

1.3.6.4 解吸液濃度對靜態(tài)解吸率的影響

稱取5 份經過預處理的AB-8 樹脂各1 g，放入150 mL 錐形瓶中。分別加入30 mL DJF-P 5# 溶液[提取料液比為1∶15（g/mL），稀釋20 倍]，將錐形瓶置于25 ℃恒溫搖床上以100 r/min 的頻率分別振蕩8 h。然后將樹脂過濾后洗去殘留的多酚，放入150 mL 錐形瓶中。

抽濾上述吸附飽和的樹脂，用蒸餾水沖洗去除樹脂表面殘留溶液，將已達吸附平衡的樹脂分別放入150 mL 錐形瓶中，分別加入30 ml 體積分數(shù)為60%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液，將錐形瓶置于25 ℃水浴搖床中以100 r/min 的頻率振蕩解吸8 h，取上清液，按“1.3.3”方法測定溶液吸光值，計算溶液中總酚含量。按公式（2）計算各大孔樹脂的解吸率。

1.3.7 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析DJF-P 的組成

通過分光光度計測其在320～380 nm 的吸光度，得到其在346 nm 吸光度最大，因此確定346 nm 為樣品的測定波長。

分別稱取蘆丁、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸、槲皮素5 種標準品各10 mg，用甲醇溶解并配制成1 mg/mL 的單標溶液。各取單標溶液2 mL，配制成混合標準樣品溶液。

HPLC 條件：Diamonsil C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相A：0.1%（體積分數(shù)）甲酸水溶液；流動相B：乙睛；流速：0.5 mL/min[18]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010、Origin 2018 進行分析及繪圖，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，每個試驗至少重復3 次。

2 結果與討論

2.1 核桃分心木總酚的測定

總酚含量標準曲線如圖1 所示。

圖1 總酚含量標準曲線Fig.1 Standard curve of total phenolic content

在760 nm 波長下測定不同濃度沒食子酸的吸光度，將結果做線性回歸，以沒食子酸標品的濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光值（A）為縱坐標。由圖1 可知，標準曲線為Y=0.015 39+0.018 43X（R2=0.997 37）。

2.2 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂的吸附能力受表面積、孔徑和極性的影響。同時，范德華力在復雜吸附過程中起著至關重要的作用。由于不同類型大孔樹脂的表面性質、孔狀結構及與DJF-P 含有的氫基團和苯環(huán)之間形成范德華力或氫鍵的能力不同，因而對DJF-P 具有不同的吸附能力[19-20]，試驗中5 種大孔樹脂的理化特性見表3。5 種大孔樹脂對DJF-P 吸附解吸性能比較見圖2。

表3 不同型號大孔樹脂的相關性質Table 3 Relevant properties of different types of macroporous resins

從圖2 可以看出，吸附率較高的大孔樹脂類型為HPD-20、ADS-17，但通過試驗觀察發(fā)現(xiàn)這2 種大孔樹脂對色素吸附能力較高，造成試驗數(shù)據(jù)偏差，導致解吸率偏低的情況；AB-8 型大孔樹脂的吸附率和解吸率表現(xiàn)均優(yōu)于D101、HPD-400 型大孔樹脂，所以選擇AB-8 大孔樹脂進行后續(xù)試驗。

2.3 AB-8 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸試驗

2.3.1 吸附時間對靜態(tài)吸附量的影響

吸附過程由不同的階段組成，在吸附階段并不保持穩(wěn)定。一般來說，目標分子通過傳質從邊界層擴散到大孔樹脂的孔隙中，吸附在大孔樹脂的表面活性位點上。吸附速率與所用的時間、溶劑和吸附劑材料直接相關[21]。按照一定的時間間隔檢測吸附液和解吸液中的總酚含量，并計算出吸附率和解吸率，繪制動力曲線，結果見圖3。

圖3 AB-8 大孔樹脂的時間動力曲線Fig.3 Time-dynamic curve of AB-8 macroporous resin

由圖3 可知，隨著時間的延遲，吸附率整體逐漸增加，初始階段吸附速度較快。到達8 h 后，由于大孔樹脂的表面結合位點大多處于飽和狀態(tài)，只觀察到微小的變化，所以吸附時間選擇8 h。解吸過程中，當解吸時間到達8 h 后，解吸率開始下降，可能是由于大孔樹脂出現(xiàn)了復吸現(xiàn)象，重新將多酚從解吸液中吸附至大孔樹脂的表面活性位點上[22]。因此，后續(xù)其他因素的優(yōu)化過程中的吸附時間和解吸時間選擇8 h。

2.3.2 料液比對靜態(tài)吸附解吸性能的影響

溶劑比例相對較低時，提取溶液容易達到飽和，溶液體系中的總酚含量較低，隨著溶劑的增加，總酚的溶解更加完全，同時多糖和蛋白質等雜質的溶出也會增加。料液比對靜態(tài)吸附解吸性能的影響見圖4。

圖4 料液比對靜態(tài)吸附解吸性能的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on static adsorption-desorption performance

由圖4 可知，隨著提取液體積增大，體系中的總酚含量增加，吸附率逐漸升高，解吸率逐漸減小。由于料液比為1∶5（g/mL）時吸附率過低、料液比1∶25（g/mL）時解吸率太低，且吸附率太低會影響對DJF-P 的富集效果，解吸率太低會影響大孔樹脂的再利用功能，因此料液比選擇1∶15（g/mL）。

2.3.3 DJF-P 濃縮液稀釋倍數(shù)對靜態(tài)吸附解吸性能的影響

吸附液濃度過高時，會縮短大孔樹脂的使用壽命。吸附液濃度過低時，會延長吸附時間。DJF-P 濃縮液稀釋倍數(shù)對靜態(tài)吸附解吸性能的影響見圖5。

圖5 分心木多酚提取液稀釋倍數(shù)對靜態(tài)吸附解吸性能的影響Fig.5 Effect of dilution ratio of Diaphragma juglandis Fructus polyphenol extract on static adsorption-desorption performance

由圖5 可知，隨著稀釋倍數(shù)的增加，大孔樹脂解吸率先急速升高后逐漸下降，但下降差距較小。由于當DJF-P 濃度過大時體系中的雜質含量也較多，雜質可能阻塞樹脂空隙[23]，也可能與DJF-P 爭奪AB-8 大孔樹脂的活性位點[24]；而低質量濃度的DJF-P 會使AB-8大孔樹脂吸附活性降低。故最佳稀釋倍數(shù)為20 倍。

2.3.4 解吸液濃度對靜態(tài)吸附解吸性能的影響

由于乙醇毒性低、成本低、易于去除，常被用作大孔樹脂的解吸液[25]。乙醇濃度對靜態(tài)吸附解吸性能的影響見圖6。

圖6 解吸液濃度對靜態(tài)吸附解吸性能的影響Fig.6 Effect of desorption solution concentration on static adsorption-desorption performance

由圖6 可知，解吸液極性隨著濃度發(fā)生改變，乙醇濃度較低時，其相對極性較強，解吸率較低；當乙醇濃度為70%時，極性較為適中，AB-8 大孔樹脂的解吸率最高；隨著乙醇濃度的增加，極性降低，解吸率又有所下降[26]，故解吸液的最佳濃度為70%。

2.4 HPLC 測定多酚含量結果分析

DJF-P 中含有多種多酚類物質，通過HPLC 可以對比分析出經過大孔樹脂純化分離后的物質變化如圖7 所示。

圖7 5 種對照品及DJF-P 純化前后的HPLC 色譜圖Fig.7 HPLC chromatograms of five reference substances and DJF-P before and after purification

由圖7 可知，純化前DJF-P 含有較多雜峰，純化后鑒別出槲皮素的純度大大提高。經過對照標準品色譜分析圖，共檢測出5 種主要的多酚類物質分別為沒食子酸、綠原酸、蘆丁、阿魏酸和槲皮素，其中槲皮素含量最高，純化前槲皮素含量為65.81%，純化后槲皮素含量為97.41%。證明AB-8 型大孔吸附樹脂對DJF-P的純化效果較好。

3 結論

通過靜態(tài)吸附和解吸試驗，篩選出最適合分離純化DJF-P 的AB-8 型大孔樹脂，其最佳工藝條件：采用55%乙醇按料液比為1∶15（g/mL）室溫下浸提24 h，過濾，60 ℃旋蒸，收集DJF-P 濃縮液。將DJF-P 濃縮液用55%乙醇稀釋20 倍后，得到DJF-P 溶液。DJF-P 溶液與AB-8 型大孔樹脂振蕩吸附8 h，吸附飽和后，70%乙醇對AB-8 型大孔樹脂振蕩解吸8 h，過濾，得到純化后的DJF-P 溶液。經HPLC 分析，純化前的DJF-P主要成分含有槲皮素、阿魏酸、蘆丁、綠原酸和沒食子酸，其中槲皮素含量最高。純化后DJF-P 中的槲皮素的純度可由65.81%提高到97.41%。DJF-P 中的槲皮素經前人試驗證明具有較強的抗炎作用，本試驗將DJF-P 中的槲皮素純度大大提升，為后續(xù)核桃分心木資源的開發(fā)利用奠定試驗基礎。