蔡玉紅，劉歡，謝明勇

（南昌大學 食品學院，江西 南昌 330047）

大米蛋白（rice protein，RP）是大米中蛋白質(zhì)的總稱，根據(jù)Osborne 提出的基于溶解度的分類方法，大米蛋白組分主要有4 種蛋白：清蛋白（水溶性），占比2%～5%；球蛋白（鹽溶性），占比2%～10%；醇溶蛋白（醇溶性），占比1%～5%；谷蛋白（稀酸、稀堿溶性），占比66%～80%[1-2]。低過敏、易消化、氨基酸配比合理是大米蛋白的主要優(yōu)點，同時也是公認的優(yōu)質(zhì)膳食蛋白，其組分主要為谷蛋白，由于谷蛋白亞基通過二硫鍵聚合形成大分子復合物，從而導致大米蛋白溶解性比較差[3]。此外，大米蛋白往往從大米淀粉、淀粉糖漿的加工副產(chǎn)物中提取而來，這些副產(chǎn)物的加工經(jīng)歷高溫液化和糖化作用，容易導致大米蛋白發(fā)生變性，部分易溶性清蛋白、球蛋白流失，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也變得更加致密，從而進一步降低了大米蛋白的溶解性[4]。較低的溶解性在很大程度上影響了大米蛋白的功能特性和應(yīng)用范圍，因此亟需對大米蛋白進行改性，以提高其溶解性，改善功能特性，擴大應(yīng)用范圍。

大米蛋白的改性方法主要包括物理、化學和生物酶法，其中酸法脫酰胺（化學法）是一種常用且高效的處理方式[1]，并已在其他多種難溶性蛋白（如米糠蛋白）中廣泛應(yīng)用，但是應(yīng)用在大米蛋白改性的研究較少。酸法脫酰胺反應(yīng)原理是由酸提供H+將-NH2鍵打斷，脫去NH2，該反應(yīng)可快速改變蛋白質(zhì)分子的電子分布狀態(tài)，伸展大米蛋白分子空間結(jié)構(gòu)，提高蛋白質(zhì)溶解性，從而進一步使蛋白獲得良好的功能特性[5-6]。

本文采用酸法脫酰胺改性，提高大米蛋白溶解性，通過對比大米蛋白（RP）、僅高溫處理蛋白（Control）、脫酰胺改性蛋白（Deamidation）在不同pH 值（3、7、9）環(huán)境中的溶解性、功能特性以及亞基分子量、二級結(jié)構(gòu)、表面微觀形態(tài)的變化，分析酸法脫酰胺對大米蛋白的溶解性的改善效果以及對功能特性、一二級結(jié)構(gòu)、表面微觀形態(tài)的影響，以期提高大米蛋白的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米蛋白：江西恒頂食品有限公司；大豆油：市售；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、四甲基乙二胺（4N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；可溶性糖檢測試劑盒、淀粉檢測試劑盒、蛋白Marker、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羥甲基）氨基甲烷[（tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris）]：北京索萊寶科技有限公司；二喹林甲酸（bicinchonininc acid，BCA）法蛋白濃度測定試劑盒、1×上樣緩沖液：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；濃硫酸、氫氧化鈉、磷酸鹽（均為分析純）：西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6B 數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；TDL-5-A 離心機：上海安亭科學儀器廠；Varioshan Flash 多功能酶標儀：美國熱電公司；Milli-Q 超純水儀：美國Millipore 公司；AL104 電子天平、FE28-Standard pH 計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IKA-RCT 基本型磁力加熱攪拌器、T18 高速分散均質(zhì)機、WORIEXZ 渦旋儀：德國IKA 公司；JSM 6701F 場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀：日本電子株式會社；Chemi XRS凝膠成像系統(tǒng)：美國BIO-RAO 公司；傅立葉紅外光譜儀：日本SHIMADZU 島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大米蛋白的主要成分測定

蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》方法測定，脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》方法測定，水分含量參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》方法測定，灰分含量參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》方法測定，可溶性糖含量測定按照可溶性糖檢測試劑盒說明書操作，淀粉含量測定按照淀粉檢測試劑盒說明書操作。

1.3.2 酸法脫酰胺處理

參考Meenmanee 等[7]的方法并稍作改動，稱取一定量大米蛋白樣品，按料液比1:25（g/mL）加入0.4 mol/L HCl 溶液，95 ℃水浴加熱攪拌4 h，立即冰浴10 min 以停止反應(yīng)，將處理后蛋白溶液pH 值調(diào)為7.0，去離子水透析24 h 除鹽，冷凍干燥待用。對照組加入相同料液比的超純水，其他處理條件保持一致。

1.3.3 溶解性測定

參考Meenmanss 等[7]的方法并稍作改動，準確稱取20 mg 蛋白樣品，加入5 mL 0.01 mol/L 磷酸緩沖液，用HCl/NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值為1～13，室溫攪拌60 min，4 800 r/min 離心15 min，取上清液，蛋白質(zhì)的溶解性（S，%）按公式（1）計算。

式中：c 為溶液中的蛋白濃度，mg/mL；c1為上清液中的蛋白濃度，mg/mL。

1.3.4 持水性、持油性測定

準確稱取0.1 g 樣品于10 mL 離心管中，加入5 mL的超純水/植物油，室溫攪拌30 min 充分混合均勻，靜置30 min 后，離心（3 000 r/min，30 min），除去上層水/油，稱取離心管和剩余物的質(zhì)量。蛋白樣品的持水性/持油性按公式（2）、（3）計算。

式中：W 為持水性，g/g；O 為持油性，g/g；m0為蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；m1為離心管的質(zhì)量，g；m2為離心后離心管和剩余物的質(zhì)量，g。

1.3.5 起泡性及起泡穩(wěn)定性測定

參考He等[8]的方法并稍作改動，取一定量蛋白樣品，溶于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液中，HCl/NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH 值為3、7、9，制備成1%蛋白溶液，取20 mL溶液于50 mL 的離心管中，分散均質(zhì)機分散2 min（10 000 r/min），立即讀取泡沫和液體的總體積，靜置30 min 后，再次記錄泡沫的體積。蛋白質(zhì)的起泡性質(zhì)由起泡性（F1，%）和起泡穩(wěn)定性（F2，%）表示，按公式（4）、（5）計算。

式中：V0為溶解樣品水溶液的體積，mL；V1為分散停止時泡沫和液體的總體積，mL；V2為靜置30 min后泡沫和液體的總體積，mL。

1.3.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

參考Liu 等[9]的方法并稍作改動，取一定量蛋白樣品，溶于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液中，HCl/NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH 值為3、7、9，制備成1%蛋白溶液，加入5 mL 植物油，分散均質(zhì)機分散1 min（10 000 r/min），從底部取50 μL 乳狀液，用0.1% SDS 溶液稀釋100 倍，渦旋3 s，在500 nm 波長下比色，記錄吸光度（A0）；10 min 后再從底部取50 μL 乳狀液，同樣稀釋，比色，記錄吸光度（A1）。蛋白質(zhì)乳化活性指數(shù)[E1，（m2/g）]和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（E2，min）按公式（6）、（7）計算。

式中：D 為稀釋倍數(shù)，100；c 為稀釋前蛋白質(zhì)濃度，g/mL；? 為油相體積分數(shù)，0.25；θ 為光程，1 cm。

1.3.7 表面疏水性測定

參考Liao 等[10]的方法并稍作改動，取蛋白樣品溶于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液中，HCl/NaOH 調(diào)節(jié)溶液pH 值為3、7、9，測定溶液實際蛋白濃度，稀釋濃度為0.01～0.08 mg/mL，取4 mL 各濃度溶液，加入20 μL 8 mmol/L ANS（同一溶劑配制），渦旋5 s，靜置5～10 min，激發(fā)波長λex=390 nm、發(fā)射波長λex=490 nm、狹縫校正5 nm 條件下測定熒光強度，以熒光強度-樣品濃度作曲線，曲線初始段斜率即為樣品的表面疏水性指數(shù)（Ho）。

1.3.8 亞基分子量測定

參考Liao 等[10]的方法并稍作改動，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法，具體參數(shù)：5%濃縮膠、12%分離膠，樣品與上樣緩沖液適當比例混合，離心除去未溶解蛋白（10 000 r/min，5 min），金屬浴5 min，上樣量5 μL，電壓、時間條件為80 V 30 min，120 V 120 min，當溴酚藍指示劑遷移到靠近凝膠板底部時，即可停止電泳。對凝膠進行染色，脫色，脫至條帶清晰，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.3.9 傅里葉紅外光譜

參考Fang 等[11]的方法并稍作改動，蛋白樣品與溴化鉀按照質(zhì)量比1∶1 混合均勻，燈照條件下研磨壓片，使用傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1掃描32 次，用溴化鉀為空白背景，經(jīng)過基線校正，曲線平滑，得到樣品紅外光譜。用Ominc 8.0 和Peakfit 4.0 軟件分析酰胺Ⅰ區(qū)（1 700～1 600 cm-1）的變化。

1.3.10 掃描電鏡

參考He 等[8]的方法并稍作改動，取微量樣品固定在樣品臺上（樣品需盡可能鋪勻），進行噴金后放入掃描電鏡儀器中，調(diào)節(jié)相關(guān)參數(shù)進行拍照觀察。

1.4 統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 和IBM SPSS Statistics 25 進行數(shù)據(jù)處理和分析，方差分析采用鄧肯多重比較（p＜0.05），使用GraphPad Prism 8.0 畫圖軟件繪制統(tǒng)計圖表。測定重復3 次，結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 大米蛋白主要成分分析

大米蛋白中的蛋白質(zhì)含量反映了樣品的純度，也決定了其應(yīng)用價值。大米蛋白主要成分見表1。

表1 大米蛋白主要成分Table 1 The main components of rice protein

從表1 可以看出，樣品中蛋白質(zhì)含量接近80%，純度較高，水分含量3.37%、脂肪含量3.82%、灰分含量1.22%。此外，還有少量可溶性糖和淀粉，這是由于在大米蛋白生產(chǎn)過程中歷經(jīng)高溫液化工序而使得蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)緊密結(jié)合，難以分離。Zhao 等[12]對大米蛋白進行了提取與成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中蛋白含量62.62%、水分含量6.05%、脂肪含量10.47%、灰分含量7.71%、碳水化合物含量9.37%，相較之下本文所用蛋白純度較高、雜質(zhì)較少。

2.2 大米蛋白溶解性分析

蛋白的溶解性是決定其應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一，同時也在很大程度上決定了蛋白起泡性、乳化性等功能性質(zhì)。大米蛋白多為堿溶性谷蛋白，在不同pH 值環(huán)境中的溶解性差異較大，弱酸弱堿環(huán)境有利于其溶解。本文對比研究了改性前后樣品在不同pH 值（1～13）環(huán)境中的溶解性，結(jié)果見圖1。

圖1 大米蛋白樣品在不同pH 值環(huán)境中的溶解性變化Fig.1 Changes in solubility of rice protein samples in different pH environments

圖1 可以看出，酸法脫酰胺改性后的樣品顯著提高了大米蛋白的溶解性，中性環(huán)境（pH7）中由原來的0.58%提高至56.60%，堿性環(huán)境（pH 值為12、13）溶解性達到90.00%以上。彭清輝[6]使用同樣的方法對大米蛋白進行改性，結(jié)果表明隨著脫酰胺程度的增加，大米蛋白溶解性顯著提高（溶解度>96.00%）；范瑩[13]對小米醇溶蛋白進行脫酰胺改性，在pH7.5 時溶解性顯著提高，由0.085%提高至10.57%；Meenmanee 等[7]使用酸法脫酰胺處理椰子蛋白，不同pH 值（3、5、7）條件下蛋白溶解性均高于未改性樣品，在pH7 時溶解性最好，由10%提高至50%，且溶解性隨著處理溫度的升高而提高（65 ℃：35%，70 ℃：45%，75 ℃：50%）。大米蛋白改性后溶解性提高的原因可能是脫酰胺反應(yīng)過程中，酸提供的H＋將蛋白側(cè)鏈的-NH2鍵打斷，以脫去NH2，酰胺基團轉(zhuǎn)變?yōu)轸然?，該過程改變了蛋白的電子分布狀態(tài)，主要為凈電荷增多、靜電斥力增大、蛋白趨于無序結(jié)構(gòu)，聚集的蛋白分子空間結(jié)構(gòu)得到伸展，蛋白分子量減小，從而顯著提高了大米蛋白的溶解性[5]。與未處理的樣品相比，高溫處理的對照組溶解性也稍有提高，這主要是因為在高溫條件下，大米蛋白發(fā)生部分變性，產(chǎn)生了部分水解效應(yīng)。

2.3 大米蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性分析

蛋白質(zhì)在發(fā)泡過程中所形成的界面面積可以用來衡量起泡性的強弱，同時保持氣泡不破裂的能力即為起泡穩(wěn)定性，兩種性質(zhì)與蛋白質(zhì)的溶解性、pH 值環(huán)境等密切相關(guān)。經(jīng)過高溫條件下的脫酰胺處理，大米蛋白空間結(jié)構(gòu)的展開和疏水基團的暴露會影響泡沫的形成，蛋白分子量的減小和蛋白分子上凈電荷的增加可以增強蛋白質(zhì)與水的相互作用。不同pH 值條件下改性前后蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性的變化見圖2。

圖2 不同pH 值條件下改性前后蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性變化Fig.2 Changes in foaming and foaming stability of rice protein samples at different pH

如圖2 所示，隨著pH 值的增加，起泡性明顯提高，pH 值為3、7 時，蛋白起泡性改善效果較好，大米蛋白和脫酰胺改性蛋白起泡性分別由原來的22.50%、80.40%提高至78.50%、151.70%。隨著pH 值的增加，起泡穩(wěn)定性先增加后趨于穩(wěn)定，pH3 時，改性后蛋白起泡穩(wěn)定性由原始的70.19%下降至20.34%，可能原因為該pH 值環(huán)境非常接近改性蛋白的等電點，蛋白分子間凈電荷減少，蛋白質(zhì)與水的相互作用減弱，導致泡沫穩(wěn)定性下降。pH 值為7、9 時，改性前后蛋白起泡穩(wěn)定性無明顯差異，可能原因為暴露的疏水性基團相互作用，導致表面疏水性降低，泡沫穩(wěn)定性變差。鄭建冰等[14]的研究結(jié)果表明，酸法脫酰胺改性后大米蛋白起泡性顯著提高，由13.00%提升至26.00%；Meenmanee 等[7]采用酸法脫酰胺改性后的椰子蛋白起泡性顯著提高，由3.68%提高為7.32%（75 ℃），起泡穩(wěn)定性稍有降低。Suppavorasatit 等[15]使用脫酰胺改性大豆蛋白，發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的延長，起泡性顯著增加，由最初的26.00%增加至53.30%，起泡穩(wěn)定性由11.90%提高至26.10%。

2.4 大米蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性分析

蛋白質(zhì)在水/油界面通過阻止結(jié)合而快速吸收極性和非極性成分的能力為其乳化性，乳化液在一段時間內(nèi)保持乳化的能力為乳化穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)的乳化性和乳化穩(wěn)定性取決于親水性和親脂性的平衡。不同pH 值條件下改性前后蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性的變化見圖3。

圖3 不同pH 值條件下改性前后蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性變化Fig.3 Changes in emulsification and emulsification stability of rice protein samples at different pH

如圖3 所示，在大米蛋白乳化性方面，隨著pH 值的增加，乳化性明顯提高，pH 值為3、7 時，蛋白乳化性改善效果較好，分別由原來的4.4、6.6 m2/g 提高至14.3、16.5 m2/g。在大米蛋白乳化性穩(wěn)定性方面，隨著pH 值的增加，與大米蛋白及僅高溫處理大米蛋白相比，改性后蛋白乳化穩(wěn)定性先提高后緩慢降低，pH 值為3、7時，蛋白的乳化穩(wěn)定性分別由原來的20.8、18.0 min 提高至54.9、28.14 min；pH9 時脫酰胺蛋白乳化穩(wěn)定性由原來的45.38 min 下降為30.14 min。乳化穩(wěn)定性降低，分析原因可能為表面疏水性的降低以及凈電荷的過度增加會減弱蛋白質(zhì)分子間相互作用，并且會對油-液界面彈性膜的形成產(chǎn)生阻礙作用，同時過度的水解以及蛋白球狀結(jié)構(gòu)的減少，也會導致油滴周圍形成的蛋白質(zhì)層較薄，從而導致乳液不穩(wěn)定[16-18]。Meenmanee等[7]的研究結(jié)果表明，脫酰胺處理后的椰子蛋白乳化性顯著提高，由49.94 m2/g 提高到67.43 m2/g，乳化穩(wěn)定性降低，由65.28 min 降低至24.49 min。鄭建冰等[14]對大米蛋白進行脫酰胺改性，隨著改性時間的延長，乳化性先增加后降低，乳化穩(wěn)定性改善效果不明顯。綜合以上分析，可以發(fā)現(xiàn)脫酰胺改性有利于提高蛋白乳化性，對乳化穩(wěn)定性的改善效果不明顯。

2.5 大米蛋白表面疏水性分析

表面疏水性是蛋白質(zhì)在特定的空間構(gòu)象下表現(xiàn)出的性質(zhì)，影響其大小的主要因素有暴露在表面的氨基酸殘基類型、數(shù)量以及蛋白的空間構(gòu)象。表面疏水性的變化反映了蛋白質(zhì)表面的疏水性基團含量，與蛋白質(zhì)的功能特性密切相關(guān)，尤其是蛋白質(zhì)的界面特性，即起泡、乳化等性質(zhì)。不同pH 值條件下改性前后大米蛋白的表面疏水性變化見圖4。

圖4 不同pH 值條件下改性前后大米蛋白的表面疏水性變化Fig.4 Changes in surface hydrophobicity of rice protein samples at different pH

如圖4 所示，未進行脫酰胺改性的蛋白在中性（RP=112.1，Control=100.8）、偏堿性環(huán)境（RP=97.0，Control=93.7）中的表面疏水性指數(shù)高于酸性環(huán)境（RP=11.7，Control=31.7），主要原因為隨著pH 值的增加，蛋白逐漸溶解，更多的疏水性基團暴露，導致表面疏水性增加。pH3 時，改性蛋白表面疏水性增加至64.5，pH值為7、9 時表面疏水性有所降低，分別為84.5、53.4。改性大米蛋白表面疏水性先增加后降低，分析原因為隨著pH 值增加，改性蛋白溶解性增大，暴露了更多的疏水基團，然而隨著溶解性的進一步增大，大量親水性基團會在一定程度上影響熒光探針與疏水性基團的結(jié)合，導致表面疏水性的降低[9]。其次，疏水基團間的相互作用也會導致表面疏水性降低。該結(jié)果與范瑩[13]研究結(jié)果一致，即小米醇溶蛋白脫酰胺改性后表面疏水性下降，這主要是因為脫酰胺過程暴露的疏水基團重新聚集，導致水解后親水性肽增多，從而使得疏水性下降。

2.6 大米蛋白持水性、持油性分析

持水性、持油性是蛋白質(zhì)與水、油的結(jié)合能力。改性前后大米蛋白的持水性、持油性變化見圖5。

圖5 改性前后大米蛋白的持水性、持油性變化Fig.5 Water and oil holding of rice protein samples before and after modification

從圖5 中可以得出，改性前后蛋白持水性、持油性分別為1.93、1.03 g/g 和1.77、1.17 g/g，持水性略有降低，可能原因為溶解性較高的蛋白質(zhì)會表現(xiàn)出較差的吸水性。改性后，大米蛋白的持油性略有提高，但總體改善效果不明顯，這與彭清輝[6]、聶小華等[19]的研究結(jié)果一致。此外對比僅高溫處理的大米蛋白，其持水性、持油性分別提高至2.24、1.57 g/g，主要原因為在高溫處理條件下，部分大米蛋白發(fā)生水解，蛋白結(jié)構(gòu)部分展開，從而提高了蛋白質(zhì)與水、油的結(jié)合能力。

2.7 大米蛋白亞基分子量分析

大米蛋白的主要亞基分布在30～37kDa 和10～30kDa之間，50 kDa 分布的亞基含量較少。改性前后大米蛋白亞基分子量變化見圖6。

圖6 大米蛋白樣品的凝膠電泳Fig.6 Gel electrophoresis of rice protein samples

從圖6 中可以得出，未處理蛋白（R）主要分子量分布在35 kDa 和20 kDa，少部分亞基分布在66、52、16、10 kDa。改性蛋白（D）條帶明顯下移，主要分布在6.5～20 kDa 之間，表明大米蛋白分子量大幅度降低，原因為脫酰胺改性過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生酸水解，蛋白間肽鍵斷裂，從而使蛋白質(zhì)分子量變小。該結(jié)果與Meenmanee 等[7]的研究一致，即椰子蛋白經(jīng)脫酰胺處理后，蛋白分子量也降低，但是本研究中的大米蛋白分子量降低幅度更大，可能是由蛋白種類和脫酰胺處理程度不同而引起。與未處理蛋白相比，對照組（C）亞基分子量分布無明顯變化，說明高溫條件下蛋白的部分水解還不足以改變蛋白的一級結(jié)構(gòu)。

2.8 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉變換紅外光譜是表征蛋白二級結(jié)構(gòu)變化的常用方法，對未處理蛋白（RP）、僅高溫處理蛋白（Control）、脫酰胺處理（Deamidation）進行全波段掃描，結(jié)果見圖7。

圖7 大米蛋白樣品的FTIR 圖譜和酰胺Ⅰ帶擬合峰圖Fig.7 FTIR spectra of protein samples and fitted peaks in the amide Ⅰbands

如圖7 所示，大米蛋白的紅外光譜特征吸收峰主要有3 個酰胺帶：1 700～1 600 cm-1酰胺Ⅰ帶、1 550～1 530 cm-1酰胺Ⅱ帶、1 300～1 260 cm-1酰胺Ⅲ帶。其中酰胺Ⅰ帶可以反映蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化。4 種二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)峰所在位置：β-折疊（1 640～1 610 cm-1）、無規(guī)則卷曲（1 650～1 640 cm-1）、α-螺旋（1 660～1 650 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1 700～1 660 cm-1）[20]。使用Peakfit 4.0 軟件對紅外光譜圖去卷積、二階導數(shù)擬合，得到擬合峰圖，計算4 種結(jié)構(gòu)對應(yīng)的峰面積可以得出各結(jié)構(gòu)含量[21]，結(jié)果如表2 所示。

表2 大米蛋白樣品的二級結(jié)構(gòu)組成Table 2 Secondary structure composition of rice protein

從表2 數(shù)據(jù)得出，未處理蛋白（RP）二級結(jié)構(gòu)含量中β-轉(zhuǎn)角>β-折疊>α-螺旋，不存在無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；對照組蛋白（Control） 二級結(jié)構(gòu)含量中β-折疊>β-轉(zhuǎn)角>α-螺旋，也不存在無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)；脫酰胺蛋白（Deamidation） 二級結(jié)構(gòu)含量中β-轉(zhuǎn)角> β-折疊>α-螺旋>無規(guī)則卷曲。對于僅高溫處理的蛋白，二級結(jié)構(gòu)變化不明顯，極少部分的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)化為β-折疊，較致密的α-螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為有序、較為舒展的β-折疊，這說明經(jīng)高溫處理后，蛋白發(fā)生一定程度的變性，蛋白結(jié)構(gòu)展開。脫酰胺處理后，蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大變化，接近1/2 的有序結(jié)構(gòu)β-折疊轉(zhuǎn)化成了無序結(jié)構(gòu)無規(guī)則卷曲，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角兩種結(jié)構(gòu)則變化不明顯，該結(jié)果表面脫酰胺反應(yīng)可以使得蛋白結(jié)構(gòu)大部分展開，由較為致密的有序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成無序結(jié)構(gòu)，Liu 等[22]研究表明β-折疊的緊密程度和穩(wěn)定性比α-螺旋差，比較容易發(fā)生改變，該結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變有利于改善蛋白的功能特性；經(jīng)脫酰胺改性后，大米谷蛋白無序結(jié)構(gòu)無規(guī)則卷曲增加，由原始的6.76%增加至15.53%，主要由致密的α-螺旋轉(zhuǎn)化而來。Hadidi 等[20]使用脫酰胺改性處理月見草蛋白，接近1/2 的α-螺旋轉(zhuǎn)化為有序舒展的β-折疊。總體上看，大米蛋白經(jīng)脫酰胺處理后，有利于形成更多的有序舒展和無序結(jié)構(gòu)，以提高蛋白的溶解性，從而進一步改善蛋白的功能性。

2.9 掃描電鏡分析

改性前后大米蛋白的在不同放大倍數(shù)下表面微觀結(jié)構(gòu)變化見圖8。

圖8 大米蛋白樣品在不同放大倍數(shù)下的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscopy images of rice protein samples at different magnifications

從圖8 可以看出，未處理蛋白和對照組在200、800 倍鏡下形態(tài)多為聚集、致密的不規(guī)則球狀結(jié)構(gòu)，放大至10 000 倍鏡時，可以發(fā)現(xiàn)其表面形態(tài)較為粗糙，存在多層狀和少量孔隙。經(jīng)酸法脫酰胺改性處理后，在200、800 倍鏡下大米蛋白表面變得松散，聚集的球狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為舒展的片狀，形成更多的小顆粒，10 000倍鏡下大米蛋白表面變得光滑，多層結(jié)構(gòu)消失，孔隙減少。該結(jié)果與He 等[8]的結(jié)果一致，經(jīng)酸法脫酰胺改性后，小麥蛋白表面形態(tài)在300 倍鏡下由粗糙的大顆粒球狀結(jié)構(gòu)變成細小顆粒的光滑球狀結(jié)構(gòu)，范瑩[13]對脫酰胺改性后的小米醇溶蛋白表面形態(tài)進行研究，也發(fā)現(xiàn)其由致密變成疏松、多孔結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

酸法脫酰胺處理改善大米蛋白溶解性效果顯著，中性環(huán)境（pH7）中由原來的0.58%提高至56.60%，堿性環(huán)境（pH 值為12、13）溶解性達到90.00%以上，pH值為3、7 時起泡性、乳化性改善效果較好。亞基分子量測定結(jié)果說明，改性后大米蛋白亞基分子量大幅度降低，主要分布在6.5～20 kDa 之間。紅外光譜研究發(fā)現(xiàn)，改性后蛋白結(jié)構(gòu)大部分展開，有序的β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成無序的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。通過掃描電鏡研究發(fā)現(xiàn)，改性后大米蛋白顆粒由聚集變得松散，致密的球狀結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則塊狀結(jié)構(gòu)，表面由粗糙變得光滑。因此，本文研究結(jié)果表明酸法脫酰胺改性可有效提高大米蛋白的溶解性，從而提高難溶性大米蛋白的應(yīng)用范圍，除此之外，該方法操作簡單、便于工業(yè)化。