王晨雨，付子航，陳成誠，陳姝彤，張平平，甘宇鑫，張軍兵，3，張愛琳，江慎華，3*

（1.天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392；2.九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江 332000；3.江西丹霞生物科技股份有限公司，江西 鷹潭 335000）

原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）是一種天然酚酸，廣泛存在于日常飲食和中草藥中（如姜黃）[1]，也是人體腸道微生物群降解多酚（特別是花青素或原花青素等類黃酮類）的代謝產(chǎn)物[2]，具有抗氧化[3]、抗過敏[4]、神經(jīng)保護[5]和抗骨質(zhì)疏松[6]等多種活性。

卵白蛋白（ovalbumin，OVA）是一種磷糖球蛋白，分子量為42～47 kDa，是蛋清蛋白的主要成分，由385個氨基酸組成，50%氨基酸疏水、33%氨基酸帶電，顯示出其作為親脂成分高效載體的潛力[7]。OVA 作為一種載體，已被廣泛用于研究小分子與OVA 之間的結(jié)合機制，包括結(jié)合方式和作用力。已有研究結(jié)果表明，OVA能夠有效改善小分子水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度[8]。

多酚與蛋白質(zhì)的相互作用可能會使蛋白質(zhì)的相關(guān)特性發(fā)生改變。Seczyk 等[9]指出，酚類化合物與蛋白質(zhì)的不可逆結(jié)合可能會影響蛋白質(zhì)的消化吸收及氨基酸的生物利用度。同時多酚與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，可能會對食品營養(yǎng)和功能特性產(chǎn)生影響。由此可見，生物活性成分與載體絡(luò)合具有較多優(yōu)勢，會發(fā)生很多變化，了解兩者之間的相互作用和結(jié)合機制至關(guān)重要[10]。龍梅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PCA 能夠猝滅魚精DNA的本征熒光，且猝滅機理為靜態(tài)猝滅。但是，PCA 與OVA 相互作用及其作用機制目前尚不清楚。

綜上，本文采用多光譜技術(shù)對PCA 與OVA 的相互作用及其機制進行研究，并測定相互作用前后對ABTS+自由基清除能力的影響，以期為拓寬PCA 和OVA 在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCA（純度≥97%）、OVA 凍干粉（純度＞98%）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS]、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光分光光度計（F-7000）：日本日立公司；酶標(biāo)儀（SpectraMax 190）：美谷分子儀器（上海）有限公司；pH計（PB-10）：Sartorius 儀器設(shè)備有限公司；雙光束紫外-可見分光光度計（TU-1901）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液配制

OVA 采用0.05 mol/L、pH7.4 磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）溶解、得到1×10-5mol/L 儲備液，PCA 采用去離子水溶解。

1.3.2 熒光光譜測定

參照Wang 等[12]方法，稍加修改。取3.0 mL 濃度為1×10-5mol/L 的OVA 溶液于熒光比色皿中，連續(xù)滴加10 μL 濃度1×10-2mol/L 的PCA 溶液、充分混勻，分別于284、291、298 K 條件下水浴靜置5 min 使其平衡。熒光分光光度計狹縫寬度設(shè)置為5 nm，激發(fā)波長（λex）分別設(shè)置為280 nm[色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）均被激發(fā)]和295 nm（僅Trp 被激發(fā)），發(fā)射光譜（λem）在300～450 nm 處以1 200 nm/min 的掃描速率讀取。在284、291、298 K 記錄OVA 的熒光發(fā)射光譜，以評價溫度對PCA 與OVA 相互作用的影響。

1.3.3 紫外-可見光譜測定

于298 K 條件下掃描樣液在190～500 nm 的紫外-可見光譜，以PBS 緩沖液作為空白對照。

1.3.4 同步熒光光譜測定

同時改變激發(fā)和發(fā)射單色器獲得284 K 同步熒光光譜，狹縫寬度均為5 nm。激發(fā)和發(fā)射波長的差值（△λ=λem-λex） 分別固定在15 nm 和60 nm。當(dāng)△λ=15 nm 時（λem=275 nm，λex=260～320 nm） 僅顯示Tyr殘基的特征光譜；當(dāng)△λ=60 nm 時（λem=310 nm，λex=250～320 nm）僅顯示Trp 殘基的特征光譜[13]。所有樣品恒溫孵育5 min 后進行測量。

1.3.5 三維熒光光譜測定

狹縫寬度為5 nm，掃描速度60 000 nm/min，測定激發(fā)波長200～400 nm、發(fā)射波長200～600 nm 的三維熒光光譜，增量為5 nm。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力測定

采用Moghadam 等[14]方法稍作修改，測定樣品對ABTS+自由基清除活性。采用5 mmol/L 磷酸緩沖液（pH7.4）溶解得到ABTS 原液，將7 mmol/L ABTS 原液與2.45 mmol/L 過硫酸鉀等體積混合，室溫避光靜置12～16 h，使其生成ABTS+自由基。再將ABTS+溶液在734 nm 波長監(jiān)測下稀釋至吸光值為0.70±0.02。分別將50 μL 濃度0.012 5～0.400 0 μg/mL 的樣品溶液與100 μL 稀釋后的ABTS+溶液混合，室溫避光反應(yīng)10 min，測734 nm 處吸光值。用磷酸緩沖液代替樣品為對照。采用以下公式計算樣品對ABTS+自由基清除活性。

式中：X 為ABTS+自由基清除率，%；A0和A 分別為對照和樣品的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均獨立重復(fù)3 次，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析與最小顯著性差異法檢驗比較各組差異，p<0.05 為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCA 對OVA 熒光猝滅效果的測定

對于大分子，熒光測量可以在分子水平上給出小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)大分子結(jié)合的信息，如結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)、相互作用力和作用機理等[12]。熒光發(fā)射光譜可用來獲得OVA 三級結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化的信息，氨基酸殘基是主要的熒光團[15]。OVA 的熒光來源于Trp、Tyr 和苯丙氨酸（Phe）殘基。同時，OVA 的本征熒光特性對其微環(huán)境非常敏感，一些因素（如蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變、亞單位結(jié)合、底物結(jié)合和變性）會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的本征熒光變化。因此，蛋白質(zhì)的本征熒光可以提供關(guān)于其結(jié)構(gòu)和動力學(xué)的大量信息[16]。圖1 為在pH7.4 條件下，加入PCA 的OVA 在λex=280 nm 處的熒光發(fā)射光譜。

圖1 不同溫度下PCA 與OVA 相互作用熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of interaction between PCA and OVA at different temperatures

由圖1 可知，在不同溫度下，OVA 的熒光強度隨PCA 濃度增加逐漸降低，最大發(fā)射波長沒有明顯變化，表明PCA 與OVA 之間存在相互作用，PCA 與OVA 的結(jié)合對熒光團周圍的微環(huán)境沒有太大影響。Li 等[17]對原花青素與OVA 相互作用的研究結(jié)果與本文結(jié)論一致。

2.2 PCA 對OVA 熒光猝滅機理分析

熒光猝滅表示大分子與猝滅劑分子的各種相互作用引起熒光量子產(chǎn)率的降低，即熒光強度的降低。OVA 的本征熒光對其微環(huán)境非常敏感，當(dāng)OVA 周圍微環(huán)境稍有改變時，其本征熒光會明顯減弱，蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變、生物分子結(jié)合與變性等因素是導(dǎo)致熒光強度減弱的原因[18]。該過程可由多種機制引起，通常包括動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅[10]。溫度效應(yīng)會導(dǎo)致靜態(tài)猝滅不同于動態(tài)猝滅。在動態(tài)猝滅過程中，溫度越高、擴散系數(shù)越大，熒光團和猝滅劑之間的碰撞次數(shù)越多，猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而增大；而在靜態(tài)猝滅過程中，熒光團和猝滅劑之間形成基態(tài)絡(luò)合物，猝滅常數(shù)隨溫度增加而減小[19]。使用Stern-Volmer 方程分析不同溫度下的熒光數(shù)據(jù)可闡明熒光猝滅機理[10]，公式如下。

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]

式中：F0和F 分別為不存在和存在PCA 時OVA 的穩(wěn)態(tài)熒光強度；Ksv 為Stern-Volmer 猝滅常數(shù)，L/mol；[Q] 為PCA 濃度，mol/L；Kq 為雙分子擴散猝滅速率常數(shù)，2.0×10-10L/（mol·s），τ0為沒有與PCA 結(jié)合時熒光團的平均壽命，10-8s。

在2.1 中發(fā)現(xiàn)PCA 對OVA 熒光會產(chǎn)生猝滅效果。采用Stern-Volmer 方程對猝滅作用機理進行分析。圖2 為在不同溫度（284、291、298 K） 下的Stern-Volmer線性圖，相關(guān)參數(shù)如表1 所示。

表1 不同溫度下PCA 對OVA 熒光猝滅的Stern-Volmer 猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants of OVA by PCA at different temperatures

圖2 不同溫度下PCA 對OVA 熒光猝滅的Stern-Volmer 曲線Fig.2 Stern-Volmer curve for the fluorescence quenching of OVA by PCA at different temperatures

Ksv 反映熒光團對猝滅劑（PCA）的敏感性，有助于確定PCA-OVA 體系中的猝滅機制。由圖2 和表1可以發(fā)現(xiàn)，在284～298 K 內(nèi)，Ksv 值隨溫度升高而降低，表明PCA 與OVA 的相互作用為靜態(tài)猝滅機制。Kq是衡量相互作用猝滅能力和效率的關(guān)鍵參數(shù)[20]。3 種溫度下計算得到的雙分子擴散猝滅速率常數(shù)[4.332×1011、4.098×1011、3.540×1011L/（mol·s）]均遠(yuǎn)大于最大擴散碰撞猝滅速率常數(shù)[2.0×1010L/（mol·s）]，進一步說明PCA 與OVA 相互作用機理為靜態(tài)猝滅。此外，Kq 值隨著溫度升高而降低，表明PCA 對OVA 的猝滅過程是一個放熱反應(yīng)。

2.3 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)測定

在靜態(tài)猝滅機制下，結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點數(shù)（n）可以使用雙對數(shù)方程計算[21]，公式如下。

log[（F0-F）/F]=logKa+nlog[Q]

式中：Ka 為表觀結(jié)合常數(shù)，L/mol，表示OVA 與PCA 結(jié)合的親和力；n 為結(jié)合位點數(shù)。

在2.2 中確定猝滅機制后，對PCA 與OVA 相互作用的表觀結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點數(shù)（n）進行測定。圖3 為不同溫度下PCA 與OVA 相互作用的雙對數(shù)曲線，結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù)如表2 所示。

表2 不同溫度下PCA 與OVA 相互作用的結(jié)合常數(shù)Table 2 Binding constants of interaction between PCA and OVA at different temperatures

圖3 不同溫度下PCA 與OVA 相互作用的雙對數(shù)曲線Fig.3 Double logarithmic curve of interaction between PCA and OVA at different temperatures

由表2 可知，Ka 值均大于1×104L/mol，表明PCA與OVA 具有較強的結(jié)合能力。Ka 值隨溫度升高而升高，表明PCA 與OVA 的絡(luò)合穩(wěn)定性與溫度成正比。此外，在284～298 K 溫度范圍內(nèi)，n 值均接近于1，顯示PCA與OVA 絡(luò)合物的化學(xué)計量比為1∶1，表明不同溫度下PCA 與OVA 只有一個結(jié)合位點。

2.4 熱力學(xué)參數(shù)及相互作用力判斷

通常，反應(yīng)過程中焓變（ΔH）和熵變（ΔS）是確定小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合方式的主要熱力學(xué)參數(shù)，由van’t Hoff 方程（Eq）計算得到[22]。

ln Ka=-ΔH/RT+ΔS/R

ΔG=ΔH-TΔS

式中：T 為熱力學(xué)溫度，K；R 為氣體常數(shù)，8.314 J/（mol·K）；ΔG 為吉布斯自由能變，kJ/mol；ΔH 為焓變，kJ/mol；ΔS 為熵變，J/（mol·K）。

通過對熱力學(xué)參數(shù)的研究，可以驗證作用過程的自發(fā)性，并探討蛋白質(zhì)與配位體相互作用的機理。判斷主要結(jié)合驅(qū)動力的熱力學(xué)定律包括：1）ΔH>0、ΔS>0 或ΔH>0、ΔS<0 時，表示疏水相互作用為主要作用力；2）ΔH<0、ΔS<0 時，范德華力和氫鍵占主導(dǎo)；3）ΔH<0、ΔS>0時，主要作用力為靜電相互作用[23]。在2.3 計算出不同溫度下結(jié)合常數(shù)Ka 后確定的熱力學(xué)參數(shù)如表3 所示。

表3 不同溫度下PCA 與OVA 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of interaction between PCA and OVA at different temperatures

由表3 可知，ΔG 為負(fù)值，表明PCA 與OVA 的結(jié)合是自發(fā)過程；ΔH 和ΔS 均大于0，表明自發(fā)過程是由熵驅(qū)動的吸熱反應(yīng)，主導(dǎo)作用力是疏水相互作用。Ge 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，疏水相互作用也是姜黃素及其衍生物與牛血清白蛋白相互作用的主要驅(qū)動力。

2.5 同步熒光光譜檢測PCA 對OVA 微環(huán)境變化

同步熒光光譜靈敏度高、選擇性好、干擾少，可以提供關(guān)于配體影響熒光團周圍微環(huán)境變化的重要信息[25]。因此，在2.1～2.4 基本確定PCA 與OVA 相互作用后，進一步通過同步熒光光譜檢測PCA 對OVA 構(gòu)象變化的影響，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 284 K 條件下PCA 與OVA 相互作用的同步熒光光譜Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of interaction between PCA and OVA at 284 K

配體引起的蛋白質(zhì)熒光猝滅意味著蛋白質(zhì)氨基酸殘基周圍的極性改變[26]。由圖4 可知，隨著混合體系中PCA 濃度逐漸增加，兩個波長間隔下的熒光強度均呈現(xiàn)規(guī)律性下降，同時觀察到Tyr 殘基最大發(fā)射波長發(fā)生紅移（從288.6 nm 到303.0 nm），而Trp 殘基的最大發(fā)射波長沒有發(fā)生明顯變化，表明PCA 與OVA 相互作用使Tyr 殘基周圍微環(huán)境極性增加、疏水性降低，而Trp殘基所處微環(huán)境幾乎沒有發(fā)生變化。此外，Δλ=60 nm時的猝滅間距比Δλ=15 nm 處的猝滅間距更明顯，意味著結(jié)合位置更接近Trp 殘基[27]。

2.6 三維熒光光譜檢測OVA 微環(huán)境變化

三維熒光光譜可以同時改變激發(fā)和發(fā)射波長，進而提供更科學(xué)、更可靠的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和微環(huán)境變化的細(xì)節(jié)，能夠證明蛋白質(zhì)在與配體結(jié)合時構(gòu)象發(fā)生了變化[25]。圖5 為PCA 不存在和存在時OVA 的三維熒光光譜，相關(guān)特征參數(shù)如表4 所示。

表4 PCA 不存在和存在下OVA 的三維熒光光譜特征參數(shù)Table 4 Characteristic parameters in three-dimensional fluorescence spectra of OVA in the absence and presence of PCA

圖5 284 K 條件下PCA 與OVA 相互作用的三維熒光光譜Fig.5 Three-dimensional fluorescence spectra of interaction between PCA and OVA at 284 K

由圖5 可知，主要有4 個特征峰，峰A 和峰B 分別表示利散射峰和二階瑞利散射峰，對應(yīng)波長分別為λex=λem 和2λex=λem，其特征是化合物溶解的溶劑進行輻射再發(fā)射，并且一小部分吸收的輻射在同一波長向各個方向散射[25]。峰1 提供了由于π-π* 躍遷而與二級結(jié)構(gòu)相關(guān)的多肽骨架結(jié)構(gòu)的光譜行為信息，峰2（λex=280.0 nm）反映的主要是Trp 和Tyr 殘基的本征熒光[28]。與OVA 相比，加入PCA 后峰1（λex 235.0 nm/λem 330.0 nm）的熒光強度從1 273.0（圖5a）明顯下降至181.7（圖5b），峰2 的熒光強度從4406.0（圖5a）明顯下降至1 748.0（圖5b），且從280.0 nm 明顯紅移至325.0 nm。結(jié)果表明PCA 與OVA 之間存在相互作用，且蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化、氨基酸殘基所處微環(huán)境的極性增加，該結(jié)果與同步熒光結(jié)果一致。

2.7 紫外-可見光譜檢測PCA 與OVA 相互作用

通過檢查熒光團的吸收光譜不僅可驗證猝滅類型，還可用于研究蛋白質(zhì)發(fā)色團周圍微環(huán)境的變化和蛋白質(zhì)配體復(fù)合體的形成。動態(tài)猝滅只影響熒光團的激發(fā)態(tài)，因此吸收光譜不會發(fā)生改變。然而，由于基態(tài)絡(luò)合物的形成，靜態(tài)猝滅經(jīng)常導(dǎo)致熒光團吸收光譜的擾動[29]。為了進一步驗證PCA 與OVA 相互作用的機理及對蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影響，在298 K 條件下測定OVA及PCA-OVA 復(fù)合物的紫外-可見光譜，結(jié)果如圖6所示。

圖6 298 K 條件下PCA 與OVA 相互作用的紫外-可見光譜Fig.6 Ultraviolet-visible spectrum of interaction between PCA and OVA at 298 K

由圖6 可知，280 nm 附近顯示出吸收峰是由于蛋白質(zhì)的生色團（芳香族氨基酸）對紫外線的吸收，常被用來反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[30]。隨著PCA-OVA 體系中PCA 濃度的增加，280 nm 處吸收峰略有增加，且在相互作用后發(fā)生了輕微紅移（從280 nm 到287 nm），表明PCA 和OVA 之間存在相互作用，并形成了基態(tài)復(fù)合物，再次證明PCA 對OVA 的熒光猝滅機制是靜態(tài)猝滅；同時表明PCA 與OVA 的相互作用影響了蛋白質(zhì)構(gòu)象，并改變了OVA 芳香族氨基酸殘基周圍的微環(huán)境，與同步熒光及三維熒光光譜結(jié)論一致。

2.8 PCA 與OVA 及其復(fù)合物對ABTS+自由基清除能力的影響

ABTS+自由基清除法是評價抗氧化能力最常見方法之一，本研究采用該方法對PCA、OVA 及PCA-OVA 復(fù)合物對ABTS+自由基清除能力進行測定，結(jié)果見圖7。

圖7 PCA、OVA 及PCA-OVA 復(fù)合物對ABTS+自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of PCA，OVA and PCA-OVA complexes against ABTS+ radical

由圖7 可知，游離PCA、OVA 和PCA-OVA 復(fù)合物均表現(xiàn)出ABTS+自由基清除活性，且清除能力均隨濃度增加而增強。在相同濃度下，PCA-OVA 復(fù)合物的抗氧化活性較PCA 有顯著提高（p＜0.05）。Liu 等[8]在研究姜黃素與OVA 結(jié)合前后清除DPPH 自由基活性變化時也發(fā)現(xiàn)了類似的研究結(jié)果。

3 結(jié)論

本文運用多光譜技術(shù)對PCA 與OVA 相互作用的機理進行研究，并通過ABTS+自由基清除試驗考察PCA 與OVA 相互作用對PCA 抗氧化性能的影響。結(jié)果顯示，在284～298 K 溫度范圍內(nèi)，PCA 與OVA 具有一個較強親和力的結(jié)合位點；PCA 與OVA 的結(jié)合過程通過疏水作用力自發(fā)進行，并使Tyr 殘基周圍微環(huán)境極性增加，疏水性降低。PCA 與OVA 結(jié)合改變了對ABTS+自由基的清除能力。本研究為拓寬PCA 和OVA在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。