黃曉燕，鄒孟龍，陳雅璐，寧 芯，陳柏輝，梁巧俐

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023； 2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，廣西 南寧 530001

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性復(fù)發(fā)性直腸及結(jié)腸炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便血等［1］。UC的發(fā)病機制尚不明確，通常被認(rèn)為與腸道菌群失調(diào)、免疫反應(yīng)紊亂等密切相關(guān)［2］。在臨床實踐中，常規(guī)治療UC 多使用氨基水楊酸、皮質(zhì)類固醇、免疫調(diào)節(jié)劑等藥物［1］。然而，長期的西藥治療不僅給患者帶來了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，而且治療后患者仍有較高的復(fù)發(fā)［3-4］。因此，探索UC新治療策略十分有必要。

鐵死亡是近年來被新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞程序性死亡，主要病理是脂質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）和鐵離子的積聚導(dǎo)致線粒體體積變小、雙層膜更致密、嵴減少及外膜破裂［5-6］。同樣地，研究表明鐵死亡誘導(dǎo)劑作用于谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4），會使細(xì)胞抗氧化能力降低、ROS 堆積，最終引起細(xì)胞氧化性死亡［7］。這表明ROS堆積是鐵死亡的基本特征。值得提出的是，胃腸道是ROS 產(chǎn)物的主要來源，而腸道黏膜抗氧化劑的含量較少，腸道更容易受到氧化應(yīng)激的損害［8-9］。與此同時，隨著UC的發(fā)展，腸道免疫細(xì)胞浸潤明顯增加，誘導(dǎo)了促氧化分子的產(chǎn)生，進而加快ROS堆積［10-11］?？偠灾?，細(xì)胞鐵死亡參與了UC的發(fā)生發(fā)展。

近年來，中醫(yī)藥文化在傳承創(chuàng)新中蓬勃發(fā)展，同時，生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等工具的出現(xiàn)，為中藥的臨床運用提供了更有力的證據(jù)。因此，不少學(xué)者開始探索中藥治療UC 的新策略。WANG等［12］發(fā)現(xiàn)莪術(shù)苷能下調(diào)GPX4 的表達、抑制細(xì)胞鐵死亡，從而發(fā)揮治療UC 的效用。與西藥相比，中藥不僅能降低患者的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，而且能從整體上有效治療UC［13］?；诖?，本研究利用生物信息學(xué)工具，對UC 患者和健康受試者的結(jié)腸組織進行基因表達分析，初步篩選得到與鐵死亡相關(guān)的UC 差異表達基因，并對相關(guān)中藥進行預(yù)測，旨在為探索治療UC新策略提供參考。

1 數(shù)據(jù)庫與軟件

1.1 數(shù)據(jù)庫GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；STRING 數(shù) 據(jù) 庫（http：//string-db.org/，Version 11.0）；Coremine 數(shù)據(jù)庫（http：//www.coremine.com/）。

1.2 軟件Cytoscape 軟件（Version 3.8.0）；R語言（x64 4.0.3）；Perl語言（Strawberry 5.32）。

2 方法

2.1 研究方案利用GEO 數(shù)據(jù)庫篩選UC 差異表達基因；通過常用的中文及英文數(shù)據(jù)庫檢索鐵死亡相關(guān)基因，然后繪制UC 差異基因與鐵死亡相關(guān)基因的Venn圖，取得交集基因。通過STRING數(shù)據(jù)庫對交集基因進行蛋白相互作用分析（proteinprotein interaction，PPI）；借助Coremine 數(shù)據(jù)庫預(yù)測潛在治療中藥，篩選出具有調(diào)控細(xì)胞鐵死亡防治UC 效用的中藥，最后對得到的中藥進行歸納。方案流程見圖1。

圖1 研究方案流程

2.2 UC 差異表達基因的篩選以“潰瘍性結(jié)腸炎”的英文“ulcerative colitis”為關(guān)鍵詞在GEO 數(shù)據(jù)中檢索，經(jīng)閱讀后篩選并下載編號GSE38713 的芯片數(shù)據(jù)。該芯片數(shù)據(jù)包含28 例患者基因表達信息，見表1。

表1 UC樣本信息

2.3 鐵死亡相關(guān)基因以“鐵死亡”為關(guān)鍵詞，在中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫、重慶維普數(shù)據(jù)庫及萬方數(shù)據(jù)庫中檢索，同時以“鐵死亡”的英文“ferroptosis”為關(guān)鍵詞，在PubMed、Embase 及Cochrane library數(shù)據(jù)庫中檢索，綜合得到鐵死亡相關(guān)基因。

2.4 UC 與鐵死亡的交集基因?qū)ⅰ?.2”項得到的UC 差異表達基因與“2.3”項得到的鐵死亡相關(guān)基因進行映射取交集，繪制Venn圖。

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將“2.4”項得到的交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，初步預(yù)測與UC相關(guān)的核心鐵死亡基因。

2.6 中藥治療預(yù)測將交集基因?qū)隒oremine數(shù)據(jù)庫，映射出相關(guān)中藥，設(shè)置P＜0.01 為閾值，篩選出具有調(diào)控細(xì)胞鐵死亡、防治UC 效用的中藥，并對預(yù)測中藥進行歸經(jīng)、功效歸納。

3 結(jié)果

3.1 鐵死亡相關(guān)基因經(jīng)檢索，共得到60 個與鐵死亡相關(guān)基因［6，14-16］，見表2。

表2 鐵死亡相關(guān)基因

3.2 UC 差異表達基因的篩選利用R 語言對GSE38713 芯片數(shù)據(jù)進行整理，將篩選條件設(shè)置為|log FC|≥1 且P＜0.05，對健康受試者和UC 患者的結(jié)腸組織基因表達進行分析，共獲得差異表達基因1355 個。其中在UC 患者結(jié)腸組織中上調(diào)基因796 個，下調(diào)基因559 個，繪制火山圖對數(shù)據(jù)進行可視化，見圖2，橫坐標(biāo)表示log FC，縱坐標(biāo)表示-log10（PValue），圓點表示基因，綠色圓點表示在UC患者結(jié)腸組織中下調(diào)的基因，紅色表示在UC患者結(jié)腸組織中上調(diào)的基因，黑色表示無明顯差異的基因；并對差異倍數(shù)最大的前10 個基因繪制熱圖，見圖3（其中每1 列表示1 個樣本，下方為樣本名稱，上方藍色表示健康受試者，粉色表示UC患者；每1行表示1個基因在不同樣本的差異，紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因，黑色表示無明顯差異基因；左側(cè)連線表示差異基因的聚類模式）。

圖2 差異表達基因火山圖

圖3 差異倍數(shù)排名前10的基因熱圖

3.3 UC 與鐵死亡的交集基因?qū)⒑Y選得到的1355 個UC 差異表達基因與60 個鐵死亡相關(guān)基因進行映射，得到8個交集基因，見圖4及表3。

表3 UC與鐵死亡的交集基因

圖4 Venn圖

3.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及可視化分析將交集基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫，物種選擇人類，最低置信度設(shè)為0.04，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。由圖5 可知，CD44 可能是細(xì)胞鐵死亡干預(yù)UC進展的核心基因。

圖5 PPI圖

3.5 中藥治療預(yù)測設(shè)置P＜0.01 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過Coremine 數(shù)據(jù)庫預(yù)測具有潛在調(diào)控細(xì)胞鐵死亡防治UC 效用的中藥，除ACSF2 映射不出相關(guān)中藥外，其余7 個基因均可映射出相關(guān)中藥，共得到69 味中藥。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化分析，見圖6。該網(wǎng)絡(luò)中黃芩、三百草、牡丹皮、人參、生姜、干姜、五味子、丹參、木香、三七的度值較高，提示與調(diào)控細(xì)胞鐵死亡防治UC 的關(guān)系最密切。將預(yù)測得到的中藥進行歸經(jīng)、功效歸納，如圖7—8 所示。與UC 鐵死亡相關(guān)中藥多歸脾經(jīng)、胃經(jīng)，且多屬于清熱、補虛、活血類。

圖6 預(yù)測中藥可視化

圖7 中藥歸經(jīng)

圖8 中藥功效

4 討論

鐵死亡是在研究小分子愛拉斯?。╡rastin）殺死含有致癌基因RAS 突變的腫瘤細(xì)胞的作用機制時被發(fā)現(xiàn)的［14-17］。盡管鐵死亡最早是在癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，但其已被證明對多種系統(tǒng)疾病具有重要意義，例如神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?8］、泌尿系統(tǒng)疾?。?9］、心血管疾?。?0］等。值得提出的是，在鐵死亡尚未被發(fā)現(xiàn)時，已有許多研究表明，鐵離子和ROS 可以通過腸道黏膜影響UC 的發(fā)生發(fā)展［21-22］。然而，鐵離子和ROS損傷機制尚未十分明確。XU等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在人類UC和UC模型小鼠中均可以觀察到結(jié)腸黏膜中線粒體萎縮、細(xì)胞死亡增加、鐵及ROS 被上調(diào)，與鐵離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄也明顯增加；表明鐵死亡通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞死亡，從而促進UC的發(fā)展。

本研究通過對健康受試者和UC患者的結(jié)腸組織基因表達進行差異分析，共獲得差異表達基因1355個，其中上調(diào)基因796個，下調(diào)基因559個。經(jīng)過檢索常用的中文和英文數(shù)據(jù)庫，獲得60個鐵死亡相關(guān)基因；與鐵死亡相關(guān)的UC 差異表達基因共8個，分別是CD44、DPP4、LPCAT3、PTGS2、SLC7A11、ABCC1、HMOX1、ACSF2，其中CD44 在PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值最高，表明其可能是鐵死亡參與UC 的核心基因。CD44又稱人類白細(xì)胞黏附分子，是一種跨膜受體糖蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用，參與了細(xì)胞增殖、遷移、血管生成等［24］。在UC的進展中，CD44作為潛在的協(xié)調(diào)刺激分子，招募免疫細(xì)胞的聚集、參與T細(xì)胞的活化介導(dǎo)慢性炎癥的持續(xù)發(fā)生［25］。對于鐵死亡而言，GPX4是介導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白。值得思考的是，GPX4活性的抑制不僅是由于ROS來源增多而導(dǎo)致，細(xì)胞不能正常催化ROS也可能是導(dǎo)致代謝障礙的原因［5］。亞單元SLC7A11的表達下調(diào)導(dǎo)致胞內(nèi)胱氨酸水平的降低，谷胱甘肽生物合成的缺失，間接導(dǎo)致GPX4的活性被抑制，進而激活鐵死亡［26］。LIU 等［27］研究表明，CD44 通過干預(yù)亞單元SLC7A11的穩(wěn)定性，從而調(diào)控細(xì)胞鐵死亡。

UC屬于中醫(yī)學(xué)“痢疾”等范疇。根據(jù)中醫(yī)診療專家共識［28］，UC多因虛實夾雜導(dǎo)致，系由脾胃虛弱，運化失司，水濕內(nèi)停，瘀血阻滯，日久化而為熱、為火，濕熱內(nèi)生而成痢疾。本研究預(yù)測的中藥多歸脾經(jīng)、胃經(jīng)，藥物功效多屬于清熱類、補虛類、活血類，這進一步說明了此次研究結(jié)果符合UC的中醫(yī)病機。通過軟件對預(yù)測得到的中藥進行拓?fù)浞治?，發(fā)現(xiàn)黃芩、三百草、牡丹皮、人參、生姜、干姜、五味子、丹參、木香、三七等中藥在調(diào)控細(xì)胞鐵死亡防治UC的過程中處于核心地位。黃芩歸心、肺、膽、大腸經(jīng)，具有清熱、瀉火、祛濕、解毒等功效，常被用于治療濕熱瀉痢。徐薇涵等［29］研究表明，黃芩素通過調(diào)控?zé)嵝菘说鞍?0參與結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的修復(fù)、機體免疫功能的調(diào)節(jié)，在治療UC中發(fā)揮抗炎作用。人參、生姜、干姜均具有健脾功效，用四君子湯治療UC亦收獲良效［30］。牡丹皮、丹參、三七均具有活血功效。便血是活動性UC患者的常見并發(fā)癥。別彩娟［31］以芪仙湯治療UC，有效率高達96.77%。本研究預(yù)測的中藥多屬于清熱類、補虛類、活血類，這不僅與UC的中醫(yī)病機高度符合，而且不少研究也表明以清熱法、補虛法、活血法治療UC可收獲良效。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)篩選鐵死亡參與UC的核心基因，為探索UC新治療策略提供方向。本研究通過Coremine 數(shù)據(jù)庫篩選具有調(diào)控細(xì)胞鐵死亡防治UC效用的中藥，為探索UC新治療策略提供選擇。但本研究存在一定的局限性：1）樣本量有限，可能存在基因表達偏倚；2）可能將生理性差異基因納入病理性差異基因；3）鐵死亡相關(guān)基因是課題組檢索獲得，可能存在遺漏，且目前關(guān)于鐵死亡基因的研究較少，這同樣可能存在偏倚；4）通過Coremine 數(shù)據(jù)庫預(yù)測潛在的治療中藥，但部分中藥在UC中缺乏實驗研究證實。