李玉梅，高玉民，朱彥威，毛偉芳，趙文利，吳云強(qiáng)，王志芬*

（1.濟(jì)南市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東濟(jì)南 250316；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物所，山東濟(jì)南 250100）

0 引言

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，屬于大宗常用中藥材之一，其根含有多種生物活性物質(zhì)，主要化學(xué)成分為丹參酮、丹酚酸等化合物，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩和涼血消癰的功效[1]。隨著丹參藥用價(jià)值的不斷開(kāi)發(fā)利用，市場(chǎng)需求量增加，丹參野生資源不能滿足市場(chǎng)需求，而人工栽培由于藥田生物群落多樣性差，病蟲(chóng)害的大量發(fā)生以及只種不選的生產(chǎn)模式，大大降低了丹參的品質(zhì)和產(chǎn)量，嚴(yán)重制約了丹參產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展，促使丹參組培快繁成為人們研究的熱點(diǎn)[2]。利用現(xiàn)代生物技術(shù)組培快繁對(duì)丹參進(jìn)行提純復(fù)壯，提供優(yōu)質(zhì)無(wú)病蟲(chóng)害的種苗，為大批量生產(chǎn)丹參優(yōu)質(zhì)種苗奠定基礎(chǔ)，對(duì)提高丹參產(chǎn)量及品質(zhì)有著非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

以丹參植株葉片為外植體，以6-BA、NAA和2，4-D三種激素不同濃度配比，優(yōu)化配方和培養(yǎng)條件，研究不同種類和濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)丹參葉片愈傷誘導(dǎo)、芽增殖以及生根的影響。丹參優(yōu)選植株，由濟(jì)南岳圣中藥材種植合作社提供。MS培養(yǎng)基，購(gòu)自石家莊紐春特組培科技有限公司的成品培養(yǎng)基。高壓滅菌鍋為江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)，型號(hào)LS-150LD。試驗(yàn)用藥品2.4-D、6-BA、NAA由濟(jì)南普朗特生物科技有限公司提供，純度≥99%。

1.2 方法

1.2.1 外植體處理和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)

1）愈傷培養(yǎng)基制備。根據(jù)丹參培養(yǎng)基配方配置培養(yǎng)基備用。培養(yǎng)基pH值滅菌前調(diào)制為6.2，滅菌后5.8～6.0。接種后，統(tǒng)計(jì)不同激素配比的培養(yǎng)基對(duì)丹參愈傷誘導(dǎo)的影響。

2）丹參葉片選取與處理。選取芽尖幼嫩葉片，放入三角瓶，用密紗布扎口。①用自來(lái)水流水沖洗15 min，除去外植體上的泥沙灰塵。②將初次處理過(guò)的外植體置于超凈工作臺(tái)，先放入無(wú)菌瓶，用無(wú)菌水搖晃沖洗2～3次；再用濃度75%的乙醇溶液晃動(dòng)滅菌15～20 s，無(wú)菌水沖洗4次；然后用0.1%的氯化汞溶液滅菌處理（因丹參葉片密被絨毛，滅菌時(shí)，可加入幾滴吐溫-80，有助于徹底殺菌）。處理時(shí)間分別設(shè)置為5 min、7 min、10 min、12 min、15 min，共5個(gè)梯度，無(wú)菌水分別沖洗4～5次，其間一直晃動(dòng)。③在無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，用無(wú)菌剪子把葉片剪成3 mm×5 mm大小，修掉葉緣，用無(wú)菌鑷子放入目標(biāo)愈傷培養(yǎng)基，進(jìn)行愈傷培養(yǎng)。④1個(gè)培養(yǎng)瓶接種1個(gè)外植體，共50瓶。于培養(yǎng)室報(bào)紙遮光暗，培養(yǎng)7天后，定期觀察外植體愈傷產(chǎn)生情況及污染情況，15天后開(kāi)始統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率和污染率。愈傷誘導(dǎo)率＝愈傷產(chǎn)生數(shù)／接種數(shù)×100%，污染率＝污染數(shù)／接種數(shù)×100%。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度（23±2）℃。

1.2.2 芽增值繼代培養(yǎng)

不同濃度的6-BA和NAA激素組合對(duì)丹參芽增殖的影響，采用雙因素完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別設(shè)置激素6-BA濃度為2.0、1.5、1.0、0.7、0.5、0 mg/L，對(duì)應(yīng)NAA濃度分別為1.0、0.8、0.5、0.3、0.3、0 mg/L，組成6個(gè)試驗(yàn)處理，MS為基本培養(yǎng)基，配置滅菌處理待用。在芽增殖培養(yǎng)基的組培瓶?jī)?nèi)，1瓶接種愈傷塊4個(gè)，1塊大小0.3 mm×0.5 mm，1個(gè)處理20瓶，共160瓶。pH值為5.8～6.2。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度（24±2）℃，光照強(qiáng)度為培養(yǎng)瓶外4 500 lx、培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)1 500～2 000 lx，光照時(shí)間為12 h/天。培養(yǎng)20 天后，觀察生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)芽增殖系數(shù)。芽增殖系數(shù)＝芽增殖數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.3 丹參組培苗的生根培養(yǎng)

將高約3 cm的組培苗，無(wú)菌操作條件下，剪成1 cm長(zhǎng)節(jié)段，至少帶一葉一芽，分別接種在含有不同NAA濃度的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行生根培養(yǎng)。1/2MS為基本培養(yǎng)基，NAA濃度分別為0、0.3、0.5、0.7 mg/L，共4個(gè)處理，1個(gè)處理接種20瓶，接種5 株/瓶，共100株，pH值為6.2。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度（24±2）℃，光照強(qiáng)度4 500 lx，光照時(shí)間12 h/天。培養(yǎng)7天后，開(kāi)始觀察無(wú)菌苗的生根情況，40天后，統(tǒng)計(jì)生根率。生根率＝生根數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.4 溫度對(duì)丹參組培苗生長(zhǎng)的影響

將高0.5 cm左右的帶腋芽莖段接種在芽增殖培養(yǎng)基中，置于不同溫度的光照培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度分別為19℃、21℃、23℃、25℃、27℃、29℃，光照強(qiáng)度4 500 lx，光照時(shí)間為12 h/天。培養(yǎng)10天后觀察生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)丹參組培苗生長(zhǎng)情況。

1.2.5 光照強(qiáng)度對(duì)組培苗生長(zhǎng)情況的影響

將高度1 cm左右的帶腋芽莖段或幼苗分別接種在芽生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。設(shè)定光照強(qiáng)度分別為1 500 lx、3 000 lx、4 500 lx、8 000 lx，設(shè)定光照時(shí)間分別為12 h/天，培養(yǎng)溫度為（23±2）℃。培養(yǎng)10天后，觀察丹參組培苗生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同0.1%氯化汞溶液滅菌時(shí)間對(duì)丹參葉片污染率和愈傷誘導(dǎo)率的影響

可以看出，0.1%的氯化汞溶液給丹參葉片滅菌，最佳滅菌時(shí)間10～12 min。在一定時(shí)間段內(nèi)，隨著滅菌時(shí)間的增加，污染率降低，愈傷誘導(dǎo)率增加。當(dāng)滅菌時(shí)間超過(guò)12 min，出現(xiàn)褐化，隨著滅菌時(shí)間增加，褐化增加，誘導(dǎo)率降低（表1）。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)污染率和愈傷誘導(dǎo)率的影響

2.2 不同激素配比的培養(yǎng)基對(duì)丹參愈傷誘導(dǎo)的影響

可以看出，配方①愈傷產(chǎn)生率高，愈傷組織生長(zhǎng)狀況良好，芽分化時(shí)間早，適合丹參葉片愈傷組織培養(yǎng)（表2）。

表2 不同激素配比的培養(yǎng)基配方對(duì)丹參愈傷誘導(dǎo)的影響

2.3 6-BA和NAA激素的不同濃度組合對(duì)丹參芽增殖的影響

可以看出，6-BA 1.0 mg/L和NAA 0.5 mg/L激素組合配方，為最佳組合，增值倍數(shù)高達(dá)12.6倍，芽葉生長(zhǎng)正常，無(wú)玻璃化現(xiàn)象（表3）。

表3 6-BA和NAA激素的不同濃度組合對(duì)丹參芽增殖的影響

2.4 NAA的不同濃度對(duì)丹參組培苗生根的影響

可以看出，NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，生根率98%，根長(zhǎng)4～6 cm，基部根粗0.1～0.2 mm，單株根條數(shù)4根以上，適宜丹參組培苗生根培養(yǎng)（表4）。

表4 NAA的不同濃度對(duì)丹參組培苗生根的影響

2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

可以看出，培養(yǎng)溫度在（23±2）℃范圍內(nèi)，葉色、株高、莖粗及節(jié)間長(zhǎng)度都符合丹參試管苗的生長(zhǎng)需要（表5）。

表5 培養(yǎng)溫度對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

2.6 光照強(qiáng)度對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

可以看出，光照強(qiáng)度為4 500 lx時(shí)，丹參組培苗生長(zhǎng)指標(biāo)正常（表6）。

表6 光照強(qiáng)度對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論

丹參組織培養(yǎng)技術(shù)可以使選育的丹參良種在短時(shí)間內(nèi)大量快速繁殖，也可解決因長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖導(dǎo)致的品種退化和攜帶病毒等問(wèn)題，而確定適合的組織培養(yǎng)條件是關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)在前人研究[2-4]基礎(chǔ)上，研究了激素濃度和培養(yǎng)條件對(duì)丹參組培技術(shù)的影響。

1）用0.1%的氯化汞溶液給丹參葉片滅菌，最佳滅菌時(shí)間10～12 min。

2）丹參組培最佳培養(yǎng)基：葉片誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為MS（40 g/L）+6-BA（3.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L）+2.4-D（0.01 mg/L）；叢生芽最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA（1.0 mg/L）+NAA（0.5 mg/L）；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA（0.5 mg/L）。

3）丹參組培苗的最佳生長(zhǎng)溫度為（23±2）℃，光照強(qiáng)度4 500 lx左右，組培苗株高、葉色、莖粗及節(jié)間長(zhǎng)度符合丹參組培苗生產(chǎn)要求，移栽煉苗成活率高。丹參組織培養(yǎng)只有在適宜的溫度和光照強(qiáng)度下，組培苗才能生長(zhǎng)正常。

4）對(duì)溫度與光照影響丹參組培苗生長(zhǎng)進(jìn)行了觀察，溫度與光照對(duì)生根的影響則有待進(jìn)一步研究。建議要考慮丹參品種間差異的影響，以使丹參組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，建立指導(dǎo)性強(qiáng)的丹參組織培養(yǎng)技術(shù)體系，提高丹參組培育苗技術(shù)要領(lǐng)，節(jié)約成本且創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)效益。