王穎，劉繁紅，楊燕麗，何筱毅，何成軍，楊蕾*，袁軍，戴忠

1.四川省藥品檢驗研究院 國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質量評價重點實驗室，四川 成都 610097；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

追風透骨丸是《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版（一部）收載的品種，是由制川烏、白芷、制草烏、香附（制）等23 味中藥粉碎后制成的水蜜丸，用于風寒濕痹、肢節(jié)疼痛、肢體麻木[1]。處方中細辛含有馬兜鈴酸，馬兜鈴酸是馬兜鈴科植物中含有的系列結構相似的硝基菲類化合物。由于馬兜鈴酸暴露造成的中毒事件引發(fā)世界范圍的廣泛關注。其中馬兜鈴酸Ⅰ被證實有明確的腎毒性、致突變性及致癌性[2]。1999 年英國率先全面禁用含馬兜鈴酸的中草藥及其制品；2001 年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）也發(fā)布了禁用含馬兜鈴酸中草藥的通告，隨后幾年歐美及世界許多國家和地區(qū)，包括中國臺灣和中國香港都先后禁用含馬兜鈴酸的中草藥。2003—2004 年，國家藥品監(jiān)督管理局先后禁止關木通、廣防己、青木香的藥用；對含有馬兜鈴、尋骨風、天仙藤和朱砂蓮的中藥制劑嚴格按處方藥管理；要求細辛只能用根及根莖[3]，《中國藥典》2020 年版（一部）細辛檢查項下規(guī)定馬兜鈴酸Ⅰ限量（不得過0.001%）[1]。此外對含細辛的中成藥進行馬兜鈴酸含量限度研究[4-7]。

查閱文獻，液相色譜法（LC）在馬兜鈴酸類化合物的研究中應用較廣，主要用于中藥材、飲片及含量較高制劑的測定?！吨袊幍洹?020 年版（一部）細辛和辛芩顆粒均采用LC檢測馬兜鈴酸Ⅰ。此外，由于液質聯用儀高靈敏度、高選擇性、高通量的優(yōu)勢，也已被廣泛應用于馬兜鈴酸類成分的檢測和分析，現行涉及馬兜鈴酸類化合物的補充檢驗方法均采用LC-質譜法（MS/MS）[5-11]。追風透骨丸成分復雜，故本研究采用超高效液相色譜（UPLC）-MS/MS對其中馬兜鈴酸和馬兜鈴內酰胺2種結構類型的4個成分進行檢測研究。

1 材料

1.1 儀器

Triple Quad 5500 型超高效液相色譜串聯質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；Milli-Q 型超純水儀（美國Millipore公司）；CPA225D型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 試藥

7批追風透骨丸（A企業(yè)，編號為A001～A003；B企業(yè)，編號為B001～B004）。

對照品馬兜鈴酸Ⅰ（中國食品藥品檢定研究院，批號：110746-201912，純度：99.1%）；馬兜鈴酸Ⅱ（批號：PS010654，純度：99.98%）、馬兜鈴酸Ⅲ（批號：PS220701-21，純度：96.33%）、馬兜鈴內酰胺Ⅰ（批號：PS010658，純度：99.69%）均購于成都普思生物科技股份有限公司；乙腈、甲酸、甲酸銨均為色譜純；甲醇為分析純；水為超純水。

川烏、白芷等22 味中藥購于荷花池中藥材市場，經四川省檢驗研究院黎躍成主任藥師鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1 UPLC-MS/MS分析條件

2.1.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨，B）為流動相梯度洗脫（0～5 min，50%A；5～10 min，50%～70%A；10～12 min，70%A）；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進樣量為1 μL。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式；掃描模式為多反應監(jiān)測（MRM）；離子源電壓：5 500.0V；離子源溫度：550.0 ℃；氣簾氣壓力：20 psi（1 psi≈6 894.757 Pa）；噴霧器流量：55 psi；輔助加熱氣：55 psi；各化合物質譜參數見表1。

表1 追風透骨丸中待測化合物的質譜檢測參數

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ和馬兜鈴內酰胺Ⅰ對照品適量，溶于甲醇制成的質量濃度為5 μg·mL-1的混合對照品儲備溶液。精密吸取上述對照品儲備液，用70%甲醇稀釋成質量濃度為10 ng·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，水浴回流提取1 h，取出，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過（0.22 μm），取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 分別取細辛以外的22 味中藥，按處方比例制備缺細辛陰性樣品，按2.2.2項下方法制備缺細辛陰性樣品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 分別取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按2.1項下色譜質譜條件進樣，即可得總離子流色譜圖（TIC），進行離子對選擇后得到各成分的提取離子色譜圖（XIC）。結果顯示，在馬兜鈴酸Ⅰ的兩對離子通道（m/z359.0→298.1，m/z359.0→296.1）和馬兜鈴內酰胺Ⅰ的兩對離子通道（m/z294.0→279.0，m/z294.0→250.9），供試品溶液中均檢出與對照品溶液保留時間一致的色譜峰。在馬兜鈴酸Ⅱ的兩對離子通道（m/z329.0→268.1，m/z329.0→294.0）、馬兜鈴酸Ⅲ的兩對離子通道（m/z359.0→296.1，m/z359.0→298.1），供試品溶液未檢出與對照品溶液保留時間一致的色譜峰，陰性樣品溶液在各離子通道中均未檢出與對照品溶液一致的色譜峰，陰性無干擾，見圖1。

圖1 混合對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液的XIC

2.3.2 線性關系和定量限水平的考察 精密吸取2.2.1項下的混合對照品溶液適量，用70%甲醇稀釋成質量濃度分別為2、5、10、25、50、100、250 ng·mL-1的混合對照品溶液。按2.1項下色譜質譜條件進樣，以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，結果4個成分r均大于0.999 5，線性關系良好。計算各離子通道目標峰信噪比（S/N），考慮化合物定性需定性定量兩對離子通道均有檢出，故確定定量限時定量離子通道按S/N=10計算，定性離子通道按S/N=3計算，以同時滿足定量離子通道S/N≥10與定性離子通道S/N≥3的進樣質量濃度為定量限。以馬兜鈴酸Ⅰ為例，質量濃度為2.06 ng·mL-1對照品溶液進樣量1 μL時，定量定性離子通道的S/N分別為34.2和12.3，計算定量離子通道S/N=10的質量濃度為0.6 ng·mL-1，定性離子通道S/N=3 的質量濃度為0.5 ng·mL-1，則最低定量水平為0.01 μg·g-1，結果見表2。

表2 追風透骨丸中4個馬兜鈴酸成分的回歸方程、線性范圍及定量限

2.3.3 精密度試驗 精密吸取2.2.1 項下混合對照品溶液，用70%甲醇配制10 ng·mL-1的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果顯示馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ和馬兜鈴內酰胺Ⅰ峰面積的RSD 分別為2.12%、4.32%、1.96%、2.45%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，依次于0、3、6、9、11、14、18、21、24 h 進樣測定。結果馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內酰胺Ⅰ峰面積的RSD 分別為2.44%、2.30%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取粉碎混勻的樣品，平行6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜質譜條件進樣分析。結果未檢出馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ，檢出馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內酰胺Ⅰ的平均質量分數分別為0.093 5、1.066 0 μg·g-1，RSD 分別為2.42%、2.67%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品粉末取粉碎混勻的樣品約1.5 g，平行6 份，分別添加混合對照品溶液100 μL，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜質譜條件進樣分析，計算回收率及RSD，見表3。

表3 追風透骨丸中4個馬兜鈴酸成分的加樣回收率試驗結果

2.4 樣品測定

7 批追風透骨丸樣品分別按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜質譜條件進樣分析，結果馬兜鈴酸Ⅰ質量分數為0.09～0.41 μg·g-1，馬兜鈴內酰胺Ⅰ質量分數為0.62～1.30 μg·g-1，樣品中均未檢出馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ，見表4。

表4 追風透骨丸樣品中4個成分質量分數測定結果 μg·g-1

3 討論

3.1 檢測方法的選擇

對追風透骨丸處方進行分析，處方中細辛用量為100 g，制成總量為1920 g，加上煉蜜最大制成總量為3072 g，在不考慮轉移率的情況下，參考細辛中馬兜鈴酸Ⅰ的限量，制劑中馬兜鈴酸Ⅰ理論質量分數不超過0.33 μg·g-1，含量很低；同時由于追風透骨丸處方成分復雜，故選擇靈敏度高、抗干擾能力強的基于MRM的LC-MS/MS。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

在進行化合物質譜參數優(yōu)化時發(fā)現，流動相中加入銨鹽能提升馬兜鈴酸類化合物的離子化效率，提高檢測靈敏度，使用甲酸銨緩沖液或乙酸銨緩沖液對色譜分離基本沒有區(qū)別，確定流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸銨）體系。4個成分中馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅲ互為同分異構體，具有相同的相對分子質量和離子碎片，需要通過色譜柱實現分離后才能檢測。分別在Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、WatersACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、島津ShimPack GIST C18（100 mm×2.1 mm，2 μm）、Agilent ZORBAX SB C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）4 種色譜柱上考察對上述2 個成分的分離，結果均獲得良好的分離效果?？紤]樣品采用甲醇直接提取，等度洗脫時，樣品溶液可能會存在一些保留較強的極性基質富集于色譜柱中，故洗脫程序采用前段等度、后段梯度的洗脫方式，可最大限度避免和基質干擾物共流出。

3.3 質譜條件的優(yōu)化

馬兜鈴酸是硝基菲類化合物，在正離子模式下易得到1 個H+形成準分子離子峰[M+H]+，或加NH4+形成的[M+NH4]+，所以用正離子模式。分別取用4 個對照品溶液直接進樣，在ESI+模式全掃描方式下，馬兜鈴內酰胺Ⅰ得到較高豐度的[M+H]+準分子離子峰m/z294，馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ得到較高豐度的[M+NH4]+離子峰m/z359、m/z329、m/z359。在確定母離子的基礎上采用子離子掃描方式對子離子的碰撞能進行優(yōu)化，選擇豐度較高的碎片離子為定量離子。

3.4 提取溶劑的選擇

結合文獻報道[5-7,11]，考察不同溶劑對追風透骨丸中馬兜鈴酸的提取效果。精密稱取粉碎均勻的樣品適量，分別以甲醇、乙醇、70%甲醇為溶劑，各加入溶劑25 mL 后稱質量，超聲處理40 min（500 W，40 kHz），放冷后用相應溶劑補足減失的質量，混勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，按2.1 項下條件進樣分析。結果顯示，對馬兜鈴酸Ⅰ的提取效率甲醇≈70%甲醇>乙醇，對馬兜鈴內酰胺Ⅰ的提取效率甲醇>乙醇>70%甲醇。

3.5 方法的準確性

馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ和馬兜鈴內酰胺Ⅰ在20 ng·mL-1添加水平的平均回收率分別為104.2%、75.7%、112.0%、105.4%，RSD 分別為2.8%、3.6%、3.7%、6.1%，表明方法重復性良好，但馬兜鈴酸Ⅱ的回收率較馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅲ和馬兜鈴內酰胺Ⅰ的回收率明顯偏低?？紤]基質可能造成的影響，比較馬兜鈴酸Ⅱ定量離子對在純溶劑中的響應值（A1）與在陰性基質中的響應值（A2），結果顯示A2/A1約為1.05，未表現出明顯的基質效應，排除基質抑制的影響。研究顯示，馬兜鈴酸Ⅱ在定量限添加水平回收率約為65%，同時在擬定條件下馬兜鈴酸Ⅱ的質譜響應明顯低于其他3 個成分，分析馬兜鈴酸Ⅱ回收率偏低的原因可能與馬兜鈴酸Ⅱ的檢測靈敏度及較低的加標水平有關[12]。

4 結論

基于本研究建立的方法，實現追風透骨丸中馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲ和馬兜鈴內酰胺Ⅰ的檢測，結果未檢出馬兜鈴酸Ⅱ和馬兜鈴酸Ⅲ，檢出馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴內酰胺Ⅰ。馬兜鈴酸Ⅰ含量基本低于理論值，馬兜鈴內酰胺Ⅰ含量相對較高。馬兜鈴酸化合物種類已報道的約178 種，按結構主要分為馬兜鈴酸類和馬兜鈴內酰胺類，化合物種類不同毒性差異較大。已有研究表明，馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ具有腎臟毒性和潛在致癌性[13-16]，馬兜鈴內酰胺Ⅰ的毒理學研究尚不充分[17]。有必要首先對具有明確毒性的馬兜鈴酸Ⅰ建立快速準確的測定方法，研究制定科學合理的限量。