夏志丹，張忠元

武漢市紅十字會醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430015

木犀草素（luteolin，LUT）是從木犀草科草本植物木犀草Reseda odorataL.中提取得到的一種黃酮類化合物[1]，具有消炎、抗過敏、抗菌、抗病毒等多種生物學活性[2]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)LUT 對乳腺癌[3]、肝癌[4]、前列腺癌[5]等腫瘤細胞具有明顯抑制作用。然而，LUT 溶解度為6 μg·mL-1（37 ℃，pH 6.8）時，其較差的溶解性不利于口服吸收[6]，進而嚴重影響藥物的臨床治療效果。近年來，研究人員將木犀草素制備成藥物共晶[7]、固體脂質(zhì)納米粒[8]、固體分散體[9-10]等不同新型給藥系統(tǒng)以提高藥物的口服生物利用度。然而，這些制劑有其局限性，如共晶是否會改變藥理作用尚不明確，固體脂質(zhì)納米粒存在放大生產(chǎn)困難、儲存穩(wěn)定性差等問題，固體分散體穩(wěn)定性較差，久貯會發(fā)生老化現(xiàn)象。

膠束是由兩親性嵌段共聚物在水中溶解后自發(fā)形成的具有“核-殼結(jié)構(gòu)”的高分子聚集體，可以增加藥物的溶解度及滲透性，提高口服生物利用度，延長藥物在血液循環(huán)中的半衰期，避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的非特異性攝取，改變藥物的體內(nèi)藥動學和組織分布，作為一種提高藥物溶解度和生物利用度的有效手段已引起廣大藥學研究者的廣泛關(guān)注[11]。為此，本研究以Pluronic F127 和Pluronic P123 作為膠束載體材料[12]，將木犀草素制備成納米膠束（nanomicelles，NMs），并通過大鼠體內(nèi)藥動學評估其口服生物利用度，為進一步提高木犀草素的抗腫瘤的藥用價值研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

K2025 型高效液相色譜儀（海能未來技術(shù)集團股份有限公司）；ZNCL-GS 型智能控溫集熱式水浴油浴鍋（河南佰年儀器有限公司）；RE-52A 型實驗室旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；Zetasizer Nano ZS90 型動態(tài)光散射儀（英國馬爾文公司）；JEM-2100Plus 型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；M-F24G 型高速冷凍離心機（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）。

1.2 試藥

LUT 原料藥（南京廣潤生物制品有限公司，純度：98.5%）；聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物（Pluronic）F127、Pluronic P123 均購于德國巴斯夫公司；二氯甲烷（百靈威化學試劑公司）。

1.3 實驗動物

無特定病原體（SPF）級SD 大鼠12 只，2～3 月齡，體質(zhì)量為（200±20）g，由武漢大學實驗動物中心提供[實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（鄂）2019-0004，實驗動物使用許可證：SYXK（鄂）2019-0013]。本課題經(jīng)武漢大學動物實驗倫理委員會批準（批準號：2022030012）。

2 方法與結(jié)果

2.1 LUT-NMs的制備

使用溶劑蒸發(fā)-薄膜水化分散法制備LUT-NMs。稱取不同質(zhì)量比的聚合物Pluronic F127 和Pluronic P123 加入到含有二氯甲烷20 mL 的圓底燒瓶中，攪拌溶解；再稱取一定質(zhì)量的LUT加到上述溶液中，攪拌溶解，最終形成透明狀溶液；將該溶液在45 °C水浴溫度和-0.1 MPa真空度下減壓蒸發(fā)揮干有機溶劑，在瓶內(nèi)壁形成1層半透明狀薄膜；取蒸餾水10 mL加入到燒瓶中，持續(xù)振搖直至形成半透明狀混懸液，混懸液經(jīng)0.22 μm 濾膜濾過，并在10 000 r·min-1高速離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清液，即得到LUT-NMs。

2.2 包封率測定

2.2.1 色譜條件 Aquasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液（60∶40）；檢測波長為350 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為20 μL。

2.2.2 線性范圍 稱取LUT 原料藥約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加少量甲醇超聲溶解，放冷至室溫，加流動相至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。精密量取對照品儲備液，用流動相依次稀釋至0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 μg·mL-1，按 照2.2.1 項下色譜條件進樣分析，并以藥物質(zhì)量濃度（C）為橫坐標，藥物平均峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸擬合，得回歸方程為A=28 745C-3867（r=0.999 9），表明LUT 在0.05～10.00 μg·mL-1時與峰面積線性關(guān)系良好。將對照品儲備液用流動相逐步稀釋，按2.2.1項下色譜條件進樣分析，當信噪比約為3時確定為檢測限，當信噪比約為10時確定為定量限。經(jīng)測定，LUT的檢測限質(zhì)量濃度0.01 μg·mL-1，定量限質(zhì)量濃度為0.05 μg·mL-1。

2.2.3 包封率測定 移取LUT-NMs 溶液1.0 mL 至25 mL 量瓶中，加入少量甲醇進行超聲處理，破壞膠束結(jié)構(gòu)，加流動相定容，樣品經(jīng)2.2.1 項下色譜條件檢測藥物含量，根據(jù)公式（1）計算包封率。每份樣品測量3次，取平均值。

其中，W膠束表示包裹在膠束中的藥物含量，W投藥量表示投藥量。

2.3 粒徑及多聚分散系數(shù)（PDI）測定

取LUT-NMs 用25 ℃蒸餾水適當稀釋后，使用Zetasizer Nano ZS90型動態(tài)光散射儀測定其粒徑分布與PDI，在測定前樣品均需在25 °C條件下平衡180 s。計算平均值及SD。

目前，武術(shù)界普遍認為“峨眉武術(shù)起源于春秋戰(zhàn)國時期，是指峨眉山區(qū)域的峨眉山道、僧武術(shù)與民間武術(shù)且以峨眉命名的各種拳術(shù)、器械、功法和武術(shù)理論等武術(shù)內(nèi)容與形式的總稱”。[3]

2.4 中心復(fù)合實驗設(shè)計

2.4.1 實驗設(shè)計優(yōu)化LUT-NMs 的處方 在前期實驗過程中發(fā)現(xiàn)，聚合物與藥物質(zhì)量比（X1）、Pluronic F127 與Pluronic P123 質(zhì)量比（X2）是影響LUT-NMs 的包封率（Y1）、粒徑分布（Y2）和PDI（Y3）的主要因素。因此，本研究采用二因素三水平中心復(fù)合響應(yīng)面法研究這2 個自變量對LUT-NMs 的Y1、Y2和Y3的影響[13]。根據(jù)前期實驗確定2 個變量的范圍，即X1為10∶1～50∶1，X2為1∶1～9∶1，實驗設(shè)計變量見表1。共進行了11 次實驗，實驗安排及結(jié)果見表2。

表1 LUT-NMs中心復(fù)合實驗設(shè)計變量與水平

表2 LUT-NMs中心復(fù)合實驗設(shè)計方案及結(jié)果

2.4.2 模型選擇 實驗所得數(shù)據(jù)經(jīng)中心復(fù)合實驗設(shè)計軟件處理，并使用線性回歸擬合線性（Linear）、雙因素交互作用（2FI）和多元二次模型（Quadratic）對Y1、Y2和Y3進行評估[14]，選擇具有最高調(diào)整復(fù)相關(guān)系數(shù)（R2）和預(yù)測R2的模型進行判斷（表3），確定Y1，Y2和Y3均采用多元二次模型進行擬合，得到的多元二次方程：Y1=1.359 0+2.256 4X1+0.955 7X2-0.021 6X1X2；Y2=82.977 6-0.869 1X1-0.534 7X2+0.009 0X1X2；Y3=0.265 1-0.002 3X1+0.000 9X2-0.000 3X1X2。通過統(tǒng)計分析得到2 個自變量分別與3 個因變量之間的方差分析結(jié)果，見表4；關(guān)系圖見圖1～圖3。

圖1 Y1、Y2和Y3的響應(yīng)面圖

圖2 Pluronic F127與Pluronic P123形成的聚合物膠束臨界膠束濃度（CMC）值

圖3 LUT-NMs的透射電鏡照片（×100 000）

表3 LUT-NMs中Y1、Y2和Y3模型擬合選擇結(jié)果

表4 LUT-NMs實驗數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果

表4 方差分析表明，X1和X2對LUT-NMs 的Y1具有顯著影響（P<0.05）。由響應(yīng)面圖1A 可知，在X1較低的條件下，藥物的Y1較低，這是由于大部分藥物未被膠束包載，藥物會以沉淀形式析出[15]；當聚合物與藥物質(zhì)量比增大后，藥物包封率出現(xiàn)明顯增大趨勢。在X2較高的條件下，藥物的包封率增大，這是由于LUT 與疏水性較強的Pluronic F127 的親和力高于親水性較強的Pluronic P123，這就意味著當Pluronic F127 在聚合物中占比較高時，會有更多的藥物被聚合物膠束包載[16]。

表4 方差分析表明，X1和X2對Y2具有顯著影響（P<0.05）。由響應(yīng)面圖1B 可知，隨著X1增加，Y2出現(xiàn)減小趨勢，這是由于在聚合物膠束內(nèi)部可以包載的藥物較高，而減少了藥物分子在膠束表面的吸附量[17]，進而促使粒徑分布減小；隨著X2增加，Y2出現(xiàn)減小趨勢，這可能歸因于Pluronic F127 能夠形成更為緊密的膠束結(jié)構(gòu)，提高了膠束空間穩(wěn)定性[18]。

表4 方差分析表明，X1對Y3具有顯著影響（P<0.05）。由響應(yīng)面圖1C 可知，增加X1會降低Y3，并有利于粒徑的均勻分布（PDI降低）。

聚合物納米膠束經(jīng)口服給藥后，會被完整地吸收進入體循環(huán)，因此聚合物納米膠束的包封率高、粒徑分布小且均勻就會有利于其被充分吸收[19]。因此，本研究以制備LUT-NMs的包封率最大、粒徑分布和PDI 最小為目標值，經(jīng)實驗軟件優(yōu)化得到最佳處方：X1為45∶1，X2為5∶1。

2.5 性質(zhì)評價

通過繪制可知，Pluronic F127 與Pluronic P123（質(zhì)量比為5∶1）所形成的聚合物膠束的CMC 值為0.049 mg·mL-1，CMC 值相對較低，表明其形成的膠束具有較高的穩(wěn)定性，即使在體液極度稀釋后也能保持完整性[21]。

2.5.2 微觀形態(tài) 取LUT-NMs 滴加到涂碳的銅網(wǎng)格上均勻鋪展，之后在LUT-NMs 樣品表面滴加1 滴質(zhì)量濃度為20 mg·mL-1磷鎢酸染色液，負染10 min，紅外燈下干燥樣品，在透射電鏡下觀察LUT-NMs的微觀形態(tài)，見圖3。透射電鏡照片顯示，LUT-NMs呈球形，表面光滑，分散均勻，無聚集，大多數(shù)粒徑不超過50 nm。

2.5.3 稀釋穩(wěn)定性 為了評價LUT-NMs 在不同pH溶液中的抗稀釋能力，分別用pH 1.2、4.5、6.8 緩沖液將其稀釋至200 倍，在稀釋后的6、12、24 h 時間點觀察外觀，取樣檢測LUT-NMs的粒徑分布，評估其物理穩(wěn)定性，結(jié)果見表5。

表5 LUT-NMs稀釋穩(wěn)定性結(jié)果（,n=3） nm

表5 LUT-NMs稀釋穩(wěn)定性結(jié)果（,n=3） nm

稀釋穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，LUT-NMs 經(jīng)pH 1.2、4.5、6.8 緩沖液稀釋后24 h 內(nèi)，樣品均無絮凝分層，也無藥物沉淀析出，粒徑基本無變化，表明LUT-NMs 在不同pH 溶液中具有良好的抗稀釋能力。這不僅與膠束的較低CMC相關(guān)，還可能是由于聚合物與LUT 之間存在的氫鍵或范德華力等作用力，可以預(yù)測LUT-NMs經(jīng)口服給藥進入胃腸道內(nèi)可以保持完整性，并避免藥物泄漏[22]。

2.5.4 體外藥物釋放 采用動態(tài)膜透析法考察LUT-NMs 在不同pH 介質(zhì)溶液中的釋藥速率。分別采用pH 1.2 鹽酸溶液、pH 4.5 乙酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)，3 種介質(zhì)溶液中均加入質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1吐溫80 作為增溶劑，介質(zhì)溶液體積為200 mL，水浴溫度為37 ℃，磁子轉(zhuǎn)速為100 r·min-1。取LUT-NMs 2 mL 加入到前處理好的透析袋（截留相對分子質(zhì)量：12～14 kDa）中，系緊兩端，放入到釋放介質(zhì)中，在預(yù)定時間點（0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h）取出釋放介質(zhì)2 mL（并立即補充等量預(yù)熱的空白介質(zhì)），過濾后檢測藥物含量，繪制累積藥物釋放-時間曲線圖（圖4）。

圖4 LUT-NMs在不同pH介質(zhì)中的體外藥物釋放曲線（,n=6）

通過體外考察LUT-NMs 在不同pH 介質(zhì)中的釋藥速率來評估其在體內(nèi)環(huán)境中的可能的釋藥狀態(tài)。由釋放曲線可知，LUT-NMs 在不同pH 釋放介質(zhì)中藥物釋放速率基本一致，前期釋藥速率較快，推測是吸附在納米膠束表面的藥物釋放所致；而在后期釋藥速率較慢，可能是包裹在膠束內(nèi)部的藥物通過擴散，或者載體材料溶蝕后藥物釋放所致。

2.6 藥動學研究

采用體質(zhì)量為（200±20）g 的SD 大鼠對LUTNMs 進行體內(nèi)藥動學研究。將大鼠隨機分為A 和B兩組（給藥前禁食12 h），A 組大鼠灌胃給予LUT混懸液（以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液分散），B 組大鼠灌胃給予LUT-NMs，給藥劑量為40 mg·kg-1，分別在給藥后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h 從眼眶靜脈叢收集血液0.5 mL 至肝素化的離心管中，經(jīng)5000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），用移液槍分離出血漿，并在-20 °C的冰箱中冷凍。取血漿200 μL加入鹽酸普萘洛爾（5 μg·mL-1）10 μL作為內(nèi)標溶液，再將氫氧化鈉溶液（0.5 mol·L-1）20 μL 和乙酸乙酯300 μL置于血漿樣品中，渦旋混合2 min，10 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），小心收集有機相，在溫和的氮氣流下將有機相揮干，將干燥后的殘渣用50 μL 流動相重新溶解，渦旋3 min，10 000 r·min-1離心10 min（離心半徑為10 cm），取上清液20 μL注入到HPLC 系統(tǒng)中，按2.2.1 項下色譜條件檢測并計算血藥濃度，低、中、高3 個藥物濃度的血漿樣品的精密度RSD 均小于15%，絕對回收率為85%～115%，符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則規(guī)定，該方法可用于LUT 在大鼠血漿中的含量測定。使用DAS 2.0 軟件擬合藥動學參數(shù)，結(jié)果見表6，血藥濃度-時間曲線見圖5。藥動學結(jié)果顯示，與口服LUT懸浮液大鼠相比，口服LUT-NMs的大鼠，其達峰時間（Tmax）明顯提前，藥物達峰濃度（Cmax）和藥時曲線下面積（AUC0-t）均顯著增加，半衰期（T1/2）明顯延長，生物利用度提高了2.11倍。

圖5 大鼠口服LUT懸浮液和LUT-NMs后的血漿濃度-時間曲線（,n=6）

表6 LUT混懸劑和LUT-NMs經(jīng)大鼠口服給藥后的藥動學參數(shù)（,n=6）

表6 LUT混懸劑和LUT-NMs經(jīng)大鼠口服給藥后的藥動學參數(shù)（,n=6）

注：—表示無此項數(shù)據(jù)；#表示LUT-NMs與LUT混懸劑相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3 討論

普朗尼克（Pluronic）是由親水端聚環(huán)氧乙烷（PEO）和疏水端聚環(huán)氧丙烷（PPO）組成的兩親性三嵌段共聚物（PEO-PPO-PEO），分為多種型號。Pluronic 已被美國FDA 批準可用于體內(nèi)注射，該輔料無不良反應(yīng)，在體內(nèi)可生物降解，已在生命科學領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[23-24]。以Pluronic 作為納米膠束載體具有如下優(yōu)勢：1）嵌段共聚物的疏水端形成內(nèi)核，可將難溶性藥物包裹在其中，而親水端外殼則保護藥物免受水環(huán)境的影響；2）具有較低的CMC 值，解離速度慢，穩(wěn)定性好；3）可以提高難溶性藥物的生物利用度[25]。

已有多位研究人員將木犀草素制備成新型給藥系統(tǒng)用于提高藥物的口服生物利用度。例如，燕柳艷等[7]將木犀草素與哌嗪制備成共晶，改善了木犀草素溶解度和體內(nèi)生物利用度，同時提高了木犀草素的成藥性，然而，木犀草素制備成共晶，其藥理作用是否會進一步發(fā)生改變，還有待深入研究發(fā)掘。楊娟等[8]將木犀草素制備成固體脂質(zhì)納米粒，可促進木犀草素口服吸收，提高其生物利用度，但固體脂質(zhì)納米粒促進藥物吸收的程度還會受到納米粒粒徑、納米材料性質(zhì)、表面活性劑種類、納米粒表面親水親脂性及空間特性、體內(nèi)穩(wěn)定性及跨膜吸收過程中諸多因素的影響，尚需作進一步研究。李陽杰等[9]采用溶劑揮發(fā)法將木犀草素磷脂復(fù)合物，其生物利用度提高2.09 倍，但溶解度增加不明顯。鄧向濤等[10]以PVP K30為載體，采用溶劑揮發(fā)法將木犀草素分別制備成固體分散體和木犀草素磷脂復(fù)合物固體分散體，2種固體分散體均可顯著提高藥物生物利用度，且磷脂復(fù)合物固體分散體提高更明顯，但制劑制備工藝較為苛刻，需要嚴格控制水分進入反應(yīng)體系。

本研究結(jié)果僅限于木犀草素納米膠束（LUTNMs）的制備和初步體內(nèi)外評價，后續(xù)將對LUTNMs 在動物體內(nèi)的組織分布、體內(nèi)安全性等進行全面研究，為其進一步的開發(fā)應(yīng)用提供更完整的實驗數(shù)據(jù)，有望為提高木犀草素的抗腫瘤的藥用價值提供新的研究思路。