嚴(yán)玉晶，李玲，麥貴敏，曹嵌，林嘉明，鄺敏，劉燎原

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244

五靈脂為鼯鼠科動(dòng)物復(fù)齒鼯鼠Trogopterus xanthipesMilne-Edwar的干燥糞便，始載于《開(kāi)寶本草》：“出北地，此是寒號(hào)蟲(chóng)糞也”[1]。趙佳琛等[2]通過(guò)對(duì)歷代本草文獻(xiàn)的考證，確定五靈脂的主流來(lái)源為復(fù)齒鼯鼠T.xanthipes的干燥糞便，以山西、河北兩省太行山一帶為五靈脂最主要的產(chǎn)區(qū)。《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）1977年版至1990 年版中記載五靈脂為鼯鼠科動(dòng)物復(fù)齒鼯鼠T.xanthipesMilne-Edwar的干燥糞便，根據(jù)外形的不同常分為“靈脂塊”及“靈脂米”，靈脂米以體輕、色黑棕、斷面色黃綠者為佳[3-5]；《中國(guó)藥典》1995 年版至2020 年版正文中則不再收錄。五靈脂主要含有黃酮類、酚酸類、三萜類和核苷類化學(xué)成分[6-7]，為活血、散瘀、止痛的中藥，主治胸痛、脘腹疼痛、痛經(jīng)、經(jīng)閉、產(chǎn)后血瘀疼痛、跌仆損傷、蛇蟲(chóng)咬傷等[8]，在消化性疾病、婦科疾病等方面廣泛應(yīng)用[9]，因此五靈脂在各地方現(xiàn)行藥材標(biāo)準(zhǔn)中仍有收錄。

目前，五靈脂相關(guān)研究主要在臨床配伍、藥理藥效、理化鑒別、含量測(cè)定及炮制方面，對(duì)其指紋圖譜的研究較少。中藥成分復(fù)雜，僅針對(duì)少數(shù)幾個(gè)成分進(jìn)行研究難以反映藥材質(zhì)量全貌，同時(shí)，五靈脂藥材為復(fù)齒鼯鼠干燥糞便，其質(zhì)量與復(fù)齒鼯鼠食料密切相關(guān)，食料不同，所得藥材化學(xué)成分及藥理作用均有一定差異。因此，本研究建立了五靈脂藥材超高效液相色譜法（UPLC）指紋圖譜，并結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量、篩選出不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量差異標(biāo)志性成分，以期為五靈脂藥材質(zhì)量研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Milli-Q Direct 型超純水系統(tǒng)（德國(guó)Merck 公司）；111B 型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；XP26型百萬(wàn)分之一天平、ME204E 型萬(wàn)分之一天平均購(gòu)于瑞士Mettler-Toledo公司；DLSB-5/20B 型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）。

1.2 試藥

五靈脂藥材22 批（編號(hào)為W1～W22），經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定為鼯鼠科動(dòng)物復(fù)齒鼯鼠Trogopterus xanthipesMilne-Edwar 的干燥糞便，藥材對(duì)應(yīng)編號(hào)及產(chǎn)地見(jiàn)表1。

表1 22批五靈脂藥材來(lái)源信息

對(duì)照品原兒茶酸（批號(hào)：110809-201906，純度：97.7%）、槲皮苷（批號(hào)：111538-202007，純度：93.5%）、4-羥基苯甲酸（批號(hào)：101149-201903，純度：100.0%）、苯甲酸（批號(hào)：100419-201703，純度：99.9%）、穗花杉雙黃酮（批號(hào)：111902-201603，純度：97.7%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；對(duì)照品扁柏雙黃酮（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：RFS-B0511808009，純度：97.00%）；乙腈、磷酸為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，6%～16%A；10～16 min，16%～20%A；16～24 min，20%～27%A；24～32 min，27%～39%A；32～38 min，39%～47%A；38～48 min，47%A；48～50 min，47%～90%A；50～52 min，90%A）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；流速：0.25 mL·min-1；進(jìn)樣量：1.0 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為28.919、57.900、80.420、26.461、33.023、53.244 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取五靈脂粉末（過(guò)三號(hào)篩）約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取五靈脂藥材粉末（編號(hào)：W13），精密稱定，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6 次，以5 號(hào)峰苯甲酸為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.12%、相對(duì)峰面積RSD<1.55%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取五靈脂藥材粉末（編號(hào)：W13），精密稱定，按2.3 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以5號(hào)峰苯甲酸為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.04%、相對(duì)峰面積RSD<1.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取五靈脂藥材粉末（編號(hào)：W13），精密稱定，按2.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，以5 號(hào)峰苯甲酸為參照峰（S），計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<0.17%、相對(duì)峰面積RSD<2.67%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及分析

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰指認(rèn) 取22 批五靈脂藥材，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）對(duì)22 批五靈脂藥材色譜圖進(jìn)行處理，以W13 號(hào)樣品色譜圖為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.1 min，選用平均數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜R。共標(biāo)定14 個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)出其中6 個(gè)峰，分別為原兒茶酸（1號(hào)峰）、4-羥基苯甲酸（2 號(hào)峰）、苯甲酸（5 號(hào)峰）、槲皮苷（7 號(hào)峰）、穗花杉雙黃酮（11 號(hào)峰）、扁柏雙黃酮（14號(hào)峰）。22批五靈脂藥材UPLC指紋圖譜疊加圖、對(duì)照指紋圖譜R 見(jiàn)圖1，混合對(duì)照品色譜圖、空白試劑色譜圖及共有峰指認(rèn)見(jiàn)圖2。

圖1 22批五靈脂藥材UPLC指紋圖譜疊加圖及對(duì)照指紋圖譜R

圖2 22批五靈脂藥材UPLC指紋圖譜共有峰指認(rèn)

2.5.2 相似度評(píng)價(jià) 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）對(duì)22 批五靈脂藥材進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，以對(duì)照指紋圖譜R 為參照，22 批五靈脂藥材相似度為0.870～0.998，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。以5 號(hào)峰苯甲酸為參照峰（S），計(jì)算22 批五靈脂樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<1.43%、相對(duì)峰面積RSD 為20.31%～123.55%。說(shuō)明不同產(chǎn)地五靈脂藥材各化學(xué)組成相似，但樣品間共有化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定差異。

表2 22批五靈脂藥材指紋圖譜相似度

2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.6.1 聚類熱圖分析 聚類熱圖可通過(guò)橫向與縱向聚類來(lái)反映樣本的批間差異及成分間的相關(guān)性，同時(shí)熱圖色塊顏色的深淺能直觀地反映成分含量的高低[10]。將22 批五靈脂藥材的14 個(gè)共有峰單位峰面積進(jìn)行歸一化后，導(dǎo)入Hiplot 科研繪圖平臺(tái)[11]，選擇“ward” 聚類方法，行列距離度量為“euclidean”，生成聚類熱圖。結(jié)果如圖3 所示，22批不同產(chǎn)地五靈脂藥材可聚為兩大類，W1～W12 聚為一類，為陜西省商洛市的樣品，W13～W22 聚為一類，為陜西省西安市及山西、湖北、河北省的樣品。其中樣品W13～W22 具有較高相似性，無(wú)明顯的區(qū)域性差異，在該聚類中特征峰7（槲皮苷）、峰9、峰10、峰11（穗花杉雙黃酮）、峰13、峰14（扁柏雙黃酮）顏色偏暖，表明所含成分含量相對(duì)較高，該特征與樣品W1～W12 具有明顯區(qū)分；同時(shí)，熱圖顯示特征峰1（原兒茶酸）在不同產(chǎn)地中呈現(xiàn)出明顯的區(qū)域性特征，陜西省西安市、商洛市所產(chǎn)五靈脂中原兒茶酸含量較低，山西、湖北、河北省樣品中原兒茶酸含量較高。由結(jié)果可知，通過(guò)聚類熱圖分析，可將陜西省所產(chǎn)五靈脂藥材與其余產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分。

圖3 22批五靈脂藥材UPLC指紋圖譜聚類熱圖

2.6.2 正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA）OPLS-DA 是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，近年來(lái)，在相關(guān)的中藥領(lǐng)域常作為生藥質(zhì)量評(píng)價(jià)、中藥炮制前后成分差異研究、中藥藥理代謝組學(xué)及中藥潛在質(zhì)量標(biāo)志物探索的基礎(chǔ)方法之一[12]，通過(guò)OPLS-DA 進(jìn)一步明確不同產(chǎn)地五靈脂藥材質(zhì)量差異成分。將22 批五靈脂藥材指紋圖譜共有峰的單位峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件，進(jìn)行OPLS-DA。模型三大指標(biāo)數(shù)據(jù)矩陣解釋率參數(shù)自變量的可解釋率（R2X）為0.943、模型區(qū)分參數(shù)因變量的可解釋率（R2Y）為0.961、模型預(yù)測(cè)參數(shù)（Q2）為0.893，表明模型具有良好的解釋及預(yù)測(cè)能力[13]。OPLS-DA模型得分圖見(jiàn)圖4，顯示22 批五靈脂藥材共聚為兩類，陜西省商洛市各區(qū)縣鄉(xiāng)鎮(zhèn)所產(chǎn)五靈脂與其余產(chǎn)地樣品分別聚集在坐標(biāo)軸左右兩側(cè)，表明樣品成分含量有明顯差異，與聚類熱圖分析結(jié)果一致。根據(jù)OPLS-DA模型得到14個(gè)化學(xué)成分的變量重要性投影（VIP）值見(jiàn)圖5，以VIP 值>1 為標(biāo)準(zhǔn)，得到不同產(chǎn)地五靈脂藥材的質(zhì)量差異標(biāo)志性成分，根據(jù)影響程度依次為色譜峰9、峰7（槲皮苷）、峰11（穗花杉雙黃酮）、峰10、峰1（原兒茶酸）、峰8、峰6，說(shuō)明以上7 個(gè)成分是造成不同產(chǎn)地五靈脂藥材質(zhì)量差異的主要成分。

圖4 22批五靈脂藥材OPLS-DA得分

圖5 22批五靈脂藥材OPLS-DA VIP值（,n=22）

3 討論

3.1 指紋圖譜的建立

五靈脂主要化學(xué)成分包括黃酮類及酚酸類成分，分別取對(duì)照品溶液及供試品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（190～400 nm），結(jié)果顯示，原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、苯甲酸等酚酸類成分在波長(zhǎng)255～260 nm 具有最佳吸收，而槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮等黃酮類成分在波長(zhǎng)255～268、348～337 nm 具有最佳吸收，綜合考慮最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm，基線平穩(wěn)且各色譜峰響應(yīng)較高。同時(shí)，本研究分別對(duì)不同的提取方式（超聲、回流）、提取時(shí)間（15、30、60 min）、提取溶劑（50%乙醇、80%乙醇、乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇）、料液比（1∶25、1∶50）、柱溫（28、30、32 ℃）及流速（0.23、0.25、0.27 mL·min-1）等進(jìn)行考察，最終確定上述最佳色譜條件，色譜峰較多、分離效果較好。建立的五靈脂藥材UPLC 指紋圖譜共標(biāo)定14 個(gè)共有峰，指認(rèn)出其中6個(gè)成分，分別為原兒茶酸、4-羥基苯甲酸、苯甲酸、槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮。該方法專屬性、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，可用于五靈脂藥材質(zhì)量控制。

3.2 結(jié)果分析

通過(guò)五靈脂指紋圖譜相似度分析及計(jì)算各特征峰相對(duì)峰面積RSD，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地五靈脂藥材化學(xué)成分相似度較高，但相對(duì)峰面積RSD 具有較大差異，推測(cè)這可能是復(fù)齒鼯鼠的生長(zhǎng)環(huán)境、喂養(yǎng)食料及五靈脂藥材的收集時(shí)期等多方面因素共同產(chǎn)生的影響。通過(guò)觀察各樣品特征峰峰面積，黃酮類成分（槲皮苷、穗花杉雙黃酮、扁柏雙黃酮）所占比例最高，酚酸類成分（苯甲酸、原兒茶酸、4-羥基苯甲酸）次之，兩類成分特征峰峰面積之和為總峰面積的68.09%～83.37%。有研究發(fā)現(xiàn)，雙黃酮類成分對(duì)人凝血酶有強(qiáng)烈的抑制作用[14]，以苯甲酸為母核的酚酸類物質(zhì)可明顯抑制血小板凝聚[15]，這與五靈脂活血化瘀、通利血脈的功效具有相關(guān)性。同時(shí)，臨床上五靈脂還用于治療消化性潰瘍、盆腔炎、慢性萎縮性胃炎[16]及多種痛癥[17]，與黃酮類、酚酸類成分的抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等功效密切相關(guān)。

化學(xué)計(jì)量學(xué)作為一種新興的分析實(shí)驗(yàn)方法，廣泛應(yīng)用于中藥鑒別、定性表征、質(zhì)量控制、組效關(guān)系等研究中，尤其在中藥的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)研究中具有重要意義，通過(guò)無(wú)監(jiān)督的模式識(shí)別（聚類分析等）獲取樣本分類信息，再經(jīng)過(guò)有監(jiān)督的OPLS-DA等方法識(shí)別樣本間質(zhì)量差異標(biāo)志性成分[18]。聚類熱圖分析表明，22 批五靈脂藥材可聚為兩類，陜西省商洛市樣品可與其他產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分；山西、湖北、河北樣品中原兒茶酸及黃酮類成分含量明顯高于陜西省樣品。通過(guò)有監(jiān)督的OPLS-DA 找出7 個(gè)質(zhì)量差異標(biāo)志性成分。

筆者查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，市場(chǎng)流通的五靈脂藥材多為人工飼養(yǎng)鼯鼠生產(chǎn)所得，食料以側(cè)柏葉為主，同時(shí)人為地?fù)诫s其他樹(shù)葉[19]。黃酮類及雙黃酮類成分是側(cè)柏葉的特征性成分，也是有效成分，孟麗娟等[20]將楊梅苷、槲皮苷、穗花杉雙黃酮和扁柏雙黃酮作為側(cè)柏葉的含量控制指標(biāo)。由此可推測(cè)，五靈脂中黃酮類成分來(lái)自復(fù)齒鼯鼠的主要食料側(cè)柏葉，故該類成分特征峰面積占比最高。筆者研究發(fā)現(xiàn)，河北、山西、湖北省及陜西省西安市五靈脂樣品中，均檢測(cè)出楊梅苷、槲皮素成分，而陜西省商洛市所產(chǎn)五靈脂中2 個(gè)成分含量較低，甚至無(wú)法檢出。程明等[19]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，陜西商洛鼯鼠基地人工飼養(yǎng)鼯鼠時(shí)除采用側(cè)柏葉外也人為摻雜其他樹(shù)葉及饅頭、奶粉等。劉玉太等[21]經(jīng)過(guò)多年研究總結(jié)，指出復(fù)齒鼯鼠在繁殖季節(jié)需喂養(yǎng)鮮牛奶、玉米面、饅頭及多維素和礦物質(zhì)，以保證營(yíng)養(yǎng)需求。由此推測(cè)復(fù)齒鼯鼠主食中側(cè)柏葉的占比是導(dǎo)致五靈脂中黃酮類成分含量變化的原因之一。此外，五靈脂在歷代本草中均被記載“采無(wú)時(shí)”，現(xiàn)代藥材標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)也認(rèn)為全年均可采收[2-5,8,21]。處于繁殖季節(jié)的復(fù)齒鼯鼠以玉米面、饅頭為食，其糞便是否與五靈脂具有相同化學(xué)成分、功效，有待進(jìn)一步考察。五靈脂藥材雖未被收錄于《中國(guó)藥典》2020 年版正文部分，但其在成方制劑和單味藥制劑中仍有14 種中藥復(fù)方制劑[22]，復(fù)齒鼯鼠的規(guī)范喂養(yǎng)及五靈脂的固定采收是否更有利于保證五靈脂藥材質(zhì)量和療效的穩(wěn)定，有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究建立的五靈脂藥材UPLC 指紋圖譜及化學(xué)模式識(shí)別方法可較整體地反映不同產(chǎn)地五靈脂藥材的化學(xué)成分差異，并篩選出質(zhì)量差異標(biāo)志性成分，可為五靈脂藥材質(zhì)量研究提供參考。