曹俊昌，石 穎，胡艷紅，胡 俊，陳 勝

（福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

隨著城市化、人口老齡化以及生活方式的改變，全球糖尿病發(fā)病率逐年快速增長。根據(jù)2021 年國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計，目前全球20～79 歲人群中有糖尿病患者5.37 億，預(yù)計2045 年將增長至7.83 億［1］。糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常見、最嚴重的眼部并發(fā)癥，是導(dǎo)致工作年齡人群失明的主要原因，其發(fā)病率及致盲率也逐年增長。一項綜合了1980 年—2008 年全球35 項DR 患病相關(guān)研究的薈萃分析表明，全球范圍內(nèi)糖尿病患者中DR 的患病率達34.6%［2］；另一項納入全球59 項研究的薈萃分析結(jié)果表明，2020 年全世界成年DR患者人數(shù)估計為1.031 億；2045 年，這一數(shù)字預(yù)計將增加至1.605 億［3］。在我國糖尿病患者中DR 的患病率為22.4%，也已成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題［4］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯在治療DR上有較好的臨床增效作用，可改善患者視力和中醫(yī)證候等［5］，但其潛在的作用機制還有待于進一步研究。近年來，高糖培養(yǎng)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞研究逐漸成為探討DR 機制的主要研究模型［6-8］，在不同研究中，高糖造模的濃度存在差異，在高糖誘導(dǎo)下視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞可表現(xiàn)為細胞損傷和增殖活性降低。因此，本研究通過正交實驗設(shè)計方法，以視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞活性為主要指標，篩選高糖損傷模型的最佳葡萄糖干預(yù)濃度、補陽還五湯水提液保護高糖誘導(dǎo)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞損傷的最佳濃度及最佳作用時間，以期為進一步的機制研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞（HRCECs）購自深圳豪地華拓生物科技有限公司。

1.2 實驗藥物 補陽還五湯由黃芪125 g，當歸6 g，赤芍5 g，地龍3 g，川芎3 g，焯山桃仁3 g，紅花3 g組成，均購自福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院中藥房。采用水提醇沉法制備補陽還五湯水提液（BYHWT）：稱取4 倍量的各味藥，浸泡0.5 h，加水煎煮2 次。第1 次15 倍量水，煎煮1.5 h；第2 次加10 倍量水，煎煮1 h，分別用濾布濾過，合并濾液，補水，得質(zhì)量濃度為0.1 g/mL 的補陽還五湯水提液，快速攪拌并緩慢加入乙醇使乙醇體積分數(shù)為60%，冷藏，靜置14 h，濾過，揮發(fā)至無醇味后，用水補足減失的質(zhì)量，備用。

1.3 實驗試劑 高糖DMEM 培養(yǎng)基（批號：D5796）、DMEM/F-12 培養(yǎng)基（批號：D6570）均購自北京索萊寶科技有限公司；優(yōu)級胎牛血清（FBS，美國Sigma公司，批號：F8318）；PBS 溶液（美國Hyclone 公司，批號：ABA212278）；0.25%胰蛋白酶（美國Gbico 公司，批號：25200-056）；5%葡萄糖注射液（中國湖南科倫制藥有限公司，批號：H43022082）；CCK8 細胞計數(shù)試劑盒（全式金生物公司，批號：FP101-02）。

1.4 實驗儀器 酶標儀（中國北京普朗新技術(shù)有限公司，型號：DNM-9602）；細胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司，型號：VMCMMCO-5ACMMO）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%FBS 和1%雙抗的高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為4.5 mg/mL），于37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞貼壁長滿后，棄去培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 次。加適量0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

2.2 不同葡萄糖濃度和BYHWT 濃度對細胞增殖的影響 將細胞以每孔1×104個接種于96 孔培養(yǎng)板，待細胞單層貼壁生長至50%左右，分別加入含4.5、5、10、15、20、25 mg/mL 葡萄糖濃度的培養(yǎng)基和含0、5、10、15.625、31.25、62.5、125、250 mg/mL BYHWT 濃度的高糖培養(yǎng)基各200 μL，在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24、48、72 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)后，每孔加入10 μL 的CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標儀450 nm 波長處測定OD 值。

2.3 正交實驗優(yōu)選HRCECs 細胞培養(yǎng)條件 以葡萄糖濃度（A）、BYHWT 濃度（B）及孵育時間（C）為3 個實驗影響因素，每個因素設(shè)定3 個水平，根據(jù)“2.2”項下結(jié)果，選擇相應(yīng)的葡萄糖濃度和BYHWT濃度，按照L9（34）正交表進行實驗，優(yōu)選出BYHWT防護高糖損傷HRCECs 的最佳濃度及最佳作用時間。以HRCECs 細胞OD 值為評價指標，OD 值高者為佳。

將細胞以每孔5×104個接種于3 個24 孔培養(yǎng)板，3 個培養(yǎng)板對應(yīng)3 個孵育時間（24、48、72 h），待細胞單層貼壁生長至50%左右時，按正交實驗表加新配制相應(yīng)濃度的GS、BYHWT 培養(yǎng)液。37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日換相同條件培養(yǎng)液1 次。培養(yǎng)至預(yù)定時間，每孔加入10 μL 的CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，用酶標儀測定450 nm 處的OD 值。

2.4 BYHWT 干預(yù)時間篩選 根據(jù)正交實驗優(yōu)選出的葡萄糖濃度和BYHWT 濃度，將HRCECs 細胞分為正常組、模型組（優(yōu)選葡萄糖濃度）與干預(yù)組（優(yōu)選葡萄糖濃度+優(yōu)選BYHWT 濃度），培養(yǎng)24、48、72 h，每日換液1 次，CCK8 法測定3 組細胞不同干預(yù)時間的OD 值。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 不同葡萄糖濃度干預(yù)HRCECs 細胞OD 值比較 與4.5 mg/mL 組比較，隨著葡萄糖濃度增高，HRCECs 細胞OD 值在不同時間均大致為先升高后降低趨勢。干預(yù)24 h 時，20、25 mg/mL 葡萄糖濃度下細胞OD 值明顯降低；干預(yù)48、72 h 后，葡萄糖濃度＞15 mg/mL 時，OD 值開始出現(xiàn)下降趨勢，其中25 mg/mL葡萄糖濃度干預(yù)后OD 值均明顯降低（P＜0.05），提示該濃度可引起細胞損傷。見表1。

表1 不同糖濃度干預(yù)HRCECs 細胞OD 值比較（±s）

表1 不同糖濃度干預(yù)HRCECs 細胞OD 值比較（±s）

注：與4.5 mg/mL 組比較，1） P＜0.05。

72 h 1.511±0.093 1.765±0.0901）1.775±0.1001）1.754±0.0701）1.715±0.2031）0.848±0.1011）葡萄糖濃度/（mg/mL）4.5 5 10 15 20 25 24 h 0.805±0.059 0.772±0.109 0.810±0.051 0.852±0.075 0.613±0.1141）0.346±0.0501）48 h 0.728±0.053 0.987±0.1771）0.873±0.092 0.975±0.1231）0.613±0.086 0.500±0.0431）

3.2 不同BYHWT 濃度干預(yù)HRCECs 細胞OD 值比較 與0 mg/mL組比較，5 mg/mL BYHWT干預(yù)24 h，10、15.625 mg/mL BYHWT干預(yù)48、72 h后OD值均明顯提高（P＜0.05），提示該濃度可促進增殖。見表2。

表2 不同BYHWT濃度干預(yù)HRCECs細胞OD值比較（±s）

注：與0 mg/mL 組比較，1） P＜0.05。

72 h 1.700±0.121 1.798±0.0601）1.912±0.4191）1.976±0.1531）1.700±0.142 0.848±0.1121）0.763±0.0811）0.660±0.0041）BYHWT濃度/（mg/mL）05 10 15.625 31.25 62.5 125 250 24 h 0.850±0.024 1.178±0.0481）0.875±0.106 0.901±0.073 0.881±0.007 0.867±0.018 0.841±0.042 0.708±0.0051）48 h 1.035±0.055 1.406±0.1021）1.339±0.1431）1.281±0.1261）1.149±0.040 0.826±0.0661）0.712±0.0201）0.656±0.0021）

3.3 正交實驗結(jié)果 由表1 可知，當葡萄糖濃度＞15 mg/mL 時，葡萄糖培養(yǎng)促進HRCECs 細胞增殖的作用開始減弱，因此，選擇篩選15、20、25 mg/mL 葡萄糖濃度作為正交實驗條件。由表2 可知，當BYHWT 濃度在5～15.625 mg/mL 時，HRCECs 細胞OD值增強，提示該濃度對HRCECs 細胞具有保護作用。正交實驗因素水平設(shè)計見表3，正交實驗設(shè)計結(jié)果見表4，方差結(jié)果分析見表5。由表4 極差（R）可知，影響細胞增殖活性的主次因素是C＞A＞B，即孵育時間＞葡萄糖濃度＞BYHWT 濃度。經(jīng)方差分析和顯著性檢驗結(jié)果表明，孵育時間對細胞增殖活性有顯著性影響，而葡萄糖濃度和BYHWT 濃度對細胞增殖活性無明顯影響。因此，選擇25 mg/mL葡萄糖濃度建立高糖損傷模型，選擇5 mg/mL BYHWT 濃度干預(yù)細胞，觀察細胞增殖活性，篩選干預(yù)時間。

表3 正交實驗因素水平表

表4 正交實驗設(shè)計結(jié)果

表5 方差結(jié)果分析

3.4 3組不同時間干預(yù)HRCECs細胞OD值比較 與正常組比較，模型組干預(yù)24、48、72 h 后OD 值明顯降低（P＜0.05）；干預(yù)組干預(yù)24、48 h 后OD 值明顯升高（P＜0.05），干預(yù)72 h 后明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，干預(yù)組干預(yù)24、48、72 h 后OD 值明顯升高（P＜0.05）。見表6。

表6 3 組不同時間干預(yù)HRCECs 細胞OD 值比較（±s）

表6 3 組不同時間干預(yù)HRCECs 細胞OD 值比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別正常組模型組干預(yù)組72 h 1.621±0.110 0.848±0.1011）1.320±0.1241）2）24 h 0.860±0.053 0.346±0.0501）0.991±0.1031）2）48 h 0.890±0.099 0.500±0.0431）1.007±0.0782）

4 討 論

補陽還五湯出自《醫(yī)林改錯》，現(xiàn)臨床上被應(yīng)用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病下肢血管病變、糖尿病心血管病變等糖尿病并發(fā)癥［8-9］。視網(wǎng)膜微血管是糖尿病視網(wǎng)膜病變主要的病變部位，在高血糖情況下微血管內(nèi)皮細胞會出現(xiàn)慢性炎癥及滲透性損傷［10］。大多數(shù)HRCECs細胞高糖損傷的模型研究，正常培養(yǎng)HRCECs 細胞的培養(yǎng)基葡萄糖濃度為1.0～5.5 mg/mL［11-12］，而本研究HRCECs細胞正常的培養(yǎng)條件要求4.5 mg/mL葡萄糖濃度的培養(yǎng)基，因此為了進一步觀察高糖對該細胞的損傷作用，本研究探討了5、10、15、20、25 mg/mL葡萄糖濃度對HRCECs 細胞活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HRCECs 細胞OD 值在不同時間均大致為先升高后降低趨勢。干預(yù)24 h 時，20、25 mg/mL 葡萄糖濃度下細胞OD 值明顯降低；干預(yù)48、72 h 后，葡萄糖濃度＞15 mg/mL 時，OD 值開始出現(xiàn)下降趨勢，當葡萄糖濃度為20 mg/mL 以上時，培養(yǎng)液對HRCECs細胞表現(xiàn)出損傷作用。其中25 mg/mL GS 培養(yǎng)液條件下孵育的HRCECs 細胞24～72 h OD 值均低于正常組，說明增大葡萄糖濃度可以成功制備高糖損傷HRCECs 模型。

在常規(guī)的細胞實驗中，建立細胞模型多采用不同梯度濃度的藥物干預(yù)細胞，根據(jù)細胞增殖活性篩選出造模濃度；治療藥物的濃度篩選，也多采用不同梯度濃度干預(yù)細胞進而獲得最佳的藥物干預(yù)濃度，造模濃度和藥物干預(yù)濃度在組合條件下可能出現(xiàn)不同的規(guī)律［13-14］。本文篩選葡萄糖濃度時提示葡萄糖濃度＞25 mg/mL 干預(yù)48 h 出現(xiàn)細胞損傷，而篩選BYHWT濃度時提示BYHWT濃度≤15.625 mg/mL便可以減少細胞損傷，且隨著濃度降低，損傷減少。理論上用保護作用最強濃度的藥物干預(yù)損傷最重的細胞，與保護作用最弱的藥物干預(yù)損傷最輕的細胞，此兩者效果應(yīng)該一致，但通過正交實驗發(fā)現(xiàn)：25 mg/mL 葡萄糖聯(lián)合5 mg/mL BYHWT 的OD 值為0.653 3，而15 mg/mL 葡萄糖聯(lián)合15.625 mg/mL BYHWT 的OD 值為1.1025，有明顯的差異。因此，篩選最佳的損傷模型和保護性藥物的最佳干預(yù)濃度以及干預(yù)時間，需要采用正交設(shè)計分析進行多次實驗。

為了明確補陽還五湯水提液對高糖誘導(dǎo)HRCECs的保護作用，通過正交設(shè)計的驗證實驗，結(jié)果表明：在25 mg/mL 葡萄糖濃度下孵育24 h，即可導(dǎo)致HRCECs 細胞損傷，而5 mg/mL BYHWT 可保持HRCECs活性。25 mg/mL葡萄糖濃度培養(yǎng)的HRCECs細胞可以作為高糖損傷模型，5 mg/mL BYHWT 干預(yù)24 h 可用于探討B(tài)YHWT 對高糖誘導(dǎo)HRCECs 細胞的保護作用。這為進一步探討B(tài)YHWT 對高糖誘導(dǎo)HRCECs 細胞的保護機制研究提供了前期參考依據(jù)。