袁 昊,李 婷,張騰偉,肖 娟,楊 劉,黎 巧,阮 滔,朱 昉,肖詠梅,彭湘蓮

湖南省婦幼保健院新生兒一科,湖南長沙 410000

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是指足月和近足月新生兒由于圍生期缺氧導(dǎo)致的急性腦損傷。我國報告HIE發(fā)生率為活產(chǎn)嬰兒的3‰～6‰,其中15%～20%患兒在新生兒期死亡,存活者中有25%～30%可遺留嚴重的神經(jīng)功能障礙,包括腦癱、癲癇、視聽障礙、認知障礙、行為異常等,成為影響我國兒童生活質(zhì)量的重要疾病之一[1-2]。因此,積極研究HIE的發(fā)生機制、早期診斷及針對性干預(yù)治療,在臨床上具有重大意義。microRNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼RNA(由18～23個核苷酸組成),其功能廣泛,參與細胞周期、增殖和分化、信號傳導(dǎo)和凋亡等過程[3]。有研究證明,許多miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4],將成為HIE具有潛力的治療靶點及有效的生物預(yù)測指標。本研究利用基因芯片技術(shù),分析出新生大鼠HIE中差異表達的miRNA,篩選特異性的miRNA,探討其可能的發(fā)生機制,為HIE的機制研究、臨床診斷及藥物設(shè)計提供理論依據(jù)和新的治療思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 7 d齡SD大鼠12只,雌雄不限,體質(zhì)量12～16 g,購自廣東省實驗動物檢測所。隨機分為HIE組及假手術(shù)對照組,每組6只。

1.2主要材料及儀器 基因芯片篩選miRNA由新開源晶銳(廣州)生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3方法

1.3.1造模 采用Rice法制作HIE模型:7 d齡SD新生大鼠乙醚吸入麻醉后,仰臥位固定于手術(shù)臺,消毒切開頸部皮膚,分離左側(cè)頸總動脈并在遠、近心端進行雙結(jié)扎,縫合切口,術(shù)后放入37 ℃恒溫箱中30 min,以1.5 L/min不斷輸入含8%氧氣和92%氮氣的低氧氣源2 h。假手術(shù)對照組:7 d齡SD新生大鼠只游離左側(cè)頸總動脈穿線但不結(jié)扎,縫合傷口后不進行缺氧處理。兩組手術(shù)時間均低于10 min,環(huán)境溫度26～28 ℃。造模后觀察新生大鼠行為情況。

1.3.2取新生大鼠海馬組織 造模后24 h,取海馬組織。給予新生大鼠乙醚吸入麻醉,在低溫環(huán)境下快速斷頭取腦,冰上分離海馬組織。將左右兩側(cè)海馬放入凍存管中,液氮速凍后放入-80 ℃低溫冰箱備用。

1.3.3基因芯片篩選差異性miRNA 取新生大鼠海馬組織,采用Trizol法進行樣品的總RNA抽提純化并質(zhì)檢。將提取的總RNA送檢,進行微陣列雜交、芯片掃描,利用生物信息軟件篩選顯著差異的miRNA。本實驗采用illumina Hiseq測序平臺的單端50 bp測序模式對樣本進行高通量測序。原始數(shù)據(jù)需經(jīng)過引物與adaptor序列去除,并經(jīng)過對測序片段堿基的質(zhì)量檢驗和長度篩選,最終選擇質(zhì)量可靠的測序片段。將每個樣本的reads比對到已有的miRNA數(shù)據(jù)庫(miRBase)和新miRNA預(yù)測的結(jié)果上,從而計算miRNA表達量。利用DESeq軟件進行差異表達分析,篩選差異表達的miRNA,計算每個樣本的表達量和組內(nèi)均值,并且計算組間差異Fold Change,再計算log2(Fold Change)用于后續(xù)篩選差異基因。

1.3.4目的基因GO功能集分析及富集分析 將全部基因作為背景列表,目的基因列表作為從背景列表中篩選出來的候選列表,利用Fisher精確檢驗計算GO功能集在目的基因列表中是否顯著富集的P值,再對P值經(jīng)Benjamini &Hochberg多重檢驗糾正后得到FDR。針對這些基因進行KEGG數(shù)據(jù)庫中通路的功能注釋和歸類,以及DisGeNET疾病數(shù)據(jù)庫中疾病類型的功能注釋和歸類。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 利用Seqtk(1.0-r82-dirty)對預(yù)處理數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制分析。序列比對使用Bowtie(1.0.0)軟件分析,采用DESeq軟件進行差異表達分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)評估 HIE組術(shù)后1只新生大鼠表現(xiàn)為持續(xù)精神萎靡,其余5只均出現(xiàn)先興奮后抑制行為:首先躁動不安;術(shù)后30 min,出現(xiàn)呼吸增快、站立不穩(wěn)、全身震顫癥狀;術(shù)后1 h,出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡、易激惹、夾尾左旋癥狀。假手術(shù)對照組活動正常。

2.2miRNA檢測結(jié)果分析

2.2.1測序數(shù)據(jù)質(zhì)控 針對每個樣本預(yù)處理后所有序列和去重復(fù)后的唯一序列,分別采用bowtie軟件與該物種的參考基因組、Rfam序列數(shù)據(jù)庫、RepBase序列數(shù)據(jù)庫、miRBase數(shù)據(jù)庫進行比對,平均質(zhì)控率大于89.00%,平均對比率約為47.96%,所獲得數(shù)據(jù)能滿足進一步分析要求。

2.2.2差異表達的miRNA 通過比較兩組miRNA表達量,利用DESeq軟件對兩組進行差異表達分析,篩選出共22個表達存在差異的miRNA,HIE組表達上調(diào)的miRNA共9個(mmu-miR-215-5p,mmu-miR-1249-3p,mmu-miR-3072-5p,mmu-miR-324-3p,mmu-miR-690,mmu-miR-874-5p,11_10767,11_10888,13_12928_star),表達下調(diào)的miRNA共13個(mmu-miR-141-3p,mmu-miR-182-5p,mmu-miR-183-5p,mmu-miR-190a-3p,mmu-miR-200a-3p,mmu-miR-200b-3p,mmu-miR-200c-3p,mmu-miR-429-3p,mmu-miR-455-3p,mmu-miR-760-5p,mmu-miR-96-5p,6_5971_star,9_8784),見圖1和表1。當滿足P<0.05并且|log2(Fold Change)|≥0.58時,認為該基因表達在組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 HIE組與假手術(shù)對照組差異性miRNA篩選

圖1 HIE組與假手術(shù)對照組對比的火山圖

2.2.3差異性miRNA的靶基因預(yù)測及富集分析 使用miRanda對差異表達的miRNA進行靶標預(yù)測,共得到1 495個靶基因。針對目的基因集,采用TopGO軟件進行GO功能分析。圖2展示預(yù)測靶基因在生物過程、細胞組成、分子功能的前10個最顯著的GO。結(jié)果顯示差異miRNA調(diào)控基因在生物過程中主要參與調(diào)節(jié)生物生長發(fā)育、神經(jīng)元形成與分化過程,在細胞組成中主要與突觸發(fā)生、突觸可塑性有關(guān),在分子功能中調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合、酶結(jié)合及谷氨酸受體活性等。

注:橫坐標代表-lg(P值),縱坐標代表顯著富集的GO名稱。圖2 顯著富集GO柱狀圖

針對這些基因進行KEGG數(shù)據(jù)庫中通路的功能注釋和歸類。圖3顯示富集到的主要通路有絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、神經(jīng)節(jié)鞘磷脂生物合成、細胞內(nèi)吞作用等。其中以MAPK信號通路最為顯著,HIE組表達上調(diào)的11-10767及mmu-miR-874-5p調(diào)控的8個靶基因(Braf,Mapt,Ppp5c,Mapk8ip2,Fgf6,Flt1,Ngfr,Tgfb1 )共同參與此信號通路。

注:橫坐標代表顯著富集的KEGG通路名稱,縱坐標代表-lg(P值)?？v坐標越顯著表示該通路越富集顯著,紅色柱表示顯著的通路(P<0.05),藍色柱表示不顯著的通路。圖3 顯著富集KEGG通路柱狀圖

3 討 論

新生兒HIE病理生理改變主要包括腦血流低灌注或過度灌注、腦細胞能力代謝障礙、自由基損傷及神經(jīng)元壞死或過度凋亡等。臨床治療策略主要通過增加氧分壓、維持腦血流灌注等多方法聯(lián)合治療,但不能有效阻斷神經(jīng)損傷。如何進行早期診斷及高效治療,最大程度上減少后遺癥發(fā)生,是近年來國內(nèi)外研究熱點。miRNA被認為參與多種疾病的發(fā)病機制,能夠通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達來調(diào)節(jié)不同的細胞過程[5],可用于疾病分子生物診斷、靶向治療和評估。目前,已有大量研究證明,miRNA在HIE損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用,將有助于新生兒HIE早期診斷、評估預(yù)后及靶向治療[6-7]。

本研究通過構(gòu)建HIE新生大鼠模型,在HIE發(fā)生24 h進行基因測序,共篩選出22個表達差異的miRNA,其中9個表達上調(diào),13個表達下調(diào)。通過靶基因預(yù)測,將目的基因進行GO功能富集分析,顯示調(diào)控基因主要涉及調(diào)節(jié)生物生長發(fā)育、神經(jīng)元形成與分化的過程,促進突觸發(fā)生。因此,筆者推測在HIE發(fā)生腦損傷早期,miRNA大多富集在與神經(jīng)元功能相關(guān)的生物通路中,修復(fù)受損神經(jīng)元。

在HIE表達上調(diào)的miRNA中,mmu-miR-215-5p差異倍數(shù)最為明顯,大量研究認為,其參與調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展。在非小細胞肺癌,miR-215-5p通過調(diào)控MAPK/ERK信號通路靶向調(diào)節(jié)ZEB2表達,參與細胞凋亡及死亡[8]。在惡性胸膜間皮瘤中,miR-215-5p通過激活基因p53功能,參與DNA損傷修復(fù)、細胞周期調(diào)控、細胞凋亡及抑制血管生成等過程,其低表達與該疾病不良預(yù)后有關(guān)[9]。在其他腫瘤疾病如乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、髓系白血病等中均有異常表達[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)mmu-miR-215-5p表達明顯上調(diào),考慮可能參與缺氧缺血損傷后神經(jīng)元凋亡及死亡的調(diào)控機制,需進一步研究驗證,其有望成為評估HIE的生物標志物。

在HIE表達下調(diào)的miRNA中,miR-200家族最為明顯。miR-200家族成員包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429,其參與多種疾病的發(fā)病機制,包括神經(jīng)退行性病變、纖維化、腫瘤等[11]。在缺氧缺血發(fā)生后,少突膠質(zhì)前體細胞迅速反應(yīng)、增殖、遷移到損傷部位,分化為成熟的少突膠質(zhì)細胞,包繞軸突形成髓鞘,促進神經(jīng)修復(fù)。在腦卒中的研究中發(fā)現(xiàn),miRNA-200過表達可抑制血清反應(yīng)因子表達,從而抑制少突膠質(zhì)前體細胞分化[12]。在缺氧研究中發(fā)現(xiàn),抑制miRNA-200表達可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞血管生成,改善組織缺氧[13]。由此可見,miRNA-200參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的病理過程。本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-200表達下調(diào),GO功能富集提示主要與神經(jīng)元形成與分化有關(guān),推測新生大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,機體修復(fù)神經(jīng)元及促進血管生成,與上述研究結(jié)論一致。故本研究認為,miR-200家族有望成為HIE治療靶點之一。

在HIE中KEGG通路分析結(jié)果顯示MAPK信號通路激活。MAPK家族主要包括細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK),通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,參與細胞增殖、分化、癌變、轉(zhuǎn)移、凋亡等生理過程,介導(dǎo)生長發(fā)育、炎癥反應(yīng)等[14]。研究表明,MAPK參與調(diào)節(jié)腦缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展過程,但存在腦保護及腦損傷雙重作用[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)HIE組表達上調(diào)的11-10767及mmu-miR-874-5p調(diào)控的8個靶基因(Braf,Mapt,Ppp5c,Mapk8ip2,Fgf6,Flt1,Ngfr,Tgfb1 )共同參與此信號通路,可為治療靶點提供參考方向。

綜上所述,本研究初步篩選出HIE中差異miRNA表達譜,構(gòu)建靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),提示HIE發(fā)生機制復(fù)雜多樣,需進一步對差異表達的miRNA進行驗證、分子機制及信號通路調(diào)控的研究。隨著不斷發(fā)現(xiàn)及深入研究miRNA及其靶位點,miRNA在HIE中發(fā)揮的作用將逐步被揭開,分子機制也將逐漸闡明。這將為HIE找到新的生物標志物和治療靶點提供思路及理論基礎(chǔ)。