李建平 何立棟 胡意立 溫建明 馬繼杰 萬 嫩

（浙江師范大學工學院，金華 321004）

血液由血漿和血細胞組成，約占人體體重的13%，廣義上被定義為一種包含液體和細胞的結締組織。血液在人體中進行規(guī)律性、系統(tǒng)化的循環(huán)，與人體各個組織器官密切相關，通過神經體液調節(jié)和聯(lián)合，與機體構成了一個完整的個體，具備運輸、維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及防御保護等功能，保障機體正常的生理活動。血液的成分和質量會隨人的生命體征變化而改變，包括機體的生理變化和病理變化，由此衍生出了全血分析的概念，例如血常規(guī)化驗［1-2］這種門診及住院病患的基礎檢驗項目。全血分析不僅能夠為各類血液系統(tǒng)疾病的診斷提供依據，諸如貧血［3-5］、溶血［6-7］現(xiàn)象等，對于其他類型疾病的診治也具有重要意義，例如感染性疾病［8-11］（細菌、微生物、病毒）、代謝性疾?。?2-16］（糖尿病、脂質異常、高尿酸血癥等）以及內分泌疾?。?7-19］（胰島素分泌異常、甲狀腺疾?。┑取Ｒ虼?，全血分析在醫(yī)學診斷領域占據著舉足輕重的地位。

現(xiàn)階段，全血分析的研究方法種類繁多，但是至今尚未歸納、總結和建立相應的分類系統(tǒng)，基于上述問題，本文提出將全血分析分為全血直接分析以及全血間接分析兩種形式（圖1）。其中，全血直接分析是通過抽取人體肘部靜脈血或者指尖末梢血，無需進行預處理操作或是樣品制備，直接放入檢測設備即可進行相關潛在病理分析，例如血常規(guī)、血糖、血凝時間等檢查。此類診斷方式具有簡單快捷，對于醫(yī)療操作人員的能力要求不高，但目前全血直接分析技術尚未成熟，仍有眾多關鍵性問題亟待解決，例如無法直接進行微量成分篩查。全血間接分析作為目前醫(yī)療診斷的主流方式以及科學研究的主要方向，需要對抽取血液做預處理以削弱試驗條件以及環(huán)境因素帶來的測量誤差影響，例如分離血細胞、添加細胞裂解液等。對于預處理手段可分為多種形式，傳統(tǒng)的全血處理存在耗費時間和成本偏高的弊端，對血液的高效處理是現(xiàn)階段快速分析或是床旁檢測的關鍵技術難題。

Fig.1 Research status of whole blood analysis圖1 全血分析研究現(xiàn)狀

毫無疑問，通過對患者的表象癥狀判斷以及體液的指標檢測，能夠有效地為患者身體狀況評價提供可靠信息，實現(xiàn)醫(yī)療的精確診斷并幫助主治醫(yī)生制定正確的治療計劃。近年來，基于全血分析的技術快速發(fā)展，部分疾病的檢測技術已趨于成熟并研發(fā)成產品廣泛應用于市場之中，成熟的全血分析設備對于身體康復和生命健康監(jiān)測及分析有著重要作用。提升設備的檢測限度、靈敏度和特異性等指標的準確性已成為血液分析設備發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。因此，采用間接過濾、離心等方式處理血液后進行分析是目前醫(yī)療領域以及臨床檢驗的常用手段。但是，檢測中的處理方式一般依靠大型的離心設備，操作流程繁瑣且耗時長，對疾病的快速診斷有一定的滯后性；便攜、集成裝置雖然依靠膜過濾等形式縮短了處理時間，但多數(shù)分析仍需要精密的光學設備檢測或顯微鏡觀察，一方面是分析時間較長，另一方面是高昂檢測成本，在一定程度上都制約了全血分析在現(xiàn)場快速篩查的應用。

綜上所述，血液作為眾多疾病診斷中最重要的體液之一，對血液進行高效、高分辨的分析將有利于眾多疾病診斷、護理或者公共衛(wèi)生領域。這篇綜述系統(tǒng)地概述了全血分析技術以及設備目前的應用現(xiàn)狀與未來的發(fā)展方向。第一部分梳理了全血直接分析，重點介紹目前相對成熟的全血分析設備及其應用。第二部分介紹了全血間接分析，將分析過程分為兩個步驟，首先是分離技術，其次是檢測技術，兩者相結合構成了全血間接分析，具有廣泛的研究背景。第三部分在總結已有研究結果基礎上，針對全血分析的研究仍然受制于繁瑣的操作流程，沉重的分析儀器和高昂的檢測費用等現(xiàn)狀問題進行了探討，提出將全血間接分析進行有效的集成，以解決大體積的離心設備帶來的不便利，進一步將全血間接分析轉換為全血直接分析，通過對血液各類狀態(tài)（溫度、紅細胞壓積等）進行有效的智能算法補償，消除其影響，以實現(xiàn)全血中微量分子的定量表征，最終，降低材料成本、加工成本或設備成本，例如紙片離心，以完成低成本的全血快速分析。

1 全血直接分析

全血直接分析，無需預處理即可快速分析血液狀況，包括各類細胞、蛋白質、代謝物、鹽、激素等生物標志物，全血直接分析可以在很大限度上對患者健康狀況進行評估以及相對應的疾病診斷，特別是在一些資源有限的地區(qū)。隨著時代的更替，技術日新月異，成熟的全血直接分析技術隨之而生，目前主要體現(xiàn)在以下4 個方面：a.活化凝血時間（activated clotting time，ACT），一種用于臨床血液體外循環(huán)手術時的血凝時間監(jiān)測指標；b.血糖監(jiān)測，目前小型化、便攜化、智能化以及家庭化的血糖儀已經廣泛應用；c.細胞特性檢測，例如三大細胞（紅細胞、血小板、白細胞）計數(shù)、循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）等重要單細胞檢測技術趨于成熟，主要代表設備為流式細胞儀，采用光電式技術進行特異性識別以區(qū)分細胞種類；d.血沉檢測也是比較有代表性的一個病理判斷指標。

1.1 活化凝血時間檢測

在體外循環(huán)中，如果沒有合適的抗凝治療手段，在回路中就會快速形成血栓，這類情況是致命的，為了預防重大不良事件，阻止血栓凝塊的形成，ACT 被認定為快速可靠衡量全血凝固能力的指標之一。從1966年Paul［20］提出凝血時間這一概念開始，研究人員經過數(shù)年的探索，利用機械、光學、電學（磁珠振幅、柱塞位移、血液黏稠度）等技術［21-23］成功檢測ACT 指標，成熟的檢測技術被應用于設備研發(fā)，現(xiàn)如今成型設備主要有MAX-ACT （Helena）、 ACT Plus （Medtronic）、Hemochron Jr.（ⅠTC）、 Hemochron Response（ⅠTC）、SCT-CenturyClot（世紀億康）以及i-STAT（Abbott）等?，F(xiàn)有的ACT 檢測方式是從活化劑到反應終點的系統(tǒng)檢測功能，致使ACT 的可重復性問題一直未能解決［24］，但ACT 仍然是心血管手術、重癥監(jiān)護以及血液透析等領域監(jiān)測肝素活性的主要指標。

1.2 血糖檢測

血糖的定期檢測可以對患者的生活規(guī)律、運動飲食以及藥物治療有著重要指導意義，快速的血糖檢測有助于使用者隨時發(fā)現(xiàn)異常身體狀況，及時就醫(yī)。從1968 年開始Tom Clemens 針對血糖檢測提出血糖儀的概念，血糖儀在技術上經過了水洗式、擦血式、光聲式、光電式、比色式以及電化學式等研究歷程［25］，從起初的血液離心檢測到現(xiàn)如今的全血直接分析經歷了數(shù)十年。目前，血糖儀主流的檢測方式分為以下三種：全血光聲式/光電式檢測［26-28］、全血電化學式檢測［29-30］，以及體液（唾液、汗液、尿液等）電化學分析檢測［31］。隨著科學技術的進步，便攜式、低成本的床旁血糖監(jiān)測系統(tǒng)概念的提出，小型化、智能化、高效精準的血糖監(jiān)測設備被不斷開發(fā)。Zhang 等［32］研制了一種基于光聲式的小型血糖檢測設備（圖2），與傳統(tǒng)的光聲（photoacoustic，PA）儀器相比較，擁有體積小、靈敏度高以及較好的穩(wěn)定性等優(yōu)勢。Dai等［33］介紹一種基于凝膠的全血血糖比色檢測方法，無需預先分離血漿即可進行比色檢測，誤差范圍小于9%，與商用血糖儀相比較誤差更小?；诿傅纳飩鞲衅魇悄壳拜^為流行的電化學傳感器，葡萄糖氧化酶或葡萄糖脫氫酶是用于葡萄糖檢測最為廣泛的酶，Thapa 等［34］介紹了一種基于酶的電化學生物傳感器，用于檢測單滴全血中的葡萄糖和乳酸含量。迄今為止，便攜式血糖儀（中國三諾（Sino）、美國強生（Johnson）、瑞士羅氏（Roche）、德國拜爾（Bayer）等）已經廣泛應用于家庭之中，微量血液即可快速分析且設備操作性較強。

Fig.2 Blood glucose detection圖2 血糖檢測

1.3 細胞特性檢測

細胞數(shù)量以及細胞狀態(tài)是衡量身體狀況的重要指標，發(fā)現(xiàn)突變細胞或異常病變細胞是預防和診斷疾病的前提，這就使細胞特性檢測尤為重要。自20 世紀30 年代初，研究人員提出細胞計數(shù)概念，之后的數(shù)十年里，隨著光電技術和計算機技術的快速發(fā)展，單細胞檢測技術經歷了飛速發(fā)展階段?，F(xiàn)如今，高通量、高靈敏度的細胞技術被研究者用于全血細胞計數(shù)［35］以及全血中病變細胞甄別［36］等方面。Zheng 等［37］對氨基酸和聚合物進行了系統(tǒng)性研究，以開發(fā)細胞選擇性熒光標記物聚乙烯亞胺-鈍化生物分子衍生碳點Ⅰ型（PEⅠ-passivated biodots type Ⅰ），用于快速無裂解細胞的血液分析。Xu 等［38］設計了一種近紅外光驅動的熒光納米電機，能夠有效檢測全血環(huán)境中的循環(huán)腫瘤細胞，無需預處理程序，并且能高效（93.75%～98.75%）捕獲CTCs 并以熒光的形式進行表征。Suzuki 等［39］介紹了一種基于微流體收縮和電流傳感系統(tǒng)的機械低通過濾技術（圖3），用于全血中的CTCs 檢測，識別全血CTCs，數(shù)十毫秒內準確率大于95%。

Fig.3 Detection of cell characteristics: mechanical low-pass filtration technology based on microfluidic shrinkage and current sensing system[39]圖3 細胞特性檢測：基于微流體收縮和電流傳感系統(tǒng)的機械低通過濾技術［39］

1.4 血沉檢測

紅細胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）又稱血沉，其沉降快慢、黏度與紅細胞間的聚集力密切相關，臨床上常用血沉作為紅細胞間聚集性的指標，雖然它是一項非特異性檢查指標，無法精確檢查以確診某種疾病，但是被廣泛用作篩查測試和監(jiān)測多種炎癥性疾病的非特異性疾病指數(shù)。在診斷顳動脈炎［40］、風濕性多肌痛、骨髓炎以及追蹤結核病［41］、類風濕性關節(jié)炎和霍奇金病的疾病狀態(tài)中，已有許多紅細胞沉降的臨床應用［42-43］。在某些非炎癥性疾?。òㄖ酗L、心臟病和前列腺癌）中，被認為是關鍵的預后因素。ESR 在1921年由Febreaus Westrygren［44］創(chuàng)立，歷經幾十年，仍被廣泛應用，目前測定方法主要由魏氏（Westergren）法、斜管法、快速發(fā)、微量法、阻抗法以及血沉儀自動測定法（光學）等。傳統(tǒng)的血沉檢測以離心后血細胞為檢測液，操作繁瑣，隨著技術的改進，血沉的測定已經從傳統(tǒng)的魏氏法向全血自動測定發(fā)展。多數(shù)檢驗科室對現(xiàn)有的血沉自動分析儀進行有效的評估，選擇合適的ESR 檢測設備對病情診斷輔助十分關鍵。相對于比較成熟的光學檢測手段，新穎的技術也在逐步研發(fā)，Li等［45］提出一種基于生物電阻抗譜（electrical impedance spectroscopy，EⅠS）的全血血沉檢測技術（圖4），特制的T形容器對血沉的EⅠS測量，提取的多頻參數(shù)電抗Xc和沉降比Rse呈現(xiàn)出良好的線性關系。

2 全血間接分析

全血間接分析，是一種血液采集后需進行特殊預處理的分析技術。在醫(yī)學領域，大部分生化、免疫的項目檢測都是提取血液中的液體成分進行分析，傳統(tǒng)的免疫測定很少采用全血直接分析，普遍需要分離步驟，提取血液中的血漿或血清成分進行免疫分析或其他相關疾病診斷，所謂的血漿是指去掉血細胞的血液，血清是指的去掉纖維蛋白原以及某些凝血因子的血漿，對血漿或血清中的抗原和抗體進行相關檢測，是診斷乙肝、瘧疾、艾滋病等感染的關鍵步驟。本綜述將全血間接分析分為兩個部分，處理技術和檢測技術兩個方面進行展開敘述。

2.1 處理技術

血液屬于結締組織，其組成成分非常復雜，在機體內發(fā)揮著多方面的功能，它的主要成分包含細胞（紅細胞、白細胞和血小板等）與血漿。各類細胞分別起到不同的功能，例如紅細胞含有血紅蛋白起輸送氧氣的作用，白細胞主要起機體抗感染的非特異免疫作用，血小板協(xié)同凝血因子起到凝結防止大量失血作用。血漿中又富含營養(yǎng)物質，代謝產物以及不同種類的蛋白質成分，例如凝血因子用于凝結產生纖維凝塊的纖維蛋白原成分等。血液的復雜成分導致對其的整體分析有阻礙作用，在臨床或者免疫方面，從全血中提取部分有用信息是診斷疾病更有效的方式，另外在檢測過程中也發(fā)現(xiàn)，使用全血進行部分疾病的診斷，紅細胞等因素會嚴重影響測量的準確性。因此，在大多數(shù)常規(guī)檢測，疾病預防、醫(yī)療診斷、康復治療過程中，采取的血樣都需要經過一定的技術處理。本綜述將處理技術簡要分為四種技術進行敘述，分別是膜過濾［47-53］、特殊結構過濾［54-55］、離心［56-57］以及裂解液［58-60］方式。

2.1.1 膜過濾

血液的過濾有助于更好地分析內部成分，在血液分析中，血細胞的存在往往會影響檢測的結果，不管是比色法還是光學法，因為血細胞是血液的主要成分，對于吸光以及視線傳達都產生影響，從而導致測量結果存在誤差。膜作為一種較為便捷的過濾方式被研究人員廣泛應用于全血分離的試驗中，對膜孔大小的參數(shù)設計能夠很好地篩選大小不一的細胞，從而達到分離的目的。本綜述根據膜過濾的受力形式，將其分為主動式過濾和被動式過濾。

a.主動式膜過濾

主動式膜過濾，定義為依靠血液重力驅動，自主分離達到過濾效果，也可以稱為重力過濾，是一種比較常見的方式。Osemwengie等［61］提出一種利用新型重力驅動的血液分離裝置，基于錯流微濾技術，有效地將全血分離成血漿和富含血小板的紅細胞，回收率均高達80%以上。Morita 等［62］提出依靠重力作用進行自由落體運動來過濾全血，對膜的直徑控制在8～10 μm 以達到篩選目的，可以達到15%的分離率提取CTC 模型。眾所周知，單純控制膜孔的直徑達到高效過濾效果是不夠完善的，過濾器往往會因為個別體型較大細胞或細胞堆積引起堵塞問題。Zhao等［63］為克服這一挑戰(zhàn)，提出新的高選擇性、友好性、高效的超級過濾器（圖5），在過濾過程中選擇性的改善抗體修飾的微孔壁與細胞的接觸面積，達到高效和選擇性捕獲CTC。

Fig.5 Diagram of active super filter for affinity capture of tumor cells in complex body fluids［63］圖5 主動式超級過濾器用于復雜體液中親和捕獲腫瘤細胞示意圖［63］

b.被動式膜過濾

被動式膜過濾，定義為血液受外力驅動，被動分離達到過濾效果。以往的研究都是利用簡單的膜孔過濾，分離的效果并不是特別好，主動式過濾往往會因為堵塞又不能快速疏通，不能連續(xù)性工作，無法達到高效率回收和精確檢測的目的。被動式過濾采用新型的外驅動力，能有效解決上述問題，Gonzalez-Suarez 等［64］設計一種主動混合功能的系統(tǒng)（圖6a），用于快速檢測微量全血中的葡萄糖，基于膜孔結構，采用毛細力輸送以及正負氣壓分離進行血液的過濾。隨著過濾膜以及材料改性的快速發(fā)展，紙基式檢測裝置迅速發(fā)展，Gao 等［65］基于功能性的過濾膜組件，實現(xiàn)了血漿的分離以及蛋白質 檢 測（圖6b）。Xu 等［66］、Wang 等［67］以 及Komatsu等［68］利用血液分離墊、吸收墊與NC膜組成實現(xiàn)了血漿的分離，組裝裝置依靠毛細力驅動，成功在全血中分別檢測了兩種肝膽疾病相關標志物、螺旋旋毛蟲以及鋰離子含量。相較于主動式膜過濾，被動式膜過濾因操作簡單、成本低廉以及耗時短等優(yōu)勢在床旁檢測或者早期自我檢測方面被廣泛采用，隨著微流控的快速發(fā)展，微流控紙基分析設備在全血分析也將全面普及。

Fig.6 Passive membrane filtration圖6 被動式膜過濾

2.1.2 特殊結構過濾

基于傳統(tǒng)過濾膜的想法，研究人員在特殊結構與流體技術相結合方面，做了不少的研究。過濾膜一直是一種靜態(tài)的結構，其形狀大小設計取決于不同種類細胞的固定屬性，即使是外力驅動也會存在難過濾、阻力大等問題。如何克服靜態(tài)膜帶來的問題，實現(xiàn)高效高通量過濾全血是一個重要的課題，F(xiàn)ukuyama等［69］提出一種機械結構和流體技術相結合微過濾器（圖7），根據流體的流速和壓力動態(tài)改變機械結構過濾孔的大小，實現(xiàn)全血中的癌細胞檢測。新式的動態(tài)檢測在一定程度上有利于血液的快速流動及分離，未來智能化與特殊結構相結合，對細胞的快速篩選有著重要的意義。

2.1.3 離心

離心是血液分離的主要手段之一，離心技術隨著科技的發(fā)展日新月異，本綜述中將離心分為兩種形式，分別是分布式離心和集成式離心（圖8）。所謂的分布式離心，是基于傳統(tǒng)離心機，利用物體高速旋轉，使得離心管體中的物質之間因密度、形狀或大小差異受到不同離心力，達到濃縮或是與其他成分分離等目的，這種高過濾效果的傳統(tǒng)離心方式被廣泛應用于生物學、醫(yī)學等領域。在目前的醫(yī)院中，臨床化學和臨床免疫大都是依靠離心機器對血液進行前期的處理，提取血液中的血清進行篩查。這種分布式離心的方式，操作復雜，且過程繁瑣，耗費較長的時間，在偏遠或醫(yī)療條件匱乏的地區(qū)，大型的離心設備更加無法得到很好地應用。集成式離心的產生，有效地解決成本高和測試時間長等問題，所謂的集成式離心是將離心技術與微流控技術相結合，制成便攜式、小型化裝置。Yang等［70］基于離心微流體平臺，有效地從全血中提出純化的血漿；Zhou等［71］采用微流體盒，通過離心的方式對全血中的金黃色葡糖球菌進行檢測；Kim等［72］同樣基于離心微流體設備，成功提取了高純度（＞99%）的血小板。微流體的發(fā)展給傳統(tǒng)血液離心處理帶來了較大的沖擊，但是目前集成式離心技術還不夠成熟，小型化的裝置有賴于精巧的內部結構，例如虹吸閥，如何控制血液離心再到提取都是需要經過嚴密的設計，包括小型化的各項技術融合同樣是瓶頸，真正智能化、便攜化還有賴于各項技術的不斷發(fā)展。

Fig.7 Dynamic deformable microfilter schematic［69］圖7 動態(tài)可變形微過濾器示意圖［69］

Fig.8 Centrifugal microfluidic chip and traditional centrifuge process［56］圖8 離心微流控芯片以及傳統(tǒng)離心機工藝流程［56］

2.1.4 裂解液

在特定細胞的分離提純或者核酸提取實驗中，往往會添加裂解液，以消除多余成分對檢測的影響。裂解液一般采用的是化學裂解法和酶裂解法，常規(guī)的全血分析中，會使用到紅細胞裂解液、白細胞裂解液等，例如蛋白質、核酸分離和提取，紅細胞會嚴重影響純度，因此添加裂解液，利用其無核特性以及細胞內外離子濃度差異達到膨脹裂解效果。Qiu 等［73］采用紅細胞裂解液消除紅細胞對光檢測的影響，成功從全血中檢測和鑒定膿毒癥細菌。Narayana Ⅰyengar等［58］基于選擇性細胞裂解樣品制備與高靈敏度光化學反應相結合，在全血樣品中檢測出膿毒癥細菌（圖9）。Zhu 等［74］利用紅細胞裂解液在全血中提取白細胞，裂解模塊可實現(xiàn)94.2%的高效混合。裂解液的使用已經廣泛普及，包括各類流式細胞儀器設備中，都集合了各項裂解技術和試劑，以達到快速細胞區(qū)分等功能。裂解液的使用增進了全血快速分析的進程，但是化學試劑的使用需要考慮其對細胞活性的影響，嚴格遵守裂解液操作規(guī)范是檢測準確的保障。

Fig.9 Working principle of selective isolation and detection of bacteria in whole blood based on lysis buffer［58］圖9 基于裂解緩沖液于全血中選擇性分離和檢測細菌的工作原理［58］

2.2 檢測技術

全血間接分析首先通過對血液的預處理或樣品制備，然后通過各類檢測技術進行快速的成分分析和疾病診斷。本綜述將現(xiàn)有主流的血液檢測技術分點羅列并敘述，分別是膠體金法［75-76］、光散射和吸收法［77-79］、電化學分析［80-82］、表面增強拉曼散射［83-88］、化學發(fā)光法［89］、熒光法［90］、表面等離子體共振［91-92］、石英晶體微天平［93］。

2.2.1 膠體金法

膠體金是氯金酸通過還原劑還原后聚合而成的金顆粒，并通過靜電作用形成膠體狀態(tài)，是免疫電鏡技術中比較適用的免疫標記物。膠體金法可分為免疫膠體金電鏡染色法以及膠體金免疫層析法。免疫膠體金電鏡染色法是一種綜合免疫技術、電鏡技術以及膠體金染色技術的檢測手段，在堿性環(huán)境下，膠體金與抗體吸附，當標記后的抗體與抗原發(fā)生反應后，會呈現(xiàn)櫻紅色從而達到特異性檢測目的。免疫膠體金層析法是一種綜合免疫技術、試紙條層析技術、膠體金染色技術的檢測技術，將血液樣本滴在樣品墊，經膜過濾后，流經膠體金標記抗原/抗體的反應區(qū)，根據顯色反應判斷患者是否感染，其主要過程如圖10 所示。Ren 等［94］開發(fā)了一種快速檢測試劑盒，采用免疫膠體金層析法檢測了心臟型脂肪酸結合蛋白（H-FABP）在血漿和全血中的含量，其敏感性為1 μg/L，特異性、穩(wěn)定性均良好。Jiang等［95］基于免疫膠體金層析法，在全血樣本中快速檢測西羅莫司，可見檢測限和截止限分別為20 μg/L 和100 μg/L。目前全世界仍在持續(xù)經歷的新冠疫情，對于新冠病毒的檢測手段也層出不窮，標準核酸診斷方式的假陰性率不可否定，Pan等［96］提出基于免疫膠體金層析法診斷由嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）感染造成的新型冠狀病毒感染（COVⅠD-19），敏感性在早中晚期分別達到11.1%、92.9%以及86.8%，用以一種臨床應用的補充方法。膠體金法通過顯色反應判斷患者是否陽性，操作方便快捷，用肉眼即可判斷，但是膠體金法普遍是定性或者半定量的檢測方式，在早期篩查過程中應用廣泛，更精確地檢測仍需高精度的檢測技術，如酶聯(lián)免疫等。

Fig.10 Rapid detection of IgM antibodies against SARS-CoV-2 virus by cross-flow assay based on colloidal gold nanoparticles［75］圖10 基于膠體金納米顆粒的橫流測定法快速檢測針對SARS-CoV-2病毒的IgM抗體［75］

2.2.2 光散射和吸收法

光散射和吸收法是一種通過生物介質固有光吸收以及散射特性形成的光學技術（圖11）。目前比較熟知的紅外光譜法（紅外吸收光譜法）、免疫比濁法都是醫(yī)學血液分析領域使用的方法。紅外光譜法指的是將一定頻率的紅外光照射分子產生共振，吸收紅外光，產生振動躍遷的現(xiàn)象。Rassel 等［97］發(fā)現(xiàn)，中紅外輻射在葡萄糖的分子指紋區(qū)域具有強烈的吸收峰，利用量子級聯(lián)激光器產生中紅外光源，成功檢測了糖尿病患者全血中的血糖濃度。Dos Santos Cardoso 等［98］通 過 波 長940 nm 和805 nm 的紅外光分析和實現(xiàn)了無創(chuàng)血糖監(jiān)測儀。免疫比濁法又可以細分為免疫透射比濁法、免疫散射比濁法以及免疫乳膠比濁法，一般用于抗原抗體結合動態(tài)測定，一定波長的光對溶液進行照射時，光吸收程度或光的散射（偏轉角度）與復合物量大小以及含量多少密切相關，這種現(xiàn)象統(tǒng)一稱為免疫比濁法。Zeng等［99］利用比濁法研究了不同凝血條件下的纖維蛋白凝塊形成，Pieters等［100］解釋和驗證了血漿凝塊的濁度分析。光學檢測方法是目前醫(yī)學領域較為主流的檢測方式，因其無創(chuàng)、便攜、操作簡單等優(yōu)勢，在免疫分析、臨床診斷得到廣泛應用。血液的復雜性在一定程度上限制了光學技術的伸展，目前成熟的光學技術普遍采用去除血細胞的方式，未來攻克全血直接分析檢測將是光學檢測的重大突破。

Fig.11 Light scattering and absorption method圖11 光散射和吸收法

2.2.3 電化學分析

電化學分析是一個比較廣泛的研究領域，涉及工業(yè)能源、化學分析等領域。在醫(yī)學診斷上，電化學分析方法在疾病免疫測定方面起著重要作用。電化學分析檢測原理是將檢測物的物理/化學信號轉化為檢測電極的電信號（圖12）。在分析化學領域，電化學分析主要分為電流式、阻抗式以及電位式，在各類免疫應用（免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附等）中作為主要的檢測手段。例如，Ahmadi等［101］描述了一種基于纖維素納米纖維CNs 的新型電化學紙基分析設備，在葡萄糖氧化酶成功固定在CN層，采用電化學分析方法（循環(huán)伏安法CV，電化學阻抗譜EⅠS）成功檢測全血樣品中的葡萄糖濃度，檢測限為0.1 mmol/L。Kim 等［102］制造一種紅細胞偽裝的生物傳感器，采用電化學分析方法對于全血樣品中細菌分泌的α溶血素進行檢測，檢測限度為1.9 μg/L，動態(tài)范圍為0.000 1～1 g/L。上述研究側重于檢測物質的變化，例如抗原抗體結合，引起的電極表面電荷轉移速率的改變。Li等［103］根據EⅠS在區(qū)分細胞甚至蛋白質信息方面的優(yōu)勢，提出利用EⅠS 進行血栓的定量測量和評估。Wen 等［104］基于EⅠS定量研究了紅細胞聚集對脈動流動過程中正常血液介電特性（非凝血）的影響。這種研究側重于細胞/組織的電學特性，根據待檢測樣品的成分變化或狀態(tài)改變，引起整體檢測區(qū)域的電特性轉變，是一種區(qū)別與傳統(tǒng)EⅠS檢測的研究方法。綜上所述，電化學分析在醫(yī)學領域，尤其是血液分析中有著重要的地位，對于血液狀態(tài)，血液中的細菌、抗體、抗原等生物物質檢測有著較高的靈敏度，對生物個體無創(chuàng)、無輻射，是一種比較常規(guī)、熱門的檢測技術。

Fig.12 Electrochemical analysis圖12 電化學分析

2.2.4 表面增強拉曼散射

拉曼散射，是1928 年由印度物理學家拉曼發(fā)現(xiàn)，他在實驗中觀察到單色的入射光投射到物質中產生散射，發(fā)現(xiàn)散射光中存在與入射頻率不同的散射光，其強度大約入射光的10-6～10-9。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)，在少數(shù)基體表面（金、銀、銅或半導體），吸附物質后會增強拉曼散射強度，并將這種現(xiàn)象稱為表面增強拉曼散射（surface enhancement of Raman scattering，SERS）（圖13）。例如，金屬電極表面修飾抗原/抗體、金納米顆粒結合抗體/抗原等方面均可利用SERS技術進行高靈敏檢測，并且SERS 采用光譜檢測方式，具有無創(chuàng)、無標記等優(yōu)勢，逐漸成為化學、生物醫(yī)學分析、免疫測定的主要技術之一。Lei 等［105］基于SERS 和熒光雙模式法，對金納米顆粒修飾的聚苯乙烯微球作為等離激元偶聯(lián)微腔適配子，分別以3 cfu/ml 和2 cfu/ml 的超靈敏檢測限度實現(xiàn)了全血中金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌的檢測。Sun等［106］開發(fā)了一種通用的SERS 水凝膠丸，當血糖出現(xiàn)時，發(fā)生銀鏡反應，［Ag（NH+3）2OH］分子可由葡萄糖醛基還原生成AgNPs，原位產生的AgNPs可沉積在AuNPs 表面，可顯著增加先前負載在AuNPs上的4-MBN的SERS信號，實現(xiàn)葡萄糖的定量測量，最低檢測限為10 μmol/L。Zhu等［107］提出了一種基于疏水組裝納米橡子（HANA）的SERS吸附傳感器，在全血樣品中以高靈敏度和良好的重現(xiàn)性（相對標準偏差（RSD）＜7%）分析了人表皮生長因子受體和3 種外泌體蛋白。SERS 技術在不同領域得到了廣泛應用，但是對于SERS技術的使用限制還存在很大挑戰(zhàn)，例如受制于極個別材料的SERS 效應，材料表面粗糙度處理以及SERS 產生機理理論等問題，這些將是未來SERS得到更寬闊的應用領域亟待解決的難題。

2.2.5 化學發(fā)光法

化學發(fā)光法（chemiluminescence，CL）是光譜分析中的一類，主要依據化學檢測體系中發(fā)光強度與檢測物質濃度之前的量化關系?；瘜W發(fā)光一般指某種物質分子吸收化學能后產生的光輻射，通過檢測光輻射強度表征物質分子含量，一般包含化學激發(fā)和發(fā)光兩個步驟（圖14）。研究領域多數(shù)為氧化還原反應，常常依靠幾種高效發(fā)光劑，例如魯米諾及其衍生物，光澤精、吖啶酯等。Zhao 等［108］采用吖啶酯發(fā)光劑，報道了一種HbA1c/Hb檢測的新型時間分辨率化學發(fā)光測定方法，通過區(qū)分兩種化學發(fā)光峰值即可確定HbA1c/Hb 濃度。Saito等［109］基于魯米諾化學發(fā)光反應，檢測犯罪現(xiàn)場的痕量血液，成功區(qū)分全血產生的化學發(fā)光和六氰基高鐵酸鉀（ⅠⅠⅠ）引起的化學發(fā)光。除去傳統(tǒng)的發(fā)光試劑，研究人員發(fā)現(xiàn)，一些熒光試劑同樣可以用來替代CL 試劑產生光輻射，Huang 等［110］根據鈣黃綠素化學發(fā)光現(xiàn)象， 提出 calcein-H2O2-Au@BSANCs-Cu2+體系用于全血種谷胱甘肽（GSH）的檢測，其檢測限達到0.29 mmol/L。CL是一種功能強大的檢測技術，具有高靈敏度，低噪聲比信號以及簡易設備等優(yōu)勢，促進了其在生物工程、臨床診斷（腫瘤標志物、感染性疾病、過敏反應以及治療藥物濃度監(jiān)測等）、分子生物學環(huán)境監(jiān)測等領域的廣泛應用，但是CL在選擇性較差，發(fā)射強度取決于外部因素，對于設備光線環(huán)境要求比較嚴格。

Fig.14 Strategy of cell-assisted enhanced CL［89］圖14 細胞輔助增強型化學發(fā)光策略［89］

2.2.6 熒光法

所謂的熒光是指物體經過短波長的光照射后輻射出較長波長的光。熒光法，是根據每一種物質的熒光效應存在特定吸收光的波長和發(fā)射的熒光波，利用這一特性以達到鑒定不同物質的目的。在醫(yī)學診斷中，一般將小的、化學穩(wěn)定性好的熒光基團（熒光素）作為抗體和其他生物分子的標記物，將其修飾于蛋白質、核酸和其他生物分子上，再通過熒光顯微鏡、流式細胞儀或其他熒光檢測設備進行檢測。目前比較流行的聚合酶鏈式反應（PCR）技術結合熒光技術可以實現(xiàn)實時熒光標記物定量檢測。如Chinnappan等［111］提出使用熒光置換測定法可以檢測少數(shù)乳腺癌microRNA序列，最低下限可低至1 pmol/L 水平的miRNA。Xu 等［112］利用全血CTC 中催化發(fā)夾組件系統(tǒng)與細胞內microRNA-21相互雜交誘導熒光基團（ATT0488）產生強烈的熒光現(xiàn)象，實現(xiàn)了全血中CTC 的原位檢測（圖15）。熒光法應用廣泛，具有良好的選擇性，能夠避免不乏熒光的成分干擾，但是背景熒光或者說猝滅效應等干擾對于樣品的測定影響程度需要列入主要考慮的范疇。

Fig.15 Working principle of CTC detection in whole blood based on fluorescence［112］圖15 基于熒光法的全血循環(huán)腫瘤細胞檢測工作原理［112］

2.2.7 表面等離子體共振

在1902年Wood的光學實驗發(fā)現(xiàn)表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）現(xiàn)象，經過近70 余年的沉淀積累，SPR 在傳感器方面才得到了初步應用（圖16）。SPR 基于消逝波以及等離子波發(fā)生共振原理，檢測發(fā)射光強度大小判斷生物分子之前相互作用的信號，這種方法具有無標記、無損傷等優(yōu)勢，廣泛應用于研究結合特異性、抗體選擇、小分子間相互作用等。Qu 等［113］基于開發(fā)的FO-SPR設備，測試了一種無需樣品預處理或稀釋的全血樣本檢測陰性樣本的功能，證實了其可行性。Kotlarek 等［114］提出基于SPR 的3 種凝血酶適配體，用于檢測分析10%血液種的凝血酶濃度。Heidarzadeh等［115］采用不同形狀的銀等離子體納米顆粒來檢測人體血液種的血紅蛋白濃度，根據等離子體共振產生光的折射率來量化實際濃度。在復雜的血液環(huán)境中，尤其是混濁甚至不透明的樣本中，SPR傳感技術發(fā)揮了其顯著的優(yōu)勢，但是與傳統(tǒng)的免疫檢測手段相比，其在穩(wěn)定性、檢測效率、檢測成本方面還有待提升。

2.2.8 石英晶體微天平

Fig.16 Quantitative characterization of whole-cell protein binding based on SPR imaging［91］圖16 基于表面等離子體共振成像的全細胞蛋白質結合定量表征示意圖［91］

石英晶體微天平（quartz crystal microbalance，QCM），發(fā)展始于20 世紀60 年代初期，是一種非常靈敏的檢測設備，該技術原理是基于石英晶體的壓電效應，所謂的壓電效應是指在石英晶體表面施加機械外力，內部會產生極化現(xiàn)象，在相對表面出現(xiàn)正負相反的電荷形成電場（圖17）。?ah?n Sadik等［116］提出一種使用QCM 的傳感器系統(tǒng)，在全血中提取血清進行血糖水平檢測，QCM 傳感器表現(xiàn)出較高的檢測精度，平均誤差為3.25%。Atar等［117］開發(fā)出一種新型QCM 免疫傳感器，能夠應用于高選擇性的ⅠL-6 游離血漿樣品，最低檢測度為3.33 pg/L。QCM 是一種無標記、高靈敏度、低成本的設備，在醫(yī)學免疫質量分析上具有很大的潛力。但是如何將檢測物均勻地涂覆在檢測表面上，實現(xiàn)準確的結果和可重復性是QCM 發(fā)展面臨的最大挑戰(zhàn)之一。

Fig.17 Working principle of QCM［93］圖17 石英晶體微天平工作原理［93］

3 總結與展望

很多人體內部的疾病變化是難以通過肉眼去觀察發(fā)現(xiàn)，全血分析是前期疾病篩查的重要手段之一，醫(yī)生可以通過患者血液的成分變化和經驗來推測可能會預發(fā)的疾病，也可以通過精確的檢測技術來判斷是否患有某種疾病。目前全血分析有兩種方式，全血直接分析以及全血間接分析，全血直接分析技術適用于血液狀態(tài)（黏度和凝聚等）以及常規(guī)細胞（紅細胞、白細胞、血小板和淋巴細胞等）計數(shù)監(jiān)測，全血間接分析普遍應用于微量成分（細菌、病毒和病變細胞等）篩查。

現(xiàn)階段，除去常規(guī)血液成分分析外，全血分析在多數(shù)疾病篩查項目中，由于送檢過程久、樣本排隊費時長、樣本前期處理復雜、報告反饋時間長等缺陷導致檢測流程過長，無法做到疾病的及時監(jiān)測，可能貽誤患者治療時間。如何實現(xiàn)現(xiàn)場采樣即刻分析、快速得到檢驗結果，形成檢測方法簡單易行、設備便攜、無需固定場所、檢測耗時短等優(yōu)勢，達到“早檢測，早發(fā)現(xiàn)，早治療”的目的，是全血檢測技術研究中一個亟待發(fā)展的領域。

根據目前的研究現(xiàn)狀，本綜述對于全血分析現(xiàn)存問題以及相應的未來發(fā)展有如下評述：

a.研制集成化、便攜化裝置。疾病的前期快速篩查對生命健康保障尤為重要，基于全血間接分析技術發(fā)展趨勢，處理技術以及檢測技術在單方面已經比較完善，但是多步驟操作過程（分布式）帶來的人為或系統(tǒng)誤差在一定程度上影響檢測的精確性，如離心過后的血液分層提取很大程度上受制于人主觀意識的影響，導致提取的試樣存在純度不足問題，亟待研究集成化裝置；集成化、便攜化裝置的普及，能夠大幅度降低患者連接醫(yī)院的消費成本以及時間成本，以預防為前提，自測自檢，提高就診效率，同樣為有限的醫(yī)療資源得到充分的利用，在保障個人的生命健康，同時也節(jié)省大量費用支出，裝置的集成化、便攜化已成為一個必然趨勢。至于集成化裝置如何做到聯(lián)合，設計便攜微型尺寸又能集成高分離效率結構，高靈敏度、高響應時間檢測技術，例如研制精密的機械結構用于血液前期預處理，結合生物與醫(yī)學方面的免疫、臨床等知識，采用生物兼容性較好的材料，搭配互聯(lián)通信技術，實現(xiàn)自我醫(yī)療診斷，這有待于機械、生物、醫(yī)學、材料、計算機等領域共同推進。

b.研制智能化裝置。全血直接分析技術目前應用范圍較為局限，到目前為止，全血直接分析技術在很大程度上仍受制于血液成分干擾，例如血細胞在血液中含量較多，發(fā)生非凝血聚集或其他狀態(tài)改變都會影響檢測精度，前期的研究表明［45］，血細胞的沉降會影響分析結果，需要對其進行定量表征以排除影響；又如前期對血液溫度規(guī)律的研究表明［118］，血液溫度變化與阻抗特性有良好的線性關系，這就說明對于實時環(huán)境溫度的補償將利于提高檢測精度。在未來的血液分析方面，結合補償技術、智能算法［119-120］排除物質成分或環(huán)境因素等影響，對存在于血液中的微量成分進行快速分析提供有利支撐，將會對全血直接分析具有巨大的推進作用。

c.研制低成本裝置。分離或過濾系統(tǒng)需要離心機，這在便攜化裝置中難以實現(xiàn)，紙片離心機的出現(xiàn)［121］，在滿足離心效果的前提下，實現(xiàn)了快速全血分離，操作方便且制作成本低廉，為后續(xù)推進低成本裝置提供了新思路。檢測系統(tǒng)如需要顯微鏡、泵、光源以及電源將很難應用于便攜式設備中，上述微型化的檢測系統(tǒng)又會加重成本，不適用于經濟不發(fā)達、醫(yī)療措施不完善的地區(qū)，而電化學分析檢測系統(tǒng)不同于光學系統(tǒng)，省去了部分硬件需求，有效降低成本，更適用于集成化裝置，例如基于電化學分析的諸多免疫傳感器。近年來，將樣品預處理、分離、檢測等操作單元集成，已經在生命科學領域快速發(fā)展，主要代表是微流控芯片，但是微流控芯片綜合了各項技術，包括光刻、控制芯片等等，研制成本較高，在商業(yè)領域還有很長一段路要探索。低成本裝置的未來發(fā)展，從微流控芯片的角度出發(fā)，一方面，芯片設計如能達到模塊化且其加工技術較為成熟將有更多的應用平臺，大量研究精力和資金投入隨之帶來的相關配套產業(yè)將有利于成本的把控；另一方面，進一步研究探索新型加工技術或低成本平替材料，同樣能夠提高其應用價值。