肖子怡 吳曉敏 關(guān) 凡 曾朝陽(yáng) 熊 煒 王芙艷*

（1）中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；2）中南大學(xué)腫瘤研究所，國(guó)家衛(wèi)健委癌變?cè)碇攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和教育部癌變與侵襲原理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410078）

疫苗是醫(yī)學(xué)發(fā)展史上最杰出的成就之一，是預(yù)防傳染病最經(jīng)濟(jì)最有效的措施。通過(guò)激活免疫系統(tǒng)，疫苗使機(jī)體建立了對(duì)病原體的防御機(jī)制。由于疫苗的廣泛使用，天花疾病已被消滅，脊髓灰質(zhì)炎、麻疹和其他兒童疾病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)大幅降低［1］。從中國(guó)古代的種痘、英國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)生Edward Jenner 的牛痘疫苗預(yù)防天花到如今的嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）疫苗，疫苗由傳統(tǒng)的第一代疫苗（滅活疫苗、減毒活疫苗和類毒素）發(fā)展至第二代（重組蛋白疫苗、亞單位疫苗）和第三代疫苗（基因疫苗）。2023 年10 月2日，瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院宣布將2023 年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予匈牙利科學(xué)家卡塔琳·卡里科（Katalin Karikó） 和美國(guó)科學(xué)家德魯·韋斯曼（Drew Weissman），以表彰他們對(duì)于核苷堿基修飾技術(shù)的發(fā)現(xiàn)，以及德魯·韋斯曼在遞送系統(tǒng)方面的貢獻(xiàn)，從而為開(kāi)發(fā)有效的抗SARS-CoV-2 mRNA疫苗所做出的重要貢獻(xiàn)。

1798 年， Edward Jenner 提 出 了 疫 苗（vaccination）的概念，開(kāi)創(chuàng)了人工主動(dòng)免疫的先河。隨著病原菌的發(fā)現(xiàn)，法國(guó)微生物學(xué)家和化學(xué)家巴斯德制備了首個(gè)減毒狂犬病疫苗，隨后，Calmette和Guerin將牛型結(jié)核分枝桿菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)13年傳代213 代后，將卡介苗（Bacille Calmette-Guerin，BCG） 應(yīng)用于預(yù)防結(jié)核??；針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒的Salk 疫苗［2］展現(xiàn)了良好的預(yù)防效果，但因生產(chǎn)過(guò)程中的失誤（未被完全滅活）導(dǎo)致了149例小兒麻痹癥，卻催生了口服減毒疫苗（Sabin疫苗）；此外還有麻疹-流行性腮腺炎-風(fēng)疹三聯(lián)疫苗、白喉-破傷風(fēng)類毒素疫苗等。這些第一代傳統(tǒng)疫苗通過(guò)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生針對(duì)特定病原體的抗體或效應(yīng)T 細(xì)胞，是預(yù)防傳染病的有力武器。但由于這些疫苗成分較為復(fù)雜，有一定的副反應(yīng)發(fā)生，如減毒活疫苗有毒力回復(fù)的風(fēng)險(xiǎn)等。第二代疫苗是由病原體的天然成分或其產(chǎn)物制成的亞單位疫苗和通過(guò)基因工程技術(shù)制備的重組蛋白疫苗。它們通過(guò)特定抗原蛋白而不是完整的病原體來(lái)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，減少了潛在的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)提高了疫苗的免疫效果。如通過(guò)DNA 重組技術(shù)制備的乙肝疫苗是疫苗發(fā)展新的里程碑，標(biāo)志著疫苗發(fā)展進(jìn)入了分子時(shí)代。雖然傳統(tǒng)疫苗，如減毒活疫苗、滅活疫苗以及亞單位疫苗，可以對(duì)各種傳染病提供持久的保護(hù)［3］。但對(duì)于新發(fā)傳染病或傳染病的大流行，需要更快速的開(kāi)發(fā)和大規(guī)模部署，亟需開(kāi)發(fā)新一代疫苗。

第三代疫苗為核酸疫苗，代表了當(dāng)代疫苗研究的最新進(jìn)展。這一類疫苗的核心特點(diǎn)是使用核酸分子，如RNA 或DNA，作為構(gòu)建疫苗的基本材料。這些核酸分子經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)，攜帶目標(biāo)病原體的遺傳信息。核酸疫苗導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)源性表達(dá)抗原，可以模擬病原體感染［4］。此外，DNA 或mRNA 疫苗無(wú)需專職抗原提呈細(xì)胞（antigenpresenting cells，APC）攝取也可表達(dá)產(chǎn)生相應(yīng)蛋白質(zhì)抗原，刺激B 細(xì)胞或T 細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。核酸疫苗的生產(chǎn)無(wú)需在生物安全水平較高的實(shí)驗(yàn)室，并且完全無(wú)毒性的疫苗成分也利于免疫功能低下人群的疫苗接種［5］。近年來(lái)，mRNA 疫苗受到了特別關(guān)注，并表現(xiàn)出優(yōu)于DNA 疫苗的一些優(yōu)勢(shì)，例如僅靶向遞送至細(xì)胞質(zhì)、消除基因組整合的風(fēng)險(xiǎn)以及獨(dú)立于細(xì)胞分裂發(fā)揮其功能［6］。但是RNA 疫苗在生產(chǎn)過(guò)程中需要額外的步驟，且其具有高免疫原性，容易在離體和體內(nèi)降解，而DNA疫苗更熱穩(wěn)定，有利于儲(chǔ)存。

正如前文所述，傳統(tǒng)的mRNA 疫苗具有一定的免疫原性，因此在注射入體內(nèi)后，往往會(huì)因?yàn)榧せ钸^(guò)度的炎癥反應(yīng)，降低疫苗的效力，同時(shí)劇烈的炎癥反應(yīng)還可以對(duì)機(jī)體造成傷害。然而，卡塔琳·卡里科和德魯·韋斯曼通過(guò)核苷酸修飾技術(shù)和RNA 遞送系統(tǒng)，使mRNA 疫苗的穩(wěn)定性和表達(dá)量都得到了顯著提升。這一技術(shù)的突破對(duì)于全球范圍內(nèi)對(duì)抗COVⅠD-19疫情發(fā)揮了重要作用。

1 mRNA在體內(nèi)表達(dá)多肽的關(guān)鍵技術(shù)突破

1.1 核苷修飾

早在21 世紀(jì)以前，體外合成mRNA 的技術(shù)就已經(jīng)發(fā)展起來(lái)，但是因?yàn)槭敲阜ê铣?，所以體外轉(zhuǎn)錄的mRNA 不僅僅包括目的產(chǎn)物mRNA，還通常含有dsRNA 污染物。目的產(chǎn)物mRNA 具有高免疫原性，作為ssRNA，可以被內(nèi)體的先天免疫受體Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）7、TLR8 識(shí)別（圖1）。污染物dsRNA 可以被內(nèi)體先天免疫受體TLR3、 視 黃 酸 誘 導(dǎo) 蛋 白1 （retinoic acidinducible protein 1，RⅠG-1）、2'-5'-寡腺苷酸合酶（2'-5'-oligoadenylate synthase，OAS）和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白 5 （melanoma differentiationassociated protein 5，MDA5）識(shí)別［7-9］。mRNA 若要成為能夠誘導(dǎo)強(qiáng)大免疫反應(yīng)的疫苗，它需要激活先天免疫和適應(yīng)性免疫。顯然，體外合成的mRNA可以直接激活上述模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs），觸發(fā)炎癥反應(yīng)，建立先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的聯(lián)系。這賦予了mRNA“自我佐劑”的特性，這對(duì)于它成為高效力的疫苗來(lái)說(shuō)是非常重要的。但事物都具有兩面性，擁有“自我佐劑”特性的同時(shí)，也意味著先天免疫系統(tǒng)會(huì)對(duì)mRNA 表現(xiàn)出抗病毒反應(yīng)［7］。例如，TLR7 和TLR8 的激活會(huì)產(chǎn)生大量的Ⅰ型干擾素特別是ⅠFN-α。ⅠFN-α 可以誘導(dǎo)OAS 家族基因的表達(dá)，產(chǎn)生以酶原形式存在的寡腺苷酸合成酶，而寡腺苷酸合成酶在dsRNA 的激活下，會(huì)催化合成2'-5'寡核苷酸。然后由2'-5'寡核苷酸激活核糖核酸酶RNase L，最后由激活的RNase L 降解外來(lái)mRNA［10-13］。

dsRNA 的污染以及mRNA 的高免疫原性使得這些體外合成的mRNA 應(yīng)用十分局限。針對(duì)dsRNA 的污染，可以在合成完成以后采取純化的方式解決，但僅僅解決這個(gè)方面還不足夠。體外合成的mRNA 因?yàn)楦呙庖咴裕⑸溥M(jìn)機(jī)體就要面臨被降解的風(fēng)險(xiǎn)，這顯然不符合研究人員預(yù)期。面對(duì)這樣的局面，Karikó 等［14］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體外轉(zhuǎn)錄的mRNA 之所以會(huì)激活TLR3、TLR7 和TLR8，是因?yàn)檫@些mRNA 缺乏核苷修飾。哺乳動(dòng)物mRNA 幾乎不刺激樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，是因?yàn)椴溉閯?dòng)物mRNA 具有核苷修飾，包括m5C（5-methylcytidine）、m6A （N6-methyladenosine）、m7G （N7-methylguanosine） 和 假 尿 苷（pseudouridine，Ψ）等。當(dāng)額外加入m5C、m6A、m5U（5-methyluridine）、s2U（2-thiouridine）或者Ψ 時(shí)，mRNA 刺激TLR3、TLR7 和TLR8 的能力會(huì)被限制。修飾核苷m6A和s2U可以限制TLR3的激活，修飾核苷m6A、m5C、m5U、s2U和假尿苷則可以限制TLR7和TLR8的激活。TLR3、7、8激活被限制之后，Ⅰ型干擾素的分泌大大減少，并且它們可以對(duì)RNase L 的切割表現(xiàn)出抗性［12］。這些都解釋了為什么1963 年的研究會(huì)發(fā)現(xiàn)，向動(dòng)物體內(nèi)注射用亞硝酸處理過(guò)的同源RNA，動(dòng)物體內(nèi)均會(huì)產(chǎn)生干擾素。這是因?yàn)閬喯跛崽幚砗蟮腞NA，尿苷的含量會(huì)大大增加，先天免疫的激活也會(huì)增強(qiáng)［15］。

除此之外，前面還提及了RⅠG-1，而體外合成mRNA 能和RⅠG-1 相互識(shí)別的原因是體外合成mRNA 具有和病毒RNA 一樣的結(jié)構(gòu)，也就是5′-三磷酸基團(tuán)，這個(gè)結(jié)構(gòu)在宿主細(xì)胞的RNA 中是不存在的，這也是為什么機(jī)體能夠區(qū)分RNA 是否為外來(lái)的原因［16］。5'-三磷酸基團(tuán)可以被RⅠG-1 有效識(shí)別，如果想要排除這種因素的干擾，那么在體外酶促合成mRNA 的過(guò)程中，可以使用酶法去除5'-三磷酸基團(tuán)或者使用可以干擾RⅠG-1的病毒蛋白［17］。Karikó等［18］也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在體外合成mRNA的環(huán)境中添加修飾核苷s2U 和Ψ 時(shí)，RⅠG-1 的激活會(huì)被抑制，這也意味著體外mRNA 的免疫原性被進(jìn)一步降低。Ψ 作為RNA 中豐富的修飾核苷，它的存在不僅僅能夠讓mRNA 的免疫原性消失，還可以增強(qiáng)mRNA 的翻譯。Ψ 可以增強(qiáng)磷酸鹽骨架的剛性，Ψ 和腺嘌呤之間的堿基配對(duì)強(qiáng)于尿嘧啶和腺嘌呤，同時(shí)Ψ 可促進(jìn)堿基的堆積，進(jìn)而穩(wěn)定mRNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，此外翻譯的增強(qiáng)可以通過(guò)保護(hù)具有高核糖體占有率的mRNA來(lái)使mRNA穩(wěn)定性提高［14，18-20］。2010年Anderson等［21］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，含有尿苷的mRNA 可以激活RNA 依賴性蛋白激酶（protein kinase，PKR），激活后的PKR 會(huì)磷酸化翻譯起始因子2的α亞基，最后導(dǎo)致翻譯的抑制。而當(dāng)尿苷被假尿苷取代時(shí)，mRNA 的翻譯水平明顯提高。這說(shuō)明了與尿苷相比，假尿苷激活PKR 的程度非常小。此外，Andries 等［22］在2015 年的研究中發(fā)現(xiàn)，由m1Ψ（N1-methylpseudouridine）和m5C 修飾的mRNA 基因表達(dá)的效率高于由Ψ 和m5C 修飾的mRNA，而這可能與m1Ψ 和m5C 修飾的mRNA能夠更有效地逃避TLR 識(shí)別有關(guān)，因此，m1Ψ 在mRNA 中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。受自身RNA 在機(jī)體內(nèi)不會(huì)被降解和病毒、細(xì)菌RNA 對(duì)人體的外源性的啟發(fā)，研究人員發(fā)現(xiàn)了假尿苷修飾和其他核苷修飾的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)核苷修飾，同時(shí)根據(jù)不同治療目的控制mRNA 的免疫原性，讓mRNA 疫苗的免疫原性處在一個(gè)相對(duì)平衡的位置，可以恰當(dāng)?shù)丶せ钕忍烀庖吆瓦m應(yīng)性免疫，降低機(jī)體對(duì)它表現(xiàn)出的抗病毒反應(yīng)。

1.2 mRNA的體外合成

除了理論的進(jìn)步，技術(shù)的進(jìn)步也在為mRNA疫苗的誕生奠定基礎(chǔ)。特別是前面提到的體外轉(zhuǎn)錄（in vitrotranscribed，ⅠVT）mRNA技術(shù)的進(jìn)步，體外合成的mRNA可以通過(guò)模擬天然mRNA的結(jié)構(gòu)，在核苷修飾的幫助下，在機(jī)體內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)蛋白質(zhì)，發(fā)揮作用［23］。那么想要了解ⅠVT mRNA 的大規(guī)模產(chǎn)生，首先需要了解的是天然mRNA 具有什么樣的結(jié)構(gòu)。mRNA由5個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成：5' cap、5'非翻譯區(qū)（5' untranslated regions，5' UTR）、編碼序列（coding sequence region，CDS）、3'非翻譯區(qū)（3' untranslated regions，3' UTR） 和poly(A)尾［24］。m7G 通 過(guò)5'-5'三 磷 酸 橋（ppp） 連 接 到mRNA的5'，進(jìn)而形成mRNA5' m7G帽的結(jié)構(gòu)［25］。5' m7G 帽不僅介導(dǎo)真核翻譯起始因子4E

（eukaryotic translation initiation factor 4E，elF4E）的結(jié)合，募集起始復(fù)合體啟動(dòng)帽依賴性翻譯，而且可以保護(hù)mRNA，讓mRNA免受5'-3'核酸外切酶的降解，使其可以穩(wěn)定地在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行翻譯［18，24，26-27］。5' UTR 是核糖體啟動(dòng)翻譯的起始位點(diǎn)，優(yōu)化它可以提高mRNA 的穩(wěn)定性，提高翻譯效 率［24，28］。3' UTR 可 以 與miRNA 結(jié) 合，沉 默mRNA 的表達(dá)，若想增強(qiáng)mRNA 的表達(dá)，可以減短3' UTR［24］。同時(shí)它還可以穩(wěn)定poly(A)結(jié)合蛋白與poly(A)尾的結(jié)合，防止mRNA 的脫多聚腺苷酸化［26］。開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）堿基的組成以及密碼子的使用也會(huì)影響mRNA 的翻譯活性和穩(wěn)定性［24，26-27］。作為mRNA的最后一個(gè)元件，poly(A)尾的3'端有長(zhǎng)的重復(fù)腺苷核苷酸。通過(guò)與poly(A)結(jié)合蛋白結(jié)合，它可以保護(hù)mRNA 免受3'-5'核酸酶的降解［24，26-27］。蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞類型，以及不同的mRNA 可能都會(huì)影響poly(A)尾長(zhǎng)度的選擇［24，26］。此外富含AU 序列的mRNA 促進(jìn)二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，會(huì)阻礙核糖體和其他調(diào)節(jié)因子的結(jié)合，控制基因的表達(dá)［24，29］。若mRNA 富含GC，該mRNA 的翻譯效率會(huì)比富含AU 時(shí)高。GC 的增加，會(huì)讓尿苷堿基的數(shù)量減少，那么TLR7/8 的激活也會(huì)減少，這與mRNA 的免疫原性降低密切相關(guān)，說(shuō)明除了通過(guò)堿基修飾的途徑以外，增加GC含量也是降低免疫原性的一個(gè)可行策略［24，29-31］。

設(shè)計(jì)和構(gòu)建DNA 模板是制備mRNA 的第一步。該DNA 模板至少需要4 個(gè)元件：噬菌體啟動(dòng)子、UTR、ORF和poly(T)序列［26］（圖2）。為了提高mRNA 的表達(dá)和穩(wěn)定性，在構(gòu)建DNA 模板時(shí)，就應(yīng)該對(duì)每一個(gè)元件進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的原料包括核糖核苷三磷酸、RNA 聚合酶和構(gòu)建好的DNA 模板。針對(duì)前面提到的5' m7G帽，可以通過(guò)使用封端酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾來(lái)封端，也可以通過(guò)在體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程中添加封端類似物來(lái)封端［32］。所以如果采取的是共轉(zhuǎn)錄封端，那么帽類似物也應(yīng)該作為原料出現(xiàn)在反應(yīng)溶液中。針對(duì)poly(A)尾，同樣具有兩種策略，第一種是通過(guò)酶促反應(yīng)將poly(A)尾添加到ⅠVT mRNA，第二種是通過(guò)在體外轉(zhuǎn)錄前將poly(T)添加到DNA 模板中，也就是本文中提到的構(gòu)建DNA 模板的4 種基本原料之一。第二種方式得到的poly(A)尾通常比較均勻，并且它允許批量控制poly(A)尾mRNA的合成［26，33］。在ⅠVT過(guò)程中添加的核苷酸包括化學(xué)修飾核苷和未修飾核苷，具體的比例是可以調(diào)節(jié)的［26］，使用的化學(xué)修飾核苷通常是m1Ψ和Ψ。體外轉(zhuǎn)錄完成以后，要進(jìn)行純化，去除殘留在反應(yīng)溶液中的核苷酸、酶、dsRNA和DNA模板等［26］。特別是dsRNA，其可以有效激活TLR3，引起免疫應(yīng)答。針對(duì)大規(guī)模的純化，目前最常用的方法是高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）。2011 年，Karikó 等［34］經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，使用HPLC純化的mRNA可以降低其免疫原性，并且HPLC還能改善核苷修飾過(guò)的mRNA 的翻譯效率。2019 年針對(duì)dsRNA的去除，Baiersd?rfer等［35］又提出了纖維素色譜法，原理便是在含有乙醇的緩沖液中讓dsRNA 與傳統(tǒng)纖維素粉末選擇性結(jié)合。這種方法與HPLC 比較起來(lái)，更加簡(jiǎn)單，且不需要特殊設(shè)備，成本更低，對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)有重要意義。純化完成以后，ⅠVT mRNA的合成就完成了，通過(guò)這些步驟大規(guī)模生產(chǎn)的mRNA 可以根據(jù)開(kāi)發(fā)者的目的去完成下一階段的使用。

Fig.2 mRNA synthesis process in vitro圖2 體外合成mRNA流程

2 mRNA疫苗的遞送系統(tǒng)

2.1 脂質(zhì)體納米顆粒（LNPs）

正如Pardi 等［36］所描述，研發(fā)mRNA 疫苗需要克服4個(gè)障礙，提高翻譯效率、提高mRNA穩(wěn)定性、降低免疫原性、提高體內(nèi)遞送效率。前文已經(jīng)提到，前面3個(gè)障礙可以通過(guò)序列優(yōu)化、摻入修飾核苷、純化解決。細(xì)胞攝取裸核酸的過(guò)程非常低效，mRNA 疫苗成功的最后障礙便是提高體內(nèi)胞質(zhì)遞送效率［37］。針對(duì)基因疫苗存在的遞送系統(tǒng)包括質(zhì)粒DNA、病毒載體、胞內(nèi)菌等［38］，這對(duì)于mRNA 疫苗遞送系統(tǒng)的研發(fā)提供了借鑒的例子。目前，針對(duì)mRNA 疫苗的遞送系統(tǒng)可分為病毒和非病毒載體遞送系統(tǒng)。針對(duì)病毒載體，可以將mRNA包裝成RNA病毒［39］，但是通過(guò)這種方式轉(zhuǎn)染后的mRNA 表達(dá)難以控制，而且無(wú)論是時(shí)間成本還是經(jīng)濟(jì)成本都比較高［40］，不適合需要大規(guī)模生產(chǎn)的mRNA 疫苗。非病毒載體遞送系統(tǒng)，包括脂質(zhì)或脂質(zhì)材料以及聚合物遞送系統(tǒng)等，其中脂質(zhì)或脂質(zhì)材料又包括脂質(zhì)體復(fù)合物和脂質(zhì)體納米顆粒（liposome nanoparticles，LNPs）。脂質(zhì)體復(fù)合物是由帶正電荷的陽(yáng)離子脂質(zhì)和帶負(fù)電荷的mRNA 通過(guò)靜電相互作用聚集形成的多層囊性復(fù)合物。常見(jiàn)的聚合物遞送系統(tǒng)包括聚酰胺胺（poly-amidoamine，PAMAM）、聚β 氨基酯（poly-beta aminoesters，PBAEs）和聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEⅠ）［41］。

遞送系統(tǒng)有很多，但作為目前應(yīng)用最廣泛的LNPs遞送脫穎而出。LNPs最初是用于siRNA的遞送，但2015年P(guān)ardi等［36］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LNPs在mRNA 遞送方面的卓越能力。LNPs 的主要成分包括可電離脂質(zhì)、 磷脂酰膽堿（distearoyl phosphatidylcholine，DSPC）、膽固醇、PEG-脂質(zhì)［42-43］（圖3）?？呻婋x脂質(zhì)在生理pH 下顯中性，可以消除循環(huán)中的陽(yáng)離子電荷，在酸性條件下會(huì)在內(nèi)體中被質(zhì)子化，促進(jìn)內(nèi)體釋放。磷脂酰膽堿則有助于在PEG 表面下形成穩(wěn)定的雙層結(jié)構(gòu)。膽固醇可以填補(bǔ)顆粒間隙，限制LNPs 與蛋白質(zhì)的相互作用，促進(jìn)膜融合［43］。LNP mRNA 的形成以及遞送過(guò)程如下：先在pH 為4 的緩沖液中快速混合含有疏水性脂質(zhì)的乙醇相和含有mRNA 的水相。溶液一旦混合，pH 會(huì)接近5.5，會(huì)讓可電離脂質(zhì)質(zhì)子化，可電離脂質(zhì)會(huì)結(jié)合mRNA的陰離子磷酸骨架，包繞在mRNA 周圍，同時(shí)兩者在水相中會(huì)具有疏水性，可以驅(qū)動(dòng)囊泡形成和mRNA 封裝。囊泡形成以后在溶液的稀釋下，可電離脂質(zhì)表面會(huì)在生理pH 下恢復(fù)為中性，變得更加疏水，從而驅(qū)動(dòng)囊泡融合。此時(shí)可電離脂質(zhì)與mRNA 進(jìn)一步深入顆粒內(nèi)部，兩者形成電子致密的核心。親水的PEG 會(huì)包裹顆粒，并且決定顆粒最后的尺寸大小。PEG-脂質(zhì)不會(huì)讓囊泡過(guò)度融合。前面提到的DSPC雙層也位于PEG-脂質(zhì)的下方。注意快速混合才可以將得到的顆粒尺寸限制在＜100 nm，同時(shí)溶液中LNPs的組裝和形成靠的是疏水力和靜電力［42-45］。當(dāng)LNP mRNA 被細(xì)胞內(nèi)吞并在內(nèi)體內(nèi)被螯合和酸化時(shí)，可電離的脂質(zhì)會(huì)帶正電，接著與內(nèi)涵體膜融合，將mRNA 釋放到細(xì)胞質(zhì)中［46］。到達(dá)細(xì)胞質(zhì)后會(huì)在核糖體翻譯成蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)作為內(nèi)源性抗原被蛋白酶體降解成抗原肽。這些抗原肽通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體 （major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子途徑呈遞給CD8+細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，激活細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而構(gòu)成mRNA疫苗的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。此外，翻譯出的蛋白質(zhì)可以分泌到細(xì)胞外環(huán)境中，從而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在循環(huán)系統(tǒng)中被APC 攝取。抗原肽作為外源性抗原通過(guò)MHC-ⅠⅠ類分子被提呈給CD4+T 細(xì)胞，通過(guò)分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，激活B細(xì)胞產(chǎn)生高親和力的病毒中和抗體，發(fā)揮體液免疫效應(yīng)［47］。針對(duì)研制好的mRNA 疫苗的儲(chǔ)存，Muramatsu 等［45］發(fā)現(xiàn)，凍干可以為mRNA 疫苗提供長(zhǎng)期穩(wěn)定性，并且凍干的mRNA 疫苗在室溫下可儲(chǔ)存12 周，在4℃條件下可以儲(chǔ)存24周。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)對(duì)于疫苗的全球分發(fā)具有重要意義。Han 等［48］還開(kāi)發(fā)了一種佐劑脂質(zhì)體，它不僅可以作為L(zhǎng)NPs 的結(jié)構(gòu)成分，還可以發(fā)揮佐劑的效應(yīng)，使得注射了LNP mRNA 疫苗的機(jī)體產(chǎn)生更有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。

Fig.3 LNPs structure diagram圖3 LNPs結(jié)構(gòu)圖

2.2 單組分可電離兩親性Janus樹(shù)狀大分子可靶向和均勻分布地向器官遞送mRNA

盡管LNPs 遞送已經(jīng)應(yīng)用于生產(chǎn)SARS-CoV-2疫苗，德魯·韋斯曼和他的團(tuán)隊(duì)仍然在開(kāi)發(fā)新的遞送系統(tǒng)。畢竟LNPs 遞送確實(shí)也存在不足，LNP mRNA的生成需要復(fù)雜的微流體技術(shù)，作為四組分的一個(gè)載體，四組分在LNPs 中的分布未知。與LNPs 結(jié)合的PEG 會(huì)增加LNPs 在血液的循環(huán)時(shí)間，會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)降級(jí)［49］，所以遞送的技術(shù)確實(shí)還有上升的空間。就在2021 年，Zhang 等［49］開(kāi)發(fā)了一種單組分多功能可電離兩親性Janus 樹(shù)狀大分子（ionizable amphiphilic Janus dendrimer，ⅠAJD） 的遞送系統(tǒng)。這個(gè)系統(tǒng)依賴由他們實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的可電離兩親性Janus 樹(shù)狀大分子（Janus dendrimers，JDs） 和 糖 樹(shù) 狀 大 分 子（Janus glycodendrimers，JGD）。兩親性Janus樹(shù)狀大分子由功能性親水性和疏水性樹(shù)狀分子結(jié)合而成。ⅠAJDs與mRNA可以共組裝成樹(shù)狀大分子納米顆粒（dendrimersome nanoparticles，DNPs），和LNPs 相比，DNPs 的合成更加簡(jiǎn)單，只需在乙酸鹽緩沖液中簡(jiǎn)單注射即可［50］。雖然最開(kāi)始的單組分ⅠAJD需要14步才能合成，但是Zhang等［50］通過(guò)消除連接在JD親水性片段分支點(diǎn)上的甲氧基三乙二醇片段減少了構(gòu)建ⅠAJDs 的步驟，大大提高了效率。同時(shí)和LNPs 相比，DNP 還可以更好地實(shí)現(xiàn)靶向遞送的功能。Zhang 等［51］通過(guò)使用不同的烷基長(zhǎng)度設(shè)計(jì)ⅠAJDs疏水區(qū)，發(fā)現(xiàn)mRNA 靶向遞送的效率大大提高。篩選文庫(kù)產(chǎn)生的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析還證明ⅠAJDs的親水部分可以通過(guò)其電離胺的結(jié)構(gòu)和序列決定靶器官，羥乙基哌嗪有利于靶向脾臟，甲基哌嗪有助于靶向肝臟，哌啶和二甲胺則有利于輸送到肺部［52］。這些意味著ⅠAJDs 疏水區(qū)的一級(jí)結(jié)構(gòu)具有重要的作用，所以選擇合適的烷基長(zhǎng)度、電離胺的結(jié)構(gòu)和序列對(duì)于不同靶器官疫苗的研發(fā)有著重要的啟示。

3 SARS-CoV-2 mRNA疫苗

SARS-CoV-2 是 一 種 正 鏈RNA 病 毒［53］。SARS-CoV-2基因組的長(zhǎng)度約為30 kb，它至少編碼29 個(gè)蛋白質(zhì)，包括16 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）、4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和9個(gè)輔助蛋白［54］。4種結(jié)構(gòu)蛋白包括刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）［47］。mRNA 疫苗將基于LNPs 疫苗載體的mRNA 傳遞給APC［55］。在內(nèi)體內(nèi)的酸性環(huán)境中，可電離脂質(zhì)的頭基被質(zhì)子化到陽(yáng)離子狀態(tài)。在吸引并結(jié)合內(nèi)膜磷脂的陰離子頭基后，陽(yáng)離子脂和磷脂的疏水尾部膨脹，穩(wěn)定的磷脂雙層結(jié)構(gòu)被破壞，這反過(guò)來(lái)允許mRNA 逃逸內(nèi)體，到達(dá)細(xì)胞質(zhì)室并被核糖體翻譯成蛋白質(zhì)，作為內(nèi)源性抗原被蛋白酶體降解成抗原肽。LNP-mRNA 疫苗中可電離的脂質(zhì)組分和ⅠL-6細(xì)胞因子能誘導(dǎo)佐劑活性，這種由LNPs 驅(qū)動(dòng)的佐劑活性可誘導(dǎo)強(qiáng)大的Tfh 細(xì)胞反應(yīng)和體液免疫，從而增強(qiáng)基于mRNA 疫苗的效力［55］。

SARS-CoV-2 表面的三聚體S 蛋白在介導(dǎo)宿主細(xì)胞侵襲中起關(guān)鍵作用。因此，S蛋白被認(rèn)為是疫苗設(shè)計(jì)的主要抗原［47］。目前，設(shè)計(jì)針對(duì)SARSCoV-2 S蛋白的疫苗通常采用兩種策略：2P突變和S1/S2 裂 解 位 點(diǎn)。BioNTech 生 產(chǎn) 的BNT162b2 疫 苗和Moderna 生產(chǎn)的mRNA-1273 均是使用2P 突變策略。采用該策略，將S2 亞單位中心螺旋位置頂部的兩個(gè)氨基酸替換為脯氨酸（K986P 和V987P），有效地提高了S蛋白在融合前構(gòu)象中的穩(wěn)定性。由Moderna 研發(fā)的mRNA1273 編碼SARS-CoV-2 的全長(zhǎng)預(yù)融合刺突蛋白，是基于南非首次發(fā)現(xiàn)的SARSCoV-2 Beta 變種開(kāi)發(fā)的。疫苗有效率為94.1%，在青少年和成人中普遍具有良好的有效性、耐受性和安全性。mRNA-1273 對(duì)Alpha 和Beta 變體的有效性分別為100%和96.4%，而對(duì)Delta的有效性略低（73.1%）。有數(shù)據(jù)顯示，接種三劑mRNA-1273 可提供對(duì)Delta 感染的高而持久的保護(hù)（95.2%），但對(duì)Omicron 的保護(hù)較低（62.5%）。BioNTech 研發(fā)的疫苗是基于核苷修飾的基因BNT162b2編碼一個(gè)全長(zhǎng)的峰糖蛋白，BNT162b1 編碼三聚體峰蛋白R(shí)BD 的分泌形式。跨膜預(yù)融合峰（BNT162b2）、分泌型峰RBD（BNT162b1）疫苗提供的保護(hù)率為95.6%，帶有BNT162b2 的疫苗增強(qiáng)劑可以增強(qiáng)Omicron 變體的中和作用［47］。根據(jù)一項(xiàng)以色列的研究數(shù)據(jù)，BNT162b2作為兩劑計(jì)劃的疫苗有效性為94%。然而，有證據(jù)表明，該疫苗與心肌炎風(fēng)險(xiǎn)的增加有關(guān)［56］，其聚乙二醇添加劑也可能誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)［57］。

4 展 望

mRNA 疫苗具有高效、快速開(kāi)發(fā)、低成本生產(chǎn)和安全使用的潛力。目前mRNA 的測(cè)序和合成技術(shù)已經(jīng)十分成熟，可以根據(jù)變異毒株快速對(duì)其mRNA 進(jìn)行測(cè)序并合成相應(yīng)的mRNA，經(jīng)過(guò)核苷酸修飾和LNPs 的遞送迅速發(fā)揮強(qiáng)大的免疫作用。但同時(shí)也存在許多問(wèn)題，如疫苗接種會(huì)有不良反應(yīng)，包括罕見(jiàn)的過(guò)敏反應(yīng)和急性心包炎等［58］。且mRNA 對(duì)核酸外切酶具有較高的敏感性，對(duì)生產(chǎn)要求較高，需要在超低溫條件下運(yùn)輸和儲(chǔ)存mRNA 疫苗，mRNA 疫苗的穩(wěn)定性和遞送體系有待進(jìn)一步探索和優(yōu)化［47］。本文認(rèn)為對(duì)mRNA 序列再進(jìn)行更加細(xì)致的優(yōu)化也許可以進(jìn)一步提高其穩(wěn)定性。也可以考慮修改其他輔助脂質(zhì)成分或mRNALNPs 的結(jié)構(gòu)或使用HPLC、快速蛋白質(zhì)液相色譜（fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC）、寡聚（DT） 純化、切向流動(dòng)過(guò)濾（tangential flow filtration，TFF） 等 方 式 進(jìn) 一 步 改 善mRNA 的質(zhì)量［55］。

無(wú)論是什么類型的疫苗，注射進(jìn)入機(jī)體后，機(jī)體都會(huì)針對(duì)疫苗所包含的或者編碼的抗原做出免疫應(yīng)答。既然mRNA 疫苗可以用于預(yù)防傳染病的感染，那么同理，針對(duì)腫瘤，也可以研發(fā)相應(yīng)的mRNA 疫苗，mRNA 疫苗可以通過(guò)編碼腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）或者個(gè)性化新抗原（personalized neoantigens）來(lái)激活機(jī)體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)強(qiáng)大的細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞來(lái)殺死癌細(xì)胞［59-60］。在腫瘤生長(zhǎng)的過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），誘導(dǎo)新生血管的生成［61］。因此，也可以通過(guò)合成能夠編碼抗VEGF抗體的mRNA，注射到患者體內(nèi)，抑制腫瘤血管生成，最終達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。針對(duì)VEGF，德 魯·韋 斯 曼 團(tuán) 隊(duì)［62-63］已 經(jīng) 發(fā) 現(xiàn)，VEGFA mRNA 可以促進(jìn)膽管上皮向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化，逆轉(zhuǎn)脂肪變性和纖維化，核苷修飾的VEGFC mRNA 可以誘導(dǎo)器官特異性淋巴生長(zhǎng)并且逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)性淋巴水腫。

mRNA 在再生醫(yī)學(xué)中也具有巨大的應(yīng)用潛力。再生醫(yī)學(xué)的目的是為了創(chuàng)造、補(bǔ)充丟失的細(xì)胞、組織或者器官。再生醫(yī)學(xué)的實(shí)現(xiàn)離不開(kāi)功能蛋白質(zhì)，包括生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子?？梢詫⒕幋a功能蛋白質(zhì)的mRNA 遞送到體內(nèi)，翻譯后產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)發(fā)揮相應(yīng)的功能。直接注射功能蛋白質(zhì)，會(huì)引起結(jié)構(gòu)變形影響活性，但使用mRNA 就可以克服這一缺點(diǎn)，提高治療效率［26］。當(dāng)前的基因治療多是通過(guò)遞送正常的基因來(lái)替換有缺陷的基因，但無(wú)論是病毒介導(dǎo)的還是質(zhì)粒DNA 的基因遞送都各有缺陷。在這樣一個(gè)階段，mRNA 也為基因治療帶來(lái)了新的希望，mRNA 可以避免不必要的插入，具有更高的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性［64］。

mRNA 對(duì)核酸外切酶具有較高的敏感性，且需要核苷酸修飾來(lái)提高其穩(wěn)定性和降低免疫原性，對(duì)生產(chǎn)要求較高［65］。而環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類沒(méi)有5'或3'端的天然（生物）或合成的閉合RNA，由于其獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)不會(huì)被核酸外切酶降解而具有高度的穩(wěn)定性，它們相對(duì)于目前的線性mRNA 具有更高的藥物穩(wěn)定性和生物穩(wěn)定性［66］。并且circRNAs 能夠通過(guò)滾環(huán)翻譯產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)，也可以利用有限的核苷酸序列來(lái)翻譯更大的蛋白質(zhì)［67］。有研究表明，對(duì)于SARS-CoV-2，circRNA 疫苗通過(guò)表達(dá)S 蛋白的三聚體RBD 誘導(dǎo)了強(qiáng)大的中和抗體和T 細(xì)胞反應(yīng)，比m1ψ 修飾的mRNA 疫苗能夠產(chǎn)生更高和更持久的抗原，并引發(fā)更高比例的中和抗體和明顯的Th1扭曲免疫反應(yīng)［68］。2022 年清華大學(xué)的一項(xiàng)研究表明，circRNA具有相對(duì)線性RNA較弱的免疫原性，能夠同時(shí)作為免疫原和佐劑［69］誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞活化、抗體產(chǎn)生和抗腫瘤免疫。m6A RNA 對(duì)circRNA的修飾能夠抑制先天性免疫，使其免疫基因激活和佐劑活性喪失［66］。在B16 原位黑色素瘤小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， circRNA-LNPs 疫苗使SⅠⅠNFEKL-MHC-Ⅰ四聚體陽(yáng)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的頻率顯著增加，表明其引發(fā)了強(qiáng)大的抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-LNPs 極大地抑制了免疫排斥腫瘤的進(jìn)展，誘導(dǎo)免疫沙漠腫瘤的完全消退，并防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，這表明癌癥RNA 疫苗的有效性［70］。雖然目前技術(shù)還不成熟，可能會(huì)導(dǎo)致抗原或蛋白質(zhì)積累失控［67］等后果，但circRNAs作為一種工具來(lái)編程抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，結(jié)合了編程簡(jiǎn)單、持久的抗原表達(dá)和安全給藥的特點(diǎn)［69］，其良好的特性很有可能推動(dòng)傳染病和癌癥免疫治療疫苗的突破性發(fā)展。

卡塔琳·卡里科和德魯·韋斯曼開(kāi)辟的mRNA核苷酸修飾技術(shù)奠定了mRNA 疫苗體系建立的基礎(chǔ)，在COVⅠD-19疫情的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)中mRNA疫苗被迅速制造并取得了完整的勝利，他們的突破性發(fā)現(xiàn)從根本上改變了人們對(duì)mRNA 如何與免疫系統(tǒng)相互作用的理解，為疫苗的變革性發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。