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        溶劑誘導萃取/UPLC-MS/MS法檢測農(nóng)田土壤中20種除草劑

        2024-01-02 10:43:48瞿德業(yè)王彩虹朱夢晨楊明月柴文博楊山泉
        分析測試學報 2023年12期
        關(guān)鍵詞:除草劑

        瞿德業(yè),王彩虹,陳 靜,朱夢晨,楊明月,夏 搏,柴文博,楊山泉

        (1.西北師范大學 地理與環(huán)境科學學院,甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省綠洲資源環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展重點實驗室,甘肅 蘭州 730070)

        農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常需使用農(nóng)藥,根據(jù)防治對象的不同,農(nóng)藥可分為除草劑、殺蟲劑、殺菌劑、脫葉劑、植物生長調(diào)節(jié)劑等[1]。在所有類型的農(nóng)藥中,除草劑占世界產(chǎn)量的最大份額,并已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實踐的重要組成部分[2]。除草劑可以減少雜草生長、提升農(nóng)業(yè)產(chǎn)量,因此我國每年在農(nóng)林牧業(yè)生產(chǎn)中會使用大量的除草劑[3]。由于除草劑具有良好的水溶性和穩(wěn)定的化學結(jié)構(gòu),大量和頻繁地使用會使其殘留在農(nóng)田土壤中。殘留除草劑通過食物鏈的生物積累和傳播進一步擴散[4],對人體健康造成危害[5-7]。因此,除草劑殘留對土壤的污染不容忽視,建立一種高效的土壤中除草劑殘留檢測方法具有重要意義。

        土壤中除草劑殘留檢測的難點在于復雜基質(zhì)的干擾,且待測目標化合物的含量通常很低,因此,在處理前對樣品進行有效的清洗成為準確分析和檢測的條件,同時也能避免進樣口、色譜柱及檢測器等污染[8-9]。目前,已被廣泛使用的除草劑樣品前處理技術(shù)有液液萃取、固相萃取、固相微萃取、QuEChERS 方法、加速溶劑萃取等[10-12]。以上樣品前處理方法操作過程復雜,制約因素多,耗時久。本研究采用溶劑誘導萃取樣品前處理技術(shù),該方法是在勻相的乙腈-水體系中添加一種疏水且與乙腈互溶的有機溶劑,從而誘導乙腈-水體系分層。溶劑誘導萃取最大的優(yōu)勢為經(jīng)誘導萃取劑誘導分離的乙腈層和水層能夠?qū)⑹杷院陀H水性物質(zhì)在線分離,從而實現(xiàn)樣品的凈化和濃縮,且有機相與反相液相色譜流動相兼容,可直接進樣分析[13]。該前處理方法已被用于中藥成分和血漿中藥物的分析[14-15],但很少用于土壤中除草劑殘留測定。本文擬建立一種優(yōu)化后的溶劑誘導萃取前處理方法,使之更適用于土壤樣品的處理,并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對土壤中20種除草劑進行多殘留檢測。

        1 實驗部分

        1.1 儀器與試劑

        ACQUITY UPLC I-Class 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司)、Quattro Premier XE 型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent 公司);BC-100 型多管渦旋混合儀(美國Scientific Industries);3K30 型臺式高速冷凍離心機(德國Sigma 公司);BSA 822 電子天平;移液槍(10~100 μL,100~1 000 μL,美國Thermo Electron公司)。

        乙腈、乙酸乙酯(色譜純,德國默克公司);甲酸銨、二氯甲烷、氯化鈉(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);甲酸(純度>98%,德國默克公司);實驗用水為蒸餾水(屈臣氏);20種除草劑混合標準溶液購于阿爾塔科技有限公司。樣品來自河南省開封市某農(nóng)業(yè)種植大棚基地的土壤,自然風干后,去除雜草、植物根莖葉和碎石等雜物,用土壤研磨儀粉碎后,過60目篩網(wǎng),待用。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 樣品前處理稱取上述處理好的土壤樣品10 g,加入5 mL乙腈、5 mL純凈水,渦旋8 min,充分混合均勻后,在6 ℃下以12 000 r/min 離心5 min;吸取上清液,并記錄上清液體積。加入1.5 mL 二氯甲烷至上清液中,渦旋8 min,靜置3 min,離心5 min。溶液產(chǎn)生分層現(xiàn)象,上層為乙腈層,下層為水層;記錄上下層體積,分別取1.0 mL過0.22 μm有機濾膜,裝入棕色進樣小瓶,待測。

        1.2.2 標準溶液配制20 種除草劑混合標準溶液:準確移取一定量的標準溶液用乙腈-水(體積比1∶1)定容于10 mL棕色容量瓶中,配制成1 mg/L的20種除草劑混合標準溶液,冷藏待用。

        基質(zhì)標準溶液:取空白的土壤樣品,按照“1.2.1”方法進行前處理。取農(nóng)藥混合標準溶液,以空白樣品溶液為溶劑,配制 0.1~100 μg/L的系列基質(zhì)標準溶液。

        1.3 色譜-質(zhì)譜條件

        1.3.1 色譜條件色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,美國Agilent公司);流動相A:0.1%甲酸水,B:乙腈;進樣量:3 μL;柱溫:30 ℃;流速:0.30 mL/min。流動相洗脫梯度:0~1 min,30% B;1~2 min,30%~40% B;2~5 min,40%~50% B;5~8 min,50%~30% B;8~8.5 min,30% B。

        1.3.2 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(ESI),多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)正離子方式掃描,毛細管電壓為3 500 V;霧化氣:2.76×105Pa;干燥氣溫度為350 ℃,干燥氣流速為10 L/min。20 種除草劑的保留時間、定量定性離子對、碰撞能量及碎裂電壓見表1。

        表1 20種除草劑的保留時間及MRM參數(shù)Table 1 Retention times and MRM parameters of 20 herbicides

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        數(shù)據(jù)采用Excel 2010 進行處理,采用Origin 2022 繪制柱狀圖,采用Design Expert 10 軟件進行響應(yīng)面分析。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 儀器方法的優(yōu)化

        2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的選擇常用的質(zhì)譜電離源有ESI和大氣壓化學電離源(APCI)兩種,ESI電離源適用于多電荷、中高極性、分子量較大、熱不穩(wěn)定的物質(zhì)[16],實驗發(fā)現(xiàn)ESI 電離源的靈敏度較高,故選擇ESI 電離源。采用正離子模式掃描,選擇峰強度較大的離子作為定性定量離子。對所選離子對的去簇電壓和碎裂電壓進行優(yōu)化,并對電噴霧電壓、離子源溫度和駐留時間等參數(shù)進行優(yōu)化,優(yōu)化后的質(zhì)譜條件如“1.3.2”所示。通過梯度洗脫可實現(xiàn)多種化合物的有效分離。離子色譜圖雖有重疊,但各峰的定量離子和定性離子不同,因此不影響定量分析[17]。20種除草劑的總離子流圖如圖1所示。

        2.1.2 色譜柱的選擇選擇色譜柱對于分離樣品非常重要,通常不同填料的色譜柱對同一樣品有不同的保留時間[18]。考察了ACQUITY UPLCTMBEH C18(1.0 mm×50 mm,1.7 μm)和ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)2 種色譜柱的分離效果。其中,前者的填料為三官能鍵合BEH 顆粒,可適用的pH 范圍更寬(pH 1~12),低pH 穩(wěn)定性好,柱滲漏非常低,適用于高靈敏度MS 應(yīng)用;而后者可在高壓下操作(達到6.00×107Pa),且裝填的C18填料適用于高速反相HPLC,該柱對所有類型化合物分析均能得到高柱效和優(yōu)異峰形。實驗結(jié)果顯示,使用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱能使20 種目標物的峰形對稱,色譜響應(yīng)較高,所以選用該色譜柱進行分離。

        2.1.3 流動相的優(yōu)化考察了0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈(0.01%甲酸水+2 mmol/L 甲酸銨)、0.1%甲酸水(含2 mmol/L甲酸銨)-乙腈(0.1%甲酸水+2 mmol/L甲酸銨)、0.1%甲酸水(含2 mmol/L甲酸銨)-乙腈(0.1%甲酸水)4 種流動相的分離效果,結(jié)果表明,以0.1%甲酸水-乙腈為流動相時,所有目標化合物的響應(yīng)強度最高,出峰時間最短。因此,選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動相。

        2.2 前處理單因素實驗的優(yōu)化

        2.2.1 提取劑體積的選擇為了驗證不同體積的提取劑乙腈是否對目標物回收率產(chǎn)生影響,將乙腈與水分別按照體積比2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2 移取10 mL,按照“1.2”進行實驗,發(fā)現(xiàn)目標物主要集中在上層乙腈層,因此主要比較上層物質(zhì)的回收率。當乙腈與水的比例為5∶5即乙腈體積為5 mL 時出峰效果最好,回收率較高。對實驗結(jié)果用SPSS 軟件采用單因素方差進行差異性分析,結(jié)果表明不同體積的乙腈間存在顯著性差異。確定選擇乙腈體積為5 mL進行實驗。

        2.2.2 萃取劑的選擇萃取劑是決定萃取效率的重要因素,萃取劑的選擇必須考慮萃取劑的密度、揮發(fā)性、萃取目標物的能力以及對后續(xù)色譜分離分析的影響[19]。大多數(shù)與乙腈互溶的疏水性溶劑均能作為萃取劑誘導乙腈-水體系分層[15],因此本實驗考察了二氯甲烷、乙酸乙酯、NaCl 以及二氯甲烷+NaCl 的萃取效果。在空白土壤中添加20 種除草劑混合標樣,按照“1.2.1”處理,比較20 種除草劑的含量,并通過計算回收率確定20 種除草劑的轉(zhuǎn)移率。圖2 結(jié)果表明,選擇二氯甲烷為萃取劑進行萃取時,目標物的回收率最高,因此選擇二氯甲烷作為萃取劑。

        圖2 不同萃取劑對目標物回收率的影響Fig.2 Effect of different extractants on the recoveries of target compounds

        2.2.3 萃取劑添加量的確定比較了二氯甲烷的添加量對目標化合物回收率的影響。在其他條件一致的情況下,配制10 μg/L 空白加標土壤樣品,分別添加1.0、1.2、1.5、1.8、2 mL 的二氯甲烷,按照“1.2.1”處理后上機測定。結(jié)果表明,二氯甲烷添加量為1.5 mL 時,20 種除草劑的回收率最高,因此選擇二氯甲烷添加量為1.5 mL。

        2.2.4 渦旋時間的影響土壤和提取劑乙腈充分混合,會使實驗結(jié)果更加準確,因此渦旋至關(guān)重要。考察了渦旋時間對20種除草劑回收率的影響,由圖3 可知,渦旋時間在5~8 min范圍內(nèi)目標物的回收率呈上升趨勢,在8~10 min 范圍內(nèi)回收率呈下降趨勢,因此選擇渦旋時間為8 min。對實驗結(jié)果用SPSS 軟件采用單因素方差進行差異性分析,結(jié)果表明不同渦旋時間存在顯著性差異。

        圖3 渦旋時間對目標物回收率的影響Fig.3 Effect of vortex time on the recoveries of target compounds

        2.3 響應(yīng)面實驗結(jié)果分析

        2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果由“2.2”的結(jié)果可知,二氯甲烷體積為1.5 mL、提取劑乙腈體積為5 mL、渦旋時間為8 min 時目標物的回收率較好。因此,通過極差對單因素水平進行篩選,最終選擇二氯甲烷添加量、提取劑乙腈體積、渦旋時間為考察因素,通過響應(yīng)面法對3 個單因素進行分析,實驗方案及結(jié)果見表2。

        表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

        以二氯甲烷體積、乙腈體積、渦旋時間為因素,20種除草劑的回收率為響應(yīng)值(Y),經(jīng)回歸擬合后,得到回歸方程:Y=97.94-9.87A+4.79B-2.76C-1.05AB+0.30AC+1.68BC-17.71A2-11.68B2-12.83C2。利用Design Expert 10 軟件對表2 數(shù)據(jù)進行方差分析,結(jié)果如表3所示。

        表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

        根據(jù)方差分析結(jié)果,該模型的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.993,說明模型的可信度高。該響應(yīng)面回歸模型達到極顯著水平(p<0.01),表明該二次模型能夠擬合實際結(jié)果,誤差較小。綜上,可以利用此回歸方程確定20 種除草劑的最佳萃取條件。A、B、A2、B2、C2對20種除草劑的回收率產(chǎn)生極顯著影響(p<0.01),而AB、AC、BC對目標物回收率的影響不顯著。

        2.3.2 響應(yīng)面結(jié)果各實驗因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖見圖4。響應(yīng)面圖可較直觀地體現(xiàn)各因素交互作用對除草劑回收率的影響,曲線越陡峭,則表明該因素影響越大[20]。從表3 及圖4 可以看出,二氯甲烷體積對除草劑回收率的影響最大,乙腈體積、二氯甲烷體積、渦旋時間之間的交互作用對目標物回收率的影響不大。根據(jù)軟件計算結(jié)果,預測20 種除草劑的最佳回收率為93.8%,乙腈體積為5.6 mL,二氯甲烷體積為1.4 mL,渦旋時間為7.5 min。將上述最優(yōu)萃取條件簡化為乙腈體積5 mL、二氯甲烷體積1.5 mL、渦旋時間8 min,進行5 次重復實驗,得到20 種除草劑的平均回收率為95.2%,測定結(jié)果穩(wěn)定,證明該結(jié)果合理可靠。

        圖4 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

        2.4 方法驗證

        2.4.1 基質(zhì)效應(yīng)樣品中內(nèi)源性組分和樣品前處理過程中引入的雜質(zhì)對目標物檢測結(jié)果的影響稱為基質(zhì)效應(yīng),它可能影響線性關(guān)系、檢出限等測定指標[21]。通過基質(zhì)匹配標準曲線斜率與純?nèi)軇┡渲茦藴是€斜率的比值評價基質(zhì)效應(yīng)(ME),該比值等于或接近1 時(在0.8~1.2 之間),表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯;小于0.8 時,表明存在明顯基質(zhì)抑制作用;大于1.2 時,表明存在明顯基質(zhì)增強作用[22]。使用“1.2.2”配制的基質(zhì)混合標準溶液和溶劑混合標準溶液,考察了20種除草劑在土壤中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明,經(jīng)前處理后,20種除草劑的ME值為0.89~1.07,基質(zhì)效應(yīng)不明顯。

        2.4.2 線性方程與檢出限在優(yōu)化的實驗條件下,用乙腈-水(1∶1)配制0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列標準溶液,以質(zhì)量濃度為橫坐標,對應(yīng)的峰面積響應(yīng)值為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明,20 種除草劑在對應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)均不小于0.999 0。以3倍信噪比計算目標化合物的檢出限(LOD)為0.1~1.0 μg/kg,以10倍信噪比計算目標化合物的定量下限(LOQ)為0.2~5.0 μg/kg,結(jié)果見表4。

        表4 20種除草劑的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 4 Linear relations,detection limits and quantitation limits of 20 herbicides

        2.4.3 準確度與精密度選用空白土壤樣品,準確加入混合標準溶液,配制成低(1 μg/kg)、中(10μg/kg)、高(50 μg/kg)水平的加標樣品,按照優(yōu)化后的實驗條件進行處理和測定,每個加標水平重復測定5 次。表5 結(jié)果顯示,20 種除草劑的加標回收率為77.6%~115%,相對標準偏差(RSD)為0.40%~3.8%,本方法具有較好的準確度與精密度。

        表5 加標土壤樣品的平均回收率及相對標準偏差Table 5 Average recoveries and relative standard deviations of spiked soil samples

        2.5 與相關(guān)行業(yè)標準比較

        因本研究與NY/T 1616-2008[23]檢測的目標物部分重合,比較發(fā)現(xiàn),本方法前處理只需乙腈、二氯甲烷2 種試劑,而NY/T 1616-2008 方法需使用乙腈、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸、冰乙酸、氫氧化鈉6 種試劑;本方法前處理時間縮短,且檢出限(0.1~1.0 μg/kg)低于標準方法(0.6~3.8 μg/kg)。綜上,本方法所用試劑少,操作簡單,前處理時間短,檢出限低。

        2.6 實際樣品測定

        采用本方法對采集的245 份土壤樣品中的20 種除草劑進行檢測(見表6),結(jié)果表明:上述實際樣品中有48 份樣品有檢出,共檢出9 種除草劑,其中莠去津的檢出含量較高,表明莠去津除草劑使用較廣,使用效率較高。與孟繁磊等[24]的研究相比,該采樣區(qū)土壤中莠去津的濃度較低,但當?shù)鼐用耖L期食用受污染的蔬菜,對身體會造成一定危害。所以在農(nóng)業(yè)土壤的管理中對以上被檢出的9 種除草劑應(yīng)給予更多關(guān)注。

        表6 土壤樣品中除草劑的檢測結(jié)果Table 6 Detection results of herbicide residues in soil samples

        3 結(jié) 論

        本研究通過單因素實驗結(jié)合響應(yīng)面分析,得到最優(yōu)的前處理條件:萃取劑為1.5 mL二氯甲烷、提取劑為5 mL乙腈、渦旋時間為8 min。在該條件下,20種除草劑的平均回收率為77.6%~115%,RSD 為0.40%~3.8%,檢出限為0.1~1.0 μg/kg,定量下限為0.2~5.0 μg/kg,均能滿足檢測要求。溶劑誘導萃取不僅能夠提高檢測通量,而且試劑用量少,能夠在線完成凈化和富集,操作簡單,有效降低了成本。本方法為其他除草劑或農(nóng)藥殘留的高通量檢測提供了新的思路。

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