楊光，王雪君，劉婕，楊延婷，張丹，劉力，盧云瓊，曹姚佳妮，魏邦基，馬曉芃，

(1.上海市針灸經(jīng)絡研究所，上海 200030;2.復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院，上海 200031;3.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200437)

干眼是一種臨床常見的多因素眼表疾病，可伴有眼表炎癥、組織損傷及神經(jīng)異常[1]。全球干眼患病率為5%～50%[2]。中國干眼患病率為6.1%～59.1%，高于全球平均水平，并呈現(xiàn)逐年上升和低齡化趨勢[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學治療輕度干眼常采用人工淚液等治療手段，對于中、重度干眼患者，可采用局部免疫抑制劑、強脈沖光、淚道栓塞等措施，但療效有限且存在不良反應[4]。針灸是被廣泛接受的一種補充和替代療法。針刺治療干眼臨床療效肯定，能顯著緩解干眼癥狀，提高淚液分泌量，增加淚膜穩(wěn)定性，修復角膜損傷，療效優(yōu)于人工淚液[5-6];同時還能改善患者生活健康質量和緩解焦慮情緒[7]。在促進淚液分泌方面電針療效優(yōu)于單純針刺[8]。干眼主要發(fā)病機制包括淚膜不穩(wěn)定、淚液滲透壓升高、眼表細胞凋亡和眼表炎癥。淚液高滲透壓引發(fā)的眼表炎癥和眼表細胞凋亡是干眼發(fā)病的主要原因[9]，也可能是針灸治療干眼的關鍵靶點[10-11]。因此，本研究通過觀察電針對干眼兔淚腺細胞凋亡及凋亡相關蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、凋亡相關因子(factor related apoptosis，F(xiàn)as)和B細胞淋巴瘤-2(b cell lymphoma-2，Bcl-2)表達的影響，從調節(jié)細胞凋亡角度探討電針治療干眼的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性新西蘭兔24 只，體質量(2.2±0.2)kg，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。實驗開始前，所有動物適應性飼養(yǎng)于室內溫度(20±2)℃，相對濕度50%～70%的環(huán)境下，接受12 h 光暗周期，自由攝食與飲水。眼表功能檢查無異常的動物方可用于實驗。本次動物實驗所有操作均符合國家科技部頒發(fā)的《關于善待動物的指導性意見》[12]。

1.2 主要試劑與儀器

苯扎氯銨(美國sigma 公司，12060);無水乙醇、甲醛、多聚甲醛、二甲苯、中性樹膠粘合劑、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、0.9%氯化鈉注射液(國藥集團化學試劑有限公司);蘇木素-伊紅染色液(南京建成生物科技有限公司);DNA 斷裂原位末端標記試劑盒(瑞士Roche 有限公司，11772465001);Fas 抗體(美國GeneTex 公司，GTX88349);Caspase-3 抗體(英國Abcam 公司，ab4051);Bcl-2 抗體(美國Abnova 公司，PAB19562);熒光素鈉眼科檢測試紙、淚液檢測濾紙條(天津晶明新技術開發(fā)有限公司);毫針(吳江市云龍醫(yī)療器械有限公司);裂隙燈顯微鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司);光學顯微鏡及分析軟件(日本OLYMPUS 公司);韓氏電針儀(南京濟生醫(yī)療器械科技有限公司)。

1.3 模型制備

參考文獻[13]方法，采用苯扎氯銨溶液滴眼制備兔干眼模型。造模結束后，通過觀察實驗兔淚液分泌量、淚膜破裂時間和角膜熒光素鈉染色評分，鑒定模型制備是否成功。

1.4 動物分組與處理

24 只新西蘭兔采用隨機數(shù)字表法隨機分為正常組、模型組、電針組和假電針組，每組6 只。除正常組外，其余3 組均進行干眼模型制備。在模型制備成功的基礎上進行干預。正常組不造模、不干預;模型組造模后不進行任何干預，只做與其他組相同的固定;電針組造模成功后給予電針干預;假電針組造模成功后給予假電針干預。電針組和假電針組取穴均為雙側攢竹、太陽、絲竹空和風池。穴位定位方法參考《實驗針灸學》[14]中常用動物穴位定位及相關文獻[15]。采用0.20 mm×25 mm 毫針針刺。電針組進針得氣后，雙側攢竹和太陽分別連接韓氏電針儀，連續(xù)波，頻率2 Hz，強度2 mA。假電針組進針透皮即止，雙側攢竹和太陽接韓氏電針儀后不通電。兩組均留針20 min，每日1 次，連續(xù)干預7 d。在實驗過程中假電針組兔死亡1 只，具體死亡原因尚不明確。

1.5 標本采集

采用空氣栓塞法處死實驗動物，用眼科剪分離其主淚腺，并一分為二。一部分用4%多聚甲醛溶液固定，另一部分液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱。

1.6 指標檢測

1.6.1 淚液分泌量

實驗兔用固定架固定，采用Schirmer Ⅰ test(SⅠT)進行淚液分泌量檢測。將淚液檢測濾紙條首端于5 mm 處反折，分別置于兔瞼結膜囊內約中、外1/3處，計時5 min，取出紙條，觀察并記錄濾紙濕長[16]。測量3 次，取平均值。

1.6.2 淚膜破裂時間(tear break-up time，TBUT)

用1 滴生理鹽水潤濕熒光素鈉檢測試紙，抖去多余液體。輕輕翻開實驗兔下眼瞼，使試紙頂端輕觸下眼瞼內側黏膜，輔助瞬目幾次使熒光素鈉均勻分布于眼表，末次瞬目后裂隙燈鈷藍光下觀察角膜出現(xiàn)第一個黑色干燥斑點的時間，記錄TBUT[16]。測量3 次，取平均值。

1.6.3 角膜熒光素鈉染色(corneal fluorescein sodium，CFS)評分

TBUT 檢測完成后，繼續(xù)觀察角膜熒光素鈉染色情況。無染色為0 分，輕度染色(染色少于5 個點)為1 分;中度染色(染色多于5 個點，但未出現(xiàn)塊狀染色或絲狀物)為2 分;重度染色(出現(xiàn)塊狀染色或絲狀物)為3 分。將角膜分成4 個象限分別評分后計算總分，范圍為0～12 分[17]。

1.6.4 淚腺組織形態(tài)學觀察

將4%多聚甲醛溶液固定的淚腺組織進行脫水處理，石蠟包埋，連續(xù)切片(6 μm)。脫蠟水化后采用蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)。再依次經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后在光學顯微鏡下觀察其形態(tài)學變化。

1.6.5 淚腺細胞凋亡檢測

采用DNA斷裂原位末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTPnick-end labeling，TUNEL)法檢測，在光學顯微鏡下觀察，凋亡細胞的細胞核被染成棕黃色，正常細胞細胞核呈藍色。每張切片隨機選取5 個視野拍照。采用Image-Plus Pro 軟件分析，計算出每張照片的凋亡細胞積分光密度(integrated optical density，IOD)，取平均值作為該切片的IOD 值。

1.6.6 淚腺細胞Caspase-3、Fas 和Bcl-2 蛋白表達檢測

應用免疫組化法檢測。切片經(jīng)脫蠟至水，修復抗原后，滴加一抗稀釋液50 μL，濃度分別為Caspase-3(1:500)、Fas(1:500)、Bcl-2(1:400)，濕盒4 ℃冰箱孵育過夜;次日復溫后滴加50 μL 二抗稀釋液，濕盒37 ℃烤箱孵育1 h;再依次應用DAB 混合液顯色，蘇木素復染，1%鹽酸乙醇溶液分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察拍片。采用Image-Plus Pro 軟件分析，計算IOD 值。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS24.0 軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示;不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用中位數(shù)(最小值，最大值)表示。組內比較采用配對樣本t檢驗或Wilcoxon符號秩檢驗。組間比較時，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析進行檢驗，兩兩比較采用Tukey 檢驗;若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但方差不齊，則采用Welch 方差分析，兩兩比較使用Games-Howell 檢驗;若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用Bonferroni法進行校正。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4 組不同時間兔淚液分泌量比較

造模前，各組兔淚液分泌量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。造模后，模型組、電針組、假電針組兔淚液分泌量較造模前均明顯降低(P＜0.05)，且低于正常組(P＜0.05);模型組、電針組和假電針組組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。干預后組內比較顯示，電針組淚液分泌量較造模后顯著增加(P＜0.05)，其余組組內比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。干預后，與正常組比較，模型組淚液分泌量顯著降低(P＜0.05);與模型組比較，電針組淚液分泌量顯著增加(P＜0.05)，其余組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見圖1。

圖1 4 組不同時間兔淚液分泌量比較(±s,n＝5～6)

2.2 4 組不同時間兔TBUT 比較

造模前，各組兔TBUT 差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。造模后，模型組、電針組、假電針組兔TBUT較造模前均明顯縮短(P＜0.05)，且短于正常組(P＜0.05);模型組、電針組和假電針組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。干預后組內比較顯示，模型組TBUT 較造模后顯著縮短(P＜0.05)，電針組TBUT 較造模后顯著延長(P＜0.05)，其余組組內比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。干預后，模型組、電針組和假電針組TBUT 仍顯著短于正常組(P＜0.05)，且模型組和假電針組TBUT 均顯著短于電針組(P＜0.05)，其余組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見圖2。

圖2 4 組不同時間兔TBUT 比較(±s,n＝5～6)

2.3 4 組不同時間兔CFS 評分比較

造模前，各組兔CFS 評分均為0 分。造模后，模型組、電針組、假電針組兔CFS 評分較造模前均明顯升高(P＜0.05)，且高于正常組(P＜0.05);模型組、電針組和假電針組組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。干預后組內比較顯示，電針組CFS 評分較造模后顯著降低(P＜0.05)，其余組組內比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。干預后，與正常組比較，模型組和假電針組CFS 評分顯著升高(P＜0.05)，且模型組和假電針組CFS 評分均高于電針組(P＜0.05)，其余組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見圖3。

圖3 4 組不同時間兔CFS 評分比較(±s,n＝5～6)

2.4 4 組兔淚腺組織病理學比較

正常組兔淚腺組織由大小不等的小葉組成，腺泡大小均勻，排列緊密，腺上皮細胞結構完整并呈高柱狀，胞漿內富含分泌泡，腺泡腔內可見泡狀黏液。與正常組比較，模型組兔淚腺細胞萎縮，排列欠規(guī)則，結構不清晰，腔內黏液物質明顯減少，小葉間隙增大，結締組織明顯水腫。與模型組比較，電針組兔淚腺病理組織損傷減輕，表現(xiàn)為淚腺結構尚完整，腺上皮細胞形態(tài)規(guī)則且飽滿，腔內可見較多黏液成分，小葉間結締組織呈輕度水腫，結果提示電針一定程度上改善了淚腺組織損傷修復。與模型組比較，假電針組兔淚腺組織病變差異不顯著。詳見圖4。

圖4 4 組兔淚腺組織病理學比較(HE 染色,×400)

2.5 4 組兔淚腺細胞凋亡TUNEL 染色結果比較

TUNEL 染色結果顯示，與正常組比較，模型組兔淚腺細胞排列紊亂，可見散在分布的棕黃色細胞核，并伴有細胞核破裂或染色質濃集，提示凋亡的發(fā)生。與正常組比較，模型組兔淚腺細胞凋亡顯著增多(P＜0.05)。與模型組比較，電針組兔淚腺細胞凋亡顯著降低(P＜0.05)，假電針組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與假電針組比較，電針組淚腺細胞凋亡顯著降低(P＜0.05)。詳見圖5 和圖6。

圖5 4 組兔淚腺細胞凋亡TUNEL 染色圖(×400)

圖6 4 組兔淚腺細胞凋亡TUNEL 染色結果比較(±s,n＝5～6)

2.6 4 組兔淚腺細胞Caspase-3 蛋白表達比較

Caspase-3 陽性細胞主要在細胞質著色，呈棕褐色顆粒。與正常組比較，模型組兔淚腺細胞Caspase-3蛋白表達均增高(P＜0.05)。與模型組比較，電針組淚腺細胞Caspase-3 蛋白表達顯著降低(P＜0.05)，假電針組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與假電針組比較，電針組淚腺細胞Caspase-3 蛋白表達降低(P＜0.05)。詳見圖7 和圖8。

圖8 4 組兔淚腺細胞Caspase-3 蛋白表達比較(±s,n＝5～6)

2.7 4 組兔淚腺細胞Fas 蛋白表達比較

Fas 陽性細胞主要在細胞膜著色，呈深褐色顆粒。與正常組比較，模型組淚腺細胞Fas 蛋白表達顯著增高(P＜0.05)。與模型組比較，電針組淚腺細胞Fas 蛋白表達顯著降低(P＜0.05)，假電針組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與假電針組比較，電針組淚腺細胞Fas蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。詳見圖9 和圖10。

圖9 4 組兔淚腺細胞Fas 蛋白表達比較(±s,n＝5～6)

圖10 4 組兔淚腺細胞Fas 蛋白表達免疫組化結果(×400)

2.8 4 組兔淚腺細胞Bcl-2 蛋白表達比較

Bcl-2 陽性細胞主要在細胞胞漿著色，呈深褐色顆粒。與正常組比較，模型組淚腺細胞Bcl-2 蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。與模型組比較，電針組淚腺細胞Bcl-2 蛋白表達顯著增加(P＜0.05)，假電針組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與假電針組比較，電針組兔淚腺細胞Bcl-2 蛋白表達顯著增加(P＜0.05)。詳見圖11 和圖12。

圖11 4 組兔淚腺細胞Bcl-2 蛋白表達比較(±s,n＝5～6)

圖12 4 組兔淚腺細胞Bcl-2 蛋白表達免疫組化結果(×400)

4 討論

細胞凋亡又稱“程序性細胞死亡”，是細胞在各種刺激下主動死亡的一種模式。生理狀態(tài)下細胞凋亡保證了機體生命活動和內環(huán)境的穩(wěn)定;病理狀態(tài)下細胞凋亡失衡是疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制。凋亡細胞清除功能受損或細胞凋亡率增加可導致游離凋亡細胞的繼發(fā)性壞死，從而誘導促炎細胞因子的分泌;死亡細胞則釋放自身抗原引起T細胞活化和B細胞表達，產生自身抗體，引起自身免疫[18]。因此，調控細胞凋亡對疾病的治療具有重要意義。

細胞凋亡通過兩種途徑發(fā)生，一種是外源性途徑，涉及死亡配體與其對應受體間的相互作用;另一種是內源性途徑，由DNA 損傷啟動，如紫外線和化療藥物。這兩種途徑均會導致線粒體損傷，釋放細胞色素c 并激活下游的執(zhí)行 Caspase，導致細胞凋亡[19]。Caspase-3 是參與細胞凋亡的Caspase 中重要的執(zhí)行者，上游激活的起始 Caspase 可通過剪切下游Caspase-3 亞基間的連接使其活化，引起細胞凋亡的特征形態(tài)和生化改變，包括膜泡化、細胞皺縮、“凋亡小體”形成和染色體DNA 片段化[20]，此為細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)。Fas 作為腫瘤壞死家族受體成員參與誘導細胞凋亡的外源性途徑?；罨腇as 可招募Fas 相關死亡域蛋白(fas-associated with death domain protein，F(xiàn)ADD)，同時FADD 可募集procaspase-8 形成Fas-FADD-procaspase-8 死亡誘導信號復合體，進而啟動Caspase 酶級聯(lián)反應，導致細胞凋亡[21-22]。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡內源性信號通路中主要的調控因子，分為促凋亡和抗凋亡因子?？沟蛲龅鞍譈cl-2 可通過Bcl-2 同源3(Bcl-2 homology 3，BH3)結構域與促凋亡蛋白Bcl-2 相關X 蛋白(bcl-2-associated X protein，Bax)、Bcl-2 同源拮抗劑/殺手(bcl-2 homologous antagonist/killer，Bak)結合，抑制促凋亡蛋白的活性和齊聚，從而抑制線粒體外膜通透性，減少細胞色素c的釋放和下游Caspase的活化，最終抑制細胞凋亡[23]。

細胞凋亡在多種眼病的病理過程中具有重要作用，其中包括干眼[24-25]。在干眼患者或動物模型角膜、結膜、淚腺細胞中均可觀察到細胞凋亡的發(fā)生，以及凋亡相關因子的異常表達[9，26-27]。在眼表組織中，淚腺通過分泌淚液，保證眼表濕潤，保護眼表上皮細胞免受暴露和物理損傷，并維持上皮內穩(wěn)態(tài)[28]。淚腺功能異?？梢饻I膜水液層缺乏，使角膜表面潤滑不充分，引發(fā)眼表炎癥、角膜潰瘍和視力喪失[29]。臨床研究顯示，在干燥綜合征和非干燥綜合征干眼患者淚腺腺泡細胞中均能觀察到Fas 的表達，且凋亡相關因子配體(factor related apoptosis ligand，F(xiàn)asL)的表達與淚液分泌量呈顯著負相關，提示淚腺功能與淚腺腺泡細胞凋亡有關，F(xiàn)as-FasL 相互作用可能是淚腺功能障礙的重要機制[26]。GAO J 等[11]發(fā)現(xiàn)與正常淚腺相比，干眼模型犬的淚腺細胞凋亡增加，淚腺組織p53、Fas、FasL 蛋白呈高表達;局部使用環(huán)孢素治療后，淚腺上皮細胞凋亡被抑制，p53 表達明顯降低，而Bcl-2 表達升高。在IL-1α誘導的淚腺炎癥干眼兔模型中，淚腺氧化應激、炎癥、細胞凋亡和纖維化表現(xiàn)均增強;應用左旋肌肽治療后，模型兔淚腺FasL、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β，TGF-β)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)表達均降低，抗氧化生物標志物表達升高，提示淚腺炎癥、氧化應激、細胞凋亡和纖維化是干眼發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[30]。抑制淚腺細胞凋亡可能是治療干眼的有效途徑，這在中醫(yī)藥領域已得到驗證，如密蒙花顆粒[31-33]、潤目靈顆粒[34]、養(yǎng)陰潤目丸[35]、淫羊藿總黃酮[36-37]、鬼針草[38]、針刺[39-40]治療后的淚液分泌量、淚膜穩(wěn)定性和眼表損傷均得到改善，同時能抑制淚腺細胞凋亡。

本研究結果顯示，苯扎氯銨誘導的兔干眼模型淚液分泌量減少、淚膜穩(wěn)定性降低、淚腺病理損傷明顯，淚腺細胞凋亡顯著增多，Caspase-3 和Fas 蛋白表達顯著升高，Bcl-2 蛋白表達顯著降低;電針干預后，干眼模型兔眼表功能顯著改善，淚腺病理損傷減輕，淚腺細胞凋亡減少，凋亡相關蛋白Caspase-3、Fas 表達降低，Bcl-2 表達增加，提示下調淚腺細胞凋亡相關蛋白Caspase-3 和Fas 表達、上調Bcl-2 表達，抑制淚腺細胞凋亡，進而促進淚腺損傷修復可能是電針改善干眼眼表功能的作用機制。此外，課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，電針對干眼模型兔結膜細胞凋亡同樣具有抑制作用[41]。因此，推測調節(jié)眼表細胞凋亡可能是電針治療干眼的作用機制之一。細胞凋亡是一個復雜的過程，尚需更深入的研究，以明確電針抑制眼表細胞凋亡治療干眼的具體機制。