李鴻儒，趙清輝*，王永輝，周靜，陳庭瑞

（駐馬店市中心醫(yī)院a:藥學部；b:創(chuàng)傷骨科，河南駐馬店 463000）

骨質疏松癥（osteoporosis,OP）好發(fā)于中老年人與絕經后女性，易引發(fā)脆性骨折，致殘、死亡風險較大［1］。有報道中老年人群OP 患病率20%，且以腎虛血瘀證常見［2］。有指南指出，OP 發(fā)病率較高，發(fā)生骨折的風險大且80%左右為女性，特別是絕經后女性，建議對高風險女性加強篩查［3］?？梢娂訌姼唢L險人群OP 篩查，防治OP 相關骨折具有重要的臨床、社會意義。目前治療OP 及其相關骨折的方法較多，藥物上有雌激素、鈣劑等，部分用藥效果不好或有嚴重不良反應［4］。近年來中醫(yī)藥在OP 骨折治療中應用較多，中醫(yī)上OP 屬于“骨痿”“骨痹”等范疇，其發(fā)病與腎、肝、脾虛損、外邪侵襲等有關，且呈現漸進緩慢特點［5］。丹皮酚為牡丹、徐長卿提取物，具有散瘀止痛、抗菌消炎功效，還能抗氧化、抑炎、改善微循環(huán)，且可對p38 MAPK 等相關通路影響以抑制滑膜細胞損傷、炎性反應等［6］。有報道丹皮酚保護軟骨細胞的機制可能與Wnt/β-catenin 信號通路抑制，降低基質金屬蛋白酶-9 （matrix metalloproteinases,MMP-9）等指標有關［7］。楊黎等［8］報道稱丹皮酚可能通過抑制Toll 樣受體-4（toll-like receptor,TLR4）/核因子κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）信號通路降低腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α,TNF-α）的產生。MMP-9 與破骨吸收密切相關，參與OP 發(fā)?。?］；NF-κB 被認為是破骨細胞活性的關鍵調節(jié)因子，能介導炎癥、免疫應答等，于OP 中高表達［10］。本研究通過分析丹皮酚對OP 骨折大鼠骨代謝及NF-κB/MMP9 信號通路的影響，為OP 骨折防治提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

清潔級SD 雌性大鼠52 只，體重250～300 g，平均（280.0±15.0）g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號為SYXK（豫）2017-0001，關于大鼠相關操作符合實驗動物倫理要求。隨機將其分為假手術組、模型組、骨化醇組與丹皮酚組，每組13 只。

1.2 模型建立

假手術組，僅打開腹腔，對卵巢附近脂肪組織切除。其他三組均腹腔打開，且將雙側卵巢切除，傷口縫合。常規(guī)飼養(yǎng)10 周后，通過雙能X 線骨密度儀對各大鼠骨密度值（bone mineral density,BMD）進行測定，若建模大鼠BMD 值比假手術組大鼠BMD 平均值小2.5 個標準差，則提示建模成功。

隨后將所有大鼠右側股骨橫向鋸斷，立即用克氏針固定骨折，傷口縫合。

1.3 藥物干預

于骨折固定術后次日對大鼠進行藥物干預，假手術組、模型組均給予用藥同體積生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)12 周。骨化醇組大鼠行阿法骨化醇（華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司）0.05 μg/kg 灌胃，丹皮酚組給予200 mg/kg 丹皮酚（陜西博林生物技術有限公司）灌胃，均1 次/d，連續(xù)12 周。

1.4 檢測指標

1.4.1 BMD 測量

于給藥前和給藥12 周后，采用雙能X 線骨密度儀測定各組大鼠股骨BMD，模式為Hi-red small animal。

1.4.2 骨微CT 檢測

于給藥12 周處死動物后取各組大鼠股骨樣本，于股骨遠端干骺區(qū)域通過micro-CT 掃描儀測定各組大鼠骨小梁數量、厚度與分離度。分辨率18 mm、電流分別為385 μA。

1.4.3 血清檢測

給藥12 周后取血，采用酶聯免疫分析（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）測定各組大鼠血清Ⅰ型前膠原羧基端前肽（type I procollagen propeptide,PINP）、骨鈣素（bone gla protein,BGP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP）水平。通過酶標儀在450 nm 處對吸光度值進行測定，依據標準曲線計算樣本濃度。同時經由ELISA 測定各組大鼠血清TNF-α、白細胞介素（Interleukin）-6、IL-8 水平。相關試劑盒購自漢云克隆科技股份有限公司與上海酶聯生物科技有限公司。

1.4.4 qRT-PCR 檢測

TRIzol 法提取各組大鼠股骨骨髓組織總RNA，逆轉錄合成nDNA，PCR 擴增，嚴格按照相關說明書進行。NF-κB p65 上下游引物分別為5’-CATACGCTGACCCTAGCCTG-3’、5’-TTTCTTCAATCCGGTGGCGA-3’；MMP-9 上下游引物分別為5’-GCCGACTTATGTGGTCTTCC-3’、5’-GCTTCTCTCCCAT CATCTGG-3’，以GAPDH 為內參，其上下游引物分別為5’-GAAGCTGGTCATCAACGGGA-3’、5’-G GCGGAGATGATGACCCTTT-3’。相關參數：50℃120 s，95℃10 min，95。經由2-△△CT 法計算NFκB p65、MMP9 mRNA 相對表達量。

1.4.5 Western Blot 檢測

裂解液提前室溫解凍，適量骨髓組織放入研缽中，裂解液滴入后冰上靜置，上清液提取后通過BCA 蛋白試劑盒檢測蛋白濃度。制備好電泳裝置與聚丙烯酰胺凝膠，電泳操作：80 V 電泳150 min。300 mA 讓蛋白轉移到PVDF 膜上。TBST 緩沖液內滴入脫脂牛奶制備封閉液，膜入封閉液，室內常溫封閉120 min，之后分別加入磷酸化（p）-NF-κB p65、MMP9 一抗（體積比均為1∶1 000 稀釋），4℃孵育過夜。次日TBST 緩沖液洗膜4 次，5 min/次，加入1∶5 000 稀釋的二抗，室溫孵育1 h。洗膜后滴入ECL試劑，讓其顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像分析。β-actin為內參，Image J 軟件對相關蛋白顯影圖進行分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 BMD 與骨微CT 定量檢測

四組大鼠BMD 與骨微CT 定量檢測結果見表1。給藥12 周后BMD 由高至低依次為：假手術組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。骨小梁數由高至低依次為：假手術組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05），骨小梁厚度由高至低依次為：假手術組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）；而骨小梁分離由低至依次為：假手術組＜丹皮酚組＜骨化醇組＜模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。

表1 四組大鼠BMD 與骨微CT 定量檢測比較（±s）Table 1 Comparison of bone mineral density and bone micro-CT measurements among the four groups(±s)

表1 四組大鼠BMD 與骨微CT 定量檢測比較（±s）Table 1 Comparison of bone mineral density and bone micro-CT measurements among the four groups(±s)

指標BMD(g/cm2)骨小梁數(mm-1)骨小梁厚度(μm)骨小梁分離度(mm)假手術組（n=13）0.31±0.06 5.5±0.6 78.5±5.4 0.23±0.04模型組（n=13）0.19±0.04 3.0±0.4 46.9±3.8 0.37±0.07骨化醇組（n=13）0.25±0.05 4.5±0.5 70.8±5.0 0.26±0.05丹皮酚組（n=13）0.26±0.06 4.7±0.6 72.3±4.7 0.25±0.06 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 血清檢測

給藥12 周后血清檢測結果見表2。PINP 由高至低依次為：假手術組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）；血清BGP 由高至低依次為：假手術組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）；血清ALP 由高至低依次為：假手術組＞丹皮酚組＞骨化醇組＞模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。而血清TNF-α、IL-6 和IL-8 由低至高依次均為：假手術組＜丹皮酚組＜骨化醇組＜模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。

表2 四組大鼠血清指標檢測比較（±s）Table 2 Comparison of serum markers among the four groups(±s)

表2 四組大鼠血清指標檢測比較（±s）Table 2 Comparison of serum markers among the four groups(±s)

指標PINP(μg/L)BGP(μg/L)ALP(U/L)TRAP(μg/L)TNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)IL-8(pg/ml)假手術組（n=13）93.6±13.0 2.1±0.2 201.0±23.6 1.5±0.4 4.0±1.3 1.7±0.4 2.9±0.7模型組（n=13）26.5±6.2 0.9±0.2 112.4±12.7 2.8±0.6 20.4±4.6 3.5±0.8 12.3±2.4骨化醇組（n=13）80.7±10.5 1.6±0.3 175.2±15.4 2.0±0.5 8.6±2.3 2.2±0.6 5.0±1.3丹皮酚組（n=13）82.4±11.3 1.7±0.4 180.3±18.6 1.8±0.4 8.0±2.9 2.0±0.5 4.7±1.2 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 標志物mRNA 和蛋白表達檢測

給藥12 周后骨標志物mRAN 和蛋白檢測結果見表3。NF-κB p65 和MMP 的mRNA 表達均由低至高低依次為：手術組＜丹皮酚組＜骨化醇組＜模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。p-NF-κB p65 和MMP9 蛋白表達由低至高依次為：假手術組＜丹皮酚組＜骨化醇組＜模型組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05）。

表3 四組標志物mRNA 和蛋白表達檢測（相對表達量，±s）Table 3 Comparison of mRNA and protein expressions of bone marrow markers among the four groups(RQ,±s)

表3 四組標志物mRNA 和蛋白表達檢測（相對表達量，±s）Table 3 Comparison of mRNA and protein expressions of bone marrow markers among the four groups(RQ,±s)

指標qRT-PCR NF-kB-p65 MMP9 Western Blot P-NF-kB-p65 MMP9假手術組（n=13）模型組（n=13）骨化醇組（n=13）丹皮酚組（n=13）P 值3.0±0.4 1.0±0.3 4.2±0.3 2.0±0.5 3.5±0.7 1.4±0.4 3.3±0.5 1.3±0.3＜0.001＜0.001 0.15±0.03 0.4±0.1 0.50±0.10 1.8±0.3 0.22±0.06 0.7±0.3 0.20±0.04 0.6±0.2＜0.001＜0.001

3 討論

據統(tǒng)計，我國＞50 歲居民OP 發(fā)生率19.2%，女性OP 比例32.1%，是男性的5 倍左右［11］。故選擇雌性大鼠進行本次實驗，通過切除卵巢構建OP，且橫向鋸斷股骨以形成骨折，相比假手術組，模型組及其他組給藥前BMD 值均顯著降低，提示OP 骨折大鼠建模成功。相比模型組，骨化醇組、丹皮酚組給藥12 周后BMD 值均顯著高，且骨小梁數目明顯增多，骨小梁形態(tài)明顯改善。提示西藥（阿法骨化醇）與丹皮酚均能提高OP 骨折大鼠骨密度，恢復骨小梁異常形態(tài)，與張富財等［12］報道基本相符。骨代謝指標與OP 及其相關骨折密切相關［13］。其中PINP可直接反映I 型膠原合成速率［14］；ALP 參與成骨過程，通過對磷酸酯、焦磷酸鹽活性水解可促骨形成［15］；BGP 多源于成骨細胞，其水平高低關系到成骨細胞活性［16］；TRAP 則與破骨細胞有關，其水平高低反映破骨細胞活性［17］。本實驗骨化醇組、丹皮酚組給藥后血清PINP、BGP、ALP 水平比模型組均顯著增高，TRAP 水平顯著降低。提示阿法骨化醇與丹皮酚均能抑制破骨細胞活性，促進骨細胞形成。這可能與丹皮酚具有促進骨折愈合、抗骨關節(jié)炎等藥理作用有關。

OP 骨折屬于慢性炎癥疾病，IL、TNF-α 等炎性因子參與OP 骨折發(fā)生、進展［18］。MMP-9 被發(fā)現在OP 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其抑制MMP-9 基因及蛋白表達是促破骨細胞凋亡的可能機制［19］，并通過對軟骨組織（非礦化）降解，釋放血管內皮生長因子直接活化破骨細胞。NF-κB 參與炎癥過程，通過對NF-κB 信號通路及其相關炎癥指標抑制可促成骨細胞生長，在OP 防治中發(fā)揮作用［20］。有報道稱，NFκB 的結合位點在MMP-9 啟動子內，MMP-9 表達受NF-κB 影響［21］。Sabry M 等［22］研究表明，MMP-9、NF-κB 高表達與絕經后骨質疏松發(fā)生有關。Liu等［23］研究表明丹皮酚可通過抑制IL-1β 等誘導的軟骨細胞炎癥以控制骨關節(jié)炎病情。本實驗中，相比假手術組，模型組血清TNF-α、IL-6、IL-8 水平均顯著增高。提示血清炎癥指標參與OP 骨折發(fā)病過程。且骨化醇組、丹皮酚組治療后血清TNF-α、IL-6、IL-8 水平均比模型組顯著降低。提示丹皮酚能有效抑制血清促炎因子，這可能與丹皮酚抗菌消炎、抗氧化、抑炎作用有關。另外，周曉慧等［24］研究表明丹皮酚通過對NF-κB/MMP-9 信號通路下調可逆轉心肌梗死后心室重構。有研究表明，丹皮酚可能通過調控Wnt/β-catenin、TLR4/MYD88/NF-κB 信號通路發(fā)揮軟骨細胞保護、減輕肝臟缺血再灌注損傷的作用［7，25］。本實驗中，丹皮酚組治療后股骨骨髓組織中NF-κB p65、MMP mRNA 表達與p-NF-κB p65、MMP9 蛋白水平比模型組均顯著降低。提示丹皮酚能有效調控OP 骨折大鼠NF-κB/MMP-9 信號通路，抑制炎癥以促進骨愈合。

綜上所述，丹皮酚可能通過下調NF-κB/MMP-9信號通路，抑制IL-6、IL-8 等炎性因子，以恢復破骨、成骨細胞平衡，達到治療OP 骨折的目的，可為臨床OP 骨折患者治療提供新參考。但由于骨形成相關信號通路比較多，丹皮酚是否也影響其他信號通路尚需進一步研究。