關(guān)鍵詞西瓜；瓜類尾孢；多基因序列聯(lián)合分析；毒力測(cè)定

西瓜為一年生蔓生草本植物，果實(shí)甘甜多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛；西瓜生長(zhǎng)周期短，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，深受種植戶喜愛。據(jù)FAO統(tǒng)計(jì)，2021年我國(guó)西瓜種植面積為141萬hm2左右，產(chǎn)量約為6101萬t（WWW．fao．org）。上海市西瓜常年種植面積約為2000hm2，不僅是上海市郊區(qū)農(nóng)業(yè)致富的重要產(chǎn)業(yè)，也是品牌農(nóng)業(yè)、休閑農(nóng)業(yè)、生態(tài)農(nóng)業(yè)的重要載體。西瓜在生長(zhǎng)過程中會(huì)受到多種病害的侵襲，常發(fā)的病害有蔓枯病、白粉病、炭疽病、葉斑病等，這些病害嚴(yán)重影響西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

2022年7月，本研究組在上海市浦東新區(qū)調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，多個(gè)農(nóng)戶的種植大棚中出現(xiàn)一種癥狀相似的葉部病害，嚴(yán)重時(shí)整葉枯黃，影響植株光合作用和正常生長(zhǎng)，田間株發(fā)病率50%以上。為明確引起該病害的病原菌，本研究對(duì)典型癥狀病樣進(jìn)行組織分離、純化、培養(yǎng)，并結(jié)合病原菌形態(tài)、生物學(xué)特征、致病性、多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)分離物進(jìn)行鑒定，以明確引起上海市西瓜葉斑病的病原菌種類，并開展了藥劑室內(nèi)毒力測(cè)定，以期為該病害的防控提供參考。

1材料與方法

1.1材料

病樣：于上海市浦東新區(qū)公平村西瓜種植戶采集有典型病害癥狀的西瓜葉片。

瓊脂、葡萄糖、二甲基亞砜等生化試劑購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；2×Taq Master Mix （Lot：P112-01）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司、2k plus DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

10種供試殺菌劑原藥及來源：98%氟啶胺原藥（江西禾田科技有限公司）、95.4%己唑醇原藥（江蘇七洲綠色化工股份有限公司）、98%氟環(huán)唑原藥（江蘇七洲綠色化工股份有限公司）、97%戊唑醇原藥（江蘇七洲綠色化工股份有限公司）、97%咪鮮胺原藥（上海悅聯(lián)化工有限公司）、98%嘧菌酯原藥（山東京博農(nóng)化科技股份有限公司）、98%氟吡菌酰胺原藥（拜耳股份公司）、95.2%苯醚甲環(huán)唑原藥（上海生農(nóng)生化制品股份有限公司）、96.9%異菌脲原藥（江西禾益化工股份有限公司）、98%氟唑菌酰胺原藥（巴斯夫歐洲公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1癥狀觀察

2022年7月，在上海市浦東新區(qū)公平村西瓜種植戶，觀察西瓜葉斑病危害癥狀及程度等。

1.2.2病原菌的分離與純化

將有典型癥狀的發(fā)病初期葉片洗凈，在自來水下沖洗2h，按組織分離法分離病原菌。在病健交界處剪取直徑6～8mm的圓形病斑，用2%次氯酸鈉浸泡消毒2～3min，然后用滅菌水清洗3次，在無菌的培養(yǎng)皿內(nèi)晾干，均勻放置在含有50ug/mL氯霉素和50ug/mL鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上，26℃黑暗培養(yǎng)，挑取邊緣菌絲到新的PDA培養(yǎng)基上，待分離物產(chǎn)生孢子后，挑取單個(gè)孢子進(jìn)行分離純化，分離物5℃保存。

1.2.3分離物的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性

參考方中達(dá)的方法對(duì)分離物SHCCCO1進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，在26℃下黑暗培養(yǎng)，觀察其在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征以及菌絲和分生孢子的顯微形態(tài)。同時(shí)觀察光照對(duì)分離物色素產(chǎn)生的影響：先26℃全黑暗培養(yǎng)7d，然后全光照培養(yǎng)（光強(qiáng)度500lx，光源高度40cm）3d，觀察光照對(duì)紅色素產(chǎn)生的影響。

參考方中達(dá)的方法測(cè)試菌落生長(zhǎng)適宜溫度：用打孔器在活化的菌落邊緣取直徑6mm的菌餅，接種在PDA培養(yǎng)基中央，設(shè)置培養(yǎng)溫度范圍18～34℃、溫度梯度2℃，黑暗培養(yǎng)7d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，試驗(yàn)重復(fù)4次。

1.2.4致病性測(cè)定

將分離物SHCCC01接種于直徑90mm的PDA平板上（20mL培養(yǎng)基／皿）、26℃黑暗培養(yǎng)10d后，取2個(gè)平板的所有培養(yǎng)物連同培養(yǎng)基一起置于勻漿杯中，加100mL無菌水，高速組織搗碎儀10000r/min勻漿2min，菌懸液終濃度調(diào)至OD600 nm=1.5，用手持噴霧器均勻噴霧接種2～3葉期‘早佳一號(hào)’西瓜苗20株；噴施等量無菌水的‘早佳一號(hào)’西瓜苗20株為對(duì)照，在透光的塑料箱內(nèi)保濕，在26℃L∥D=12h∥12h條件下生長(zhǎng)。每日觀察記錄植株發(fā)病情況，接種7d后從發(fā)病植株的葉片發(fā)病部位重新分離病原菌，進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.2.5病原菌多基因聯(lián)合鑒定

將分離物SHCCCO1在PDA培養(yǎng)基上26℃培養(yǎng)7d后，挑取少量菌絲，參考Harju的方法提取真菌基因組DNA。對(duì)分離物分別選擇核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacers，ITS）引物ITSI（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）/ITS4進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增和測(cè)序，引物合成及測(cè)序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。PCR擴(kuò)增體系反應(yīng)程序參考各引物出處文獻(xiàn)。

以暹羅假尾孢Pseudocercospora thailandica（CPC 10547）為外群參考序列，將分離物的序列與已經(jīng)發(fā)表的ITS、His、TEFI-a、Act序列經(jīng)Clustalx1.83做完全比對(duì)，并將兩端截齊，相關(guān)序列信息見表1。使用Sequence Matrix 1.80軟件按ITS-His-TEF-Act順序連接成多基因聯(lián)合序列。基于鄰接法（neighbor-joining，NJ），設(shè)置自展值（boot-straps）為1000，用MEGA 7構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)抑制法，具體步驟參考劉欣等、曾蓉等的方法，測(cè)試10種殺菌劑原藥對(duì)分離物SHCCCOI的室內(nèi)毒力。將供試菌株在PDA平皿上26℃黑暗培養(yǎng)7d后，在菌落邊緣打取直徑6mm的菌餅，菌絲面朝下接入含有藥劑的PDA平皿中央。所有藥劑用二甲基亞砜（DMSO）溶解成相應(yīng)濃度后加入PDA平皿，設(shè)置不同濃度梯度。氟啶胺和己唑醇濃度設(shè)置為0.05、0.1、0.5、1.0、2.0ug/mL和5.0ug/mL;氟環(huán)唑和戊唑醇濃度設(shè)置為0.1、0.5、1．0、2.0、5.0ug/ml。和10.0ug/mL；咪鮮胺、嘧菌酯和氟吡菌酰胺濃度設(shè)置為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0ug/mL和50.0ug/mL;苯醚甲環(huán)唑、異菌脲和氟唑菌酰胺濃度設(shè)置為10.0、50.0、100.0、200.0ug/mL和300.0ug/mL。以上藥劑均使用DMSO溶解，以添加100uL DMSO的PDA平皿為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)4次，26℃黑暗培養(yǎng)7d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，用如下公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑一處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-6mm）×100%。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用WPS Office 2023進(jìn)行處理，線性回歸采用DPS 7.05進(jìn)行分析，計(jì)算線性方程斜率（slope）、標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）、卡方值（X2）、自由度（df）、抑制中濃度（ECso）、95%置信限。

2結(jié)果與分析

2.1田間癥狀

在夏秋季西瓜設(shè)施大棚內(nèi)，病原物主要侵染西瓜葉片，表現(xiàn)為發(fā)病初期葉片上出現(xiàn)直徑1～2mm大小深褐色不規(guī)則或近圓形斑點(diǎn)，濕度高時(shí)發(fā)病部位擴(kuò)大至10mm或更大斑，病斑褐色，中心部位灰白色，病斑周圍時(shí)有黃色，有典型的尾孢病害“蛙眼”狀圓斑，嚴(yán)重時(shí)整葉枯死，嚴(yán)重影響西瓜正常生長(zhǎng)（圖1）。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，上海市主栽西瓜品種‘早佳一號(hào)’大都易感病，株發(fā)病率高于50%。

2.2病原菌形態(tài)及生物學(xué)特性

組織分離后5d組織塊周圍長(zhǎng)出灰褐色菌落，菌落邊緣菌絲白色，取菌落邊緣純化后，待分離物產(chǎn)生孢子后，挑取單個(gè)孢子進(jìn)行分離純化。對(duì)5個(gè)病樣進(jìn)行分離，共獲得20個(gè)分離物，命名為SHCCCO1～SHCCC20，這些分離物的菌落形態(tài)特征、生長(zhǎng)速度基本一致，本研究選取了分離物SHCCCO1進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

分離物SHCCC01菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，在黑暗條件下，正面白色或灰色，背面灰褐色或暗褐色（圖2）；在光照培養(yǎng)條件下，菌落四周會(huì)產(chǎn)生鮮紅色或暗紅色色素（圖3）。西瓜葉斑病菌菌絲生長(zhǎng)最適宜溫度是26℃，在該溫度下在PDA上培養(yǎng)7d菌落直徑為22.6mm，培養(yǎng)14d后菌落直徑為40.2mm;在18℃和34℃時(shí)，分離物生長(zhǎng)速度緩慢，在PDA上培養(yǎng)7d菌落直徑分別為12.3mm和9.0mm，培養(yǎng)14d菌落直徑分別為22.8mm和9.9mm。

在自然發(fā)病的葉片發(fā)病部位能觀察到分生孢子梗和分生孢子的產(chǎn)生，其分生孢子梗多為簇生，基部棕褐色，頂端淺褐色，直立或彎曲，有多個(gè)屈膝狀折點(diǎn)，有多個(gè)隔膜（圖4a）；分生孢子無色，直或彎，短小的孢子呈倒棍棒狀，基部平截，頂端近尖至鈍，有3個(gè)以上隔膜，部分孢子有多達(dá)30余個(gè)隔膜，孢子大小為（2.5～5.2）um×（35. 3～240.3）um。黑暗條件下在PDA上培養(yǎng)14d，會(huì)有少量分生孢子產(chǎn)生，形態(tài)特征與葉片上相似（圖4b～e）。這些特征與郭蘭英等描述的侵染葫蘆科作物的瓜類尾孢較相似，與葉云峰等在甜瓜上發(fā)現(xiàn)的形態(tài)特征等也相似，初步判斷引起西瓜葉斑病的病原為尾孢菌。

2.3分離菌株對(duì)西瓜的致病性

20株2～3葉期‘早佳一號(hào)’西瓜接種SHCCCO1后7d，被接種葉片出現(xiàn)壞死斑，中間灰白色，后期病斑變大，整葉枯萎，與田間癥狀相似，而對(duì)照植株葉片上無癥狀（圖5）。從接種植株的發(fā)病部位重新進(jìn)行組織分離，得到了與SHCCCO1分離物形態(tài)特征一致的分離物，進(jìn)一步說明了SHCCCO1是引起西瓜葉斑病的病原菌。

2.4分子生物學(xué)鑒定

利用ITS、His、TEFI-a和Act4個(gè)基因序列的引物對(duì)西瓜葉斑病菌分離物SHCCCO1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到長(zhǎng)度為536、391、308、225 bp的DNA片段，上傳到NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號(hào)分別為：OR054068、OR088051、OR088052、OR088053.在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行各序列BLASTn，結(jié)果顯示：菌株SHCCCOI的ITS序列與瓜類尾孢C．cit-ruZlina、辣椒尾孢C．capsici、煙草尾孢C．nicoti-anae、甜菜尾孢C．beticola、馬來尾孢C．maZayenszs、芹菜尾孢C．a(chǎn)pii等諸多尾孢分離物的相似性都高達(dá)100%; His基因序列與數(shù)據(jù)庫中瓜類尾孢相似性都高于98．0%; TEF1-a基因序列與瓜類尾孢C．citrullina相似性都高于99.0%，與其他尾孢種的相似性在98. 0%左右；Act基因序列與瓜類尾孢C．citrullina相似性都高于99．0%，與其他尾孢種的相似性在97.0%～98．0%左右。

分離物SHCCCO1的ITS、His、TEF1-a和Act4個(gè)基因序列與尾孢相應(yīng)序列的相似性最高?；贗TS、His、TEFI-a和Act 4個(gè)基因聯(lián)合序列，經(jīng)NJ法構(gòu)建了分離物SHCCCO1的多基因系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。在該進(jìn)化樹中，分離物SHCCCO1～SHC-CC03與瓜類尾孢C．citrullina的2個(gè)分離物聚集在一個(gè)分支，自展值為92。

2.5室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定

應(yīng)用菌絲生長(zhǎng)抑制法，測(cè)試10種藥劑對(duì)分離物SHCCC01的室內(nèi)毒力作用。結(jié)果顯示（表2）：抑菌作用最好的是氟啶胺、己唑醇、氟環(huán)唑、戊唑醇等4種藥劑，EC50分別為0.3752、0.5754、1.4723、1.8902ug/mL，其次為嘧菌酯、咪鮮胺、氟吡菌酰胺3種藥劑，其EC50分別為11.7012、12.448 0、21.262ug/mL;試驗(yàn)中，苯醚甲環(huán)唑、異菌脲和氟唑菌酰胺對(duì)分離物SHCCCOI的抑制活性較差，苯醚甲環(huán)唑EC50為178.1876ug/mL，而異菌脲和氟唑菌酰胺兩種藥劑在試驗(yàn)中設(shè)置終濃度為300ug/mL時(shí)，仍未能測(cè)得有效的EC50。

3結(jié)論與討論

本研究對(duì)采自上海市浦東新區(qū)的‘早佳一號(hào)’西瓜葉片上致病菌進(jìn)行了分離，共獲得了20株培養(yǎng)形態(tài)一致的分離物。經(jīng)過柯赫氏法則驗(yàn)證，選取了分離物SHCCCO1進(jìn)一步進(jìn)行了菌落形態(tài)、生物學(xué)特性、致病性測(cè)定。并通過分子生物學(xué)方法獲得了該分離物的ITS、His、TEFI-a、和Act的部分序列，通過多基因序列聯(lián)合建立NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，綜合分析結(jié)果表明，引起上海浦東新區(qū)西瓜葉斑病的分離物SHCCCO1為瓜類尾孢C．citrullina。

引起西瓜葉部斑點(diǎn)癥狀的病害較多，有西瓜蔓枯病、細(xì)菌性葉斑病、西瓜炭疽病、尾孢葉斑病等，且這些病害僅通過癥狀難以確認(rèn)病原。本研究中在葉片上觀察到的癥狀與陳益果等的描述十分相似，通過分生孢子梗、分生孢子形態(tài)、病原菌生物學(xué)特性和致病性等的鑒定，都和尾孢菌引起的植物病害特征相吻合。然而，尾孢屬近緣種之間的看家基因序列相似性高，僅憑單個(gè)基因序列信息很難準(zhǔn)確鑒定到種。Inglis等、Conway、Mon-tenegro-Calderon等也證實(shí)，僅通過ITS序列分析無法區(qū)分大多數(shù)尾孢屬以下的分類。多基因聯(lián)合建樹的方法是尾孢菌較常用的進(jìn)化分類方法，Groe-newald等應(yīng)用ITS，TEFI-a，Act和Cal基因序列聯(lián)合建樹的方法將67株尾孢分離物分為甜菜尾孢C．beticola、芹菜尾孢C．a(chǎn)pii和C．a(chǎn)ppiicola3組；曾蓉等也應(yīng)用相同的方法成功地鑒定了引起上海市茼蒿葉斑病的病原；本文也采用了相同的方法成功將西瓜葉斑病病原鑒定到種，多基因序列聯(lián)合建樹方法鑒定病原菌已經(jīng)成為植物病害的常用研究手段之一。

葉云峰等藥劑篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，70%代森錳鋅可濕性粉劑等藥劑對(duì)甜瓜尾孢葉斑病有較好的抑制作用。本研究選取了10種殺菌劑原藥對(duì)分離物SHCCCO1進(jìn)行毒力測(cè)定，結(jié)果顯示，殺菌劑原藥抑菌活性大小為：氟啶胺（二硝基苯胺類）gt;己唑醇、戊唑醇、氟環(huán)唑（三唑類）gt;咪鮮胺（咪唑類）gt;嘧菌酯（甲氧基丙烯酸類）gt;氟吡菌酰胺（吡唑酰胺類）gt;苯醚甲環(huán)唑（三唑類）gt;氟唑菌酰胺（羧酰胺類）、異菌脲（二甲酰亞胺類）。氟啶胺、己唑醇、戊唑醇、氟環(huán)唑?qū)Ψ蛛x物SHCCC01的抑制活性較強(qiáng)，EC50值在0.3752～1.8902ug/mL之間。這些結(jié)果為后續(xù)西瓜葉斑病防治藥劑田間藥效評(píng)價(jià)及藥劑種類的選擇提供重要的技術(shù)支持。