關(guān)鍵詞煙粉虱傳雙生病毒；廣東；發(fā)生；分布；種類

煙粉虱傳雙生病毒（whitefly-transmitted gemi-nivlruses．WTGs）即為雙生病毒科Geminicoiridae菜豆金色黃花葉病毒屬病毒，是一類具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA植物病毒，自然界中主要依靠煙粉虱以持久性方式傳播，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。該類病毒主要侵染雙子葉植物，引起寄主植物表現(xiàn)葉片黃化、卷曲、葉脈黃化或深綠色、產(chǎn)生耳突、金或黃花葉、整株矮化等典型癥狀。WTGs已在亞洲、非洲、地中海盆地等多地流行成災(zāi)，嚴重影響多國番茄、棉花、甘薯、南瓜等眾多作物生產(chǎn)，造成巨大經(jīng)濟損失。例如，1991年-1992年，美國佛羅里達州的番茄因煙粉虱傳雙生病毒造成的損失高達1.4億美元；2006年-2009年，巴基斯坦棉花煙粉虱傳雙生病毒病發(fā)生面積達460萬hm2，損失慘重；印度的棉花、豆類等多種農(nóng)作物每年因該類病毒危害造成的經(jīng)濟損失高達數(shù)億美元。2011年，危害全球番茄的煙粉虱傳雙生病毒之一番茄黃化曲葉病毒被250多位植物病毒學(xué)家一致認為是全球第三大重要的植物病毒。

在我國，煙粉虱傳雙生病毒危害重、分布廣，已引起多種重要作物毀滅性病害。廣東省是我國該類病害的重發(fā)區(qū)。20世紀二三十年代，在廣州就有番茄黃頂病零星發(fā)生，60年代初經(jīng)研究確定該病害可通過嫁接和白粉虱傳播，這是粉虱傳病毒病在我國有發(fā)生的最早報道。80年代初，通過病原分離純化及電子顯微鏡觀察初步確定廣東、云南、福建及臺灣等地?zé)煵萸~病是由雙生病毒侵染引起，這是我國發(fā)現(xiàn)雙生病毒的首次報道。21世紀以來，多位研究者報道在廣東番茄、番木瓜、朱槿以及各種雜草發(fā)現(xiàn)煙粉虱傳雙生病毒病。其中，由煙粉虱傳雙生病毒侵染引起的番茄黃化曲葉病對廣東省番茄產(chǎn)業(yè)影響極為嚴重。2003年，報道廣東番茄有煙粉虱傳雙生病毒病的發(fā)生和危害。隨后該病害蔓延到廣東各番茄產(chǎn)區(qū)，2007年-2009年，在廣東省各番茄產(chǎn)區(qū)大暴發(fā)，嚴重田塊病株率高達100%，一些傳統(tǒng)番茄產(chǎn)區(qū)因此病害已放棄種植。近年來，冬種櫻桃番茄在茂名、湛江、潮州等地的發(fā)展較快，番茄黃化曲葉病出現(xiàn)明顯擴散與逐年加重趨勢。

根據(jù)基因組類型可將Begornovzirus分為雙組分病毒和單組分病毒。雙組分病毒含有2個大小為2.5～3.0kb的單鏈環(huán)狀DNA分子，分別稱為DNA-A組分和DNA-B組分。DNA-A組分具有5～7個ORFs．分別編碼AV1、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4、AC5蛋白；DNA-B組分具有2個ORFs，分別編碼BV1和BC1蛋白。單組分病毒僅含有1個約2.7kb大小的單鏈環(huán)狀DNA分子，基因組結(jié)構(gòu)相當(dāng)于雙組分病毒DNA-A，常與alphasatellite、betasatellite及缺失衛(wèi)星分子形成復(fù)合體侵染植物。

Begornouirus是雙生病毒科中最大的一個屬，根據(jù)國際病毒分類委員會最新公布，已包含445種病毒。我國煙粉虱傳雙生病毒種類多。截至2021年，在中國報道的煙粉虱傳雙生病毒有86種，其中云南、廣西、福建、廣東、海南、臺灣等南方省份病毒種類多，由此可見我國南方地區(qū)雙生病毒種類極為復(fù)雜。本課題組對廣東煙粉虱傳雙生病毒病進行了長期系統(tǒng)調(diào)查、種類鑒定與跟蹤監(jiān)測，以摸清廣東省煙粉虱傳雙生病毒的發(fā)生種類、分布及其擴散動態(tài)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1材料與方法

1.1材料

樣品來源：2003年-2021年，從廣東省廣州、佛山、惠州、汕頭、清遠、肇慶、江門、茂名、湛江、梅州、河源、韶關(guān)、潮州和陽江等14個地級市采集疑似煙粉虱傳雙生病毒感染的番茄、黃秋葵、南瓜等蔬菜作物，甘薯、朱槿以及賽葵、勝紅薊、微甘菊等各類雜草樣品。病樣保存于-80℃冰箱待用。

1.2病害調(diào)查與病樣采集

煙粉虱傳雙生病毒侵染后會引起寄主植物表現(xiàn)黃化曲葉、黃脈、黃花葉、葉脈腫大、曲葉等典型癥狀，根據(jù)這些特征癥狀，每年均采用在廣東全省范圍調(diào)查、重點作物普查和跟蹤監(jiān)測相結(jié)合的方法對廣東省煙粉虱傳雙生病毒病進行研究，并隨機采集典型癥狀的蔬菜、甘薯、雜草等各類植物疑似病樣帶回實驗室進行分子檢測與病毒鑒定。

1.3疑似病樣總DNA的抽提

取疑似病樣約100mg，按照植物基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）的步驟提取病樣總DNA，所獲DNA溶解于50uLTE溶液中，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4病毒PCR檢測

利用擴增煙粉虱傳雙生病毒（即菜豆金色黃花葉病毒屬病毒）DNA-A組分的通用簡并引物，對疑似病樣進行PCR檢測。

1.5病毒全基因組序列的擴增及克隆

以PCR檢測陽性的代表病樣總DNA為模板，根據(jù)特異片段序列設(shè)計背向引物進行PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進行克隆、測序；或利用DNA滾環(huán)擴增試劑盒進行滾環(huán)擴增、酶切、克隆測序。

1.6病毒序列分析及種類確定

利用DNAStar軟件的SeqMan對測序所獲得的基因序列進行拼接，獲得病毒全基因序列，并在NCBI網(wǎng)站的ORF Finder（https：∥www. ncbi．nlm．nih. gov/orffinder/）進行ORF預(yù)測。利用BLASTn程序?qū)λ@病毒序列進行序列相似性搜索，從中挑選相似性較高的相關(guān)病毒代表分離物序列，進一步用SDT1.2的MUSCLE alignment進行序列相似性的詳細分析，最后依據(jù)最新菜豆金色黃花葉病毒屬病毒分類標準來確定病毒種類。目前最新分類標準為：所獲得的全基因組序列與已報道各個種的核苷酸序列進行相似性比對，若DNA-A序列相似性lt;91%，則為一個新種，若91%lt;相似性lt;94%，則該分離物為一個新的株系。

2結(jié)果與分析

2.1煙粉虱傳雙生病毒病在廣東的發(fā)生情況

2003年-2021年，煙粉虱傳雙生病毒病害在廣東省廣州、佛山、惠州、汕頭、清遠、肇慶、江門、茂名、湛江、梅州、河源、韶關(guān)、潮州和陽江14個地級市均有發(fā)生，寄主植物多達24種，包括番茄、南瓜、黃秋葵、甘薯、葫蘆、白瓜、冬瓜、朱槿、軟枝黃蟬、鱧腸、垂花懸鈴花、紅麻、棉花賽葵、黃花捻、勝紅薊、霧水葛，三三裂葉薯、微甘菊、苧麻、構(gòu)樹、三裂葉野葛和十萼茄。田間寄主植物主要表現(xiàn)黃化曲葉、曲葉、葉脈腫大、黃脈、黃花葉等癥狀（表1）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，朱槿曲葉病在廣東省上述14市均有發(fā)現(xiàn)，番茄黃化曲葉病在廣州、佛山、肇慶、惠州、茂名、湛江、河源、梅州、汕頭、潮州番茄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，瓜類曲葉病在廣州、佛山、惠州、河源、湛江瓜類作物產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，各類雜草病害以局部發(fā)生為主。煙粉虱傳雙生病毒病危害程度與煙粉虱種群密度、寄主植物種類、侵染時生育期、地理區(qū)域及危害年限等相關(guān)。通常煙粉虱種群密度大發(fā)病嚴重，作物生長后期發(fā)病比生長初期發(fā)病重，珠三角地區(qū)和粵西地區(qū)發(fā)生較粵東、粵北嚴重?？傮w而言，朱槿、番茄發(fā)病普遍，南瓜、甘薯、黃秋葵等在部分主產(chǎn)區(qū)發(fā)病較嚴重，其余寄主植物局部發(fā)病或零星發(fā)生，以番茄黃化曲葉病發(fā)生最為普遍，田間病株率5%～100%。

2003年-2021年間，從廣東省采集表現(xiàn)典型煙粉虱傳雙生病毒病癥狀各類疑似病樣累計超過1500份，其中番茄疑似病樣750份。利用擴增煙粉虱傳雙生病毒的通用簡并引物AV/CoPR，對疑似病樣總DNA進行PCR檢測，若能擴增出大小為570bp的片段，則表示該病樣中存在煙粉虱傳雙生病毒。檢測結(jié)果表明，田間表現(xiàn)黃化曲葉、曲葉、葉脈腫大、黃脈、黃花葉等癥狀的番茄、南瓜、黃秋葵等24種植物疑似樣品中均能檢測到煙粉虱傳雙生病毒。

2.2發(fā)現(xiàn)并鑒定出的煙粉虱傳雙生病毒種類

以煙粉虱傳雙生病毒PCR檢測為陽性的代表病樣DNA為模板，應(yīng)用特異背向引物進行PCR擴增、RCA-多種限制性內(nèi)切酶酶切方法，克隆雙生病毒基因組全長序列，依據(jù)該屬最新分類標準來確定所獲分離物的分類地位，結(jié)果從采集的疑似病樣中共鑒定出21種煙粉虱傳雙生病毒，登錄煙粉虱傳雙生病毒基因組全序列118個（表2）。這些病毒分別為：番茄病樣中有廣東番茄黃化曲葉病毒（tomatoyellow leaf curl Guangdong vlrus， TYLCGdV）、廣東番茄曲葉病毒（tomato leaf curl Guangdong vi-rus．ToLCGdV）、臺灣番茄曲葉病毒（tomato leafcurl Taiwan virus，ToLCTV）、TYLCV、泰國番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl Thailand vi-rus，TYLCTHV）5種；從朱槿、黃秋葵、垂花懸鈴花、紅麻、棉花病樣中分離鑒定出的病毒為木爾坦棉花曲葉病毒；從南瓜、葫蘆、白瓜、冬瓜病樣中分離鑒定出的病毒為中國南瓜曲葉病毒；甘薯病樣中的病毒為佐治亞甘薯曲葉病毒和甘薯曲葉病毒；在微甘菊中檢測到TYLCV；從三裂葉薯中檢測到SPLCV；軟枝黃蟬中鑒定到黃蟬曲葉病毒；勝紅薊中檢測到勝紅薊黃脈病毒；稀薟中檢測到稀薟黃脈病毒（Sieg-e.sbeckiae yellow veln virus，SbYVV）；賽葵中檢測到廣東賽葵曲葉病毒；苧麻中檢測到苧麻花葉病毒（ramie mosaic vlrus，RaMoV）；黃花捻中檢測到越南；霧水葛中鑒定出廣東霧水葛花葉病毒（Pouzolzia mosalc Guangdong virus，PouMGDV）；十萼茄中鑒定出十萼茄黃花葉病毒（Lyciant.hes yellow mosalc vlrus，LyYMV）；三裂葉野葛中檢測到野葛花葉病毒（kudzu mosaic vlrus，KuMV）；鱧腸中檢測到蓮子草黃脈病毒（Alternan-thera yellow veln vlrus，AIYVV）；構(gòu)樹中檢測到中國大青金色花葉病毒（Clerode-ndrurn golden mosaicChina vlrus，CIGMCNV）。

2.3 21種煙粉虱傳雙生病毒在廣東省的分布

21種病毒在廣東省分布不同，不同市檢測到的病毒種類不同（表3）。其中來自廣州市病樣中檢測到病毒種類最多，有TYLCGdV、ToLCGdV、ToLCTV等14種；其次從湛江病樣中檢測到5種病毒；隨后從佛山、肇慶和河源病樣中分別檢測到4種病毒；從梅州病樣中分別檢測到3種病毒；從汕頭、茂名、惠州和韶關(guān)病樣中分別檢測到2種病毒；江門、清遠、陽江、潮州病樣中均僅檢測到1種病毒。

21種病毒中，CLCuMuV分布最廣，在廣州、肇慶、佛山、湛江、茂名、河源、江門、清遠、陽江、潮州、韶關(guān)11市中均有分布；TYLCV在佛山、廣州、肇慶、湛江、茂名、河源6市有分布；在汕頭、廣州、佛山、梅州、惠州5市有分布；SLCCNV在廣州、湛江、佛山、河源、惠州5市有分布；SPLCV在廣州、梅州和湛江3市有分布；MLCuGdV在廣州和肇慶有分布；其他15種病毒均在一個市檢測到。

2.4幾種重要的煙粉虱傳雙生病毒在廣東的擴散動態(tài)

監(jiān)測結(jié)果顯示，危害番茄的5種不同病毒在廣東省擴散動態(tài)變化不同。TYLCGdV和ToLCGdV于2005年首次在廣州市被發(fā)現(xiàn)，直到2021年尚未在其他市檢測到，表明該2種病毒在省內(nèi)尚未發(fā)生擴散。ToLCTV于2005年首次在汕頭市被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)在廣州（2011年）、佛山（2012年）、梅州（2012年）檢測到，可見2005年-2011年期間，該病毒在廣東省內(nèi)仍局部分布。TYLCV于2011年首次在佛山市被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)在肇慶（2013年）、廣州（2019年）、茂名（2019年）、湛江（2020年）、河源（2020年）均檢測到，說明該病毒在廣東省擴散較快。2020年，首次在汕頭市檢測到TYLCTHV，目前還未在其他市檢測到該病毒。危害瓜類蔬菜的SLCCNV已在廣東省內(nèi)擴散蔓延。SLCCNV于2011年首次在廣州市被發(fā)現(xiàn)，2019年在湛江、佛山、河源三市均檢測到，可見該病毒在廣東省分布范圍越來越廣。危害錦葵科植物的CLCuMuV在廣東省分布廣、擴散快。2006年首次在廣州檢測到，隨后在佛山（2011年）、肇慶（2011年）、江門（2011年）、茂名（2013年）、湛江（2013年）、陽江（2013年）、河源（2013年）、韶關(guān)（2020年）、清遠（2021年）、潮州（2021年）多市被檢測到，該病毒幾乎遍及全省朱槿種植區(qū)。

3結(jié)論與討論

煙粉虱傳雙生病毒侵染所致病害是世界上多種重要作物上的毀滅性病害，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。廣東地處熱帶、亞熱帶，植物和煙粉虱均可周年生長、繁殖，煙粉虱傳雙生病毒病發(fā)生重，也是我國最早報道有該類病害發(fā)生的省份。本課題組自2003年首次發(fā)現(xiàn)和報道廣東番茄上有煙粉虱傳雙生病毒病的發(fā)生和危害以來，對該病害在全省的發(fā)生和危害進行了長期監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在廣州、湛江、惠州等14市均有煙粉虱傳雙生病毒病的發(fā)生，危害的寄主植物有番茄、南瓜、甘薯等24種，其中以番茄黃化曲葉病和朱槿曲葉病發(fā)生和危害最為嚴重?？梢?，煙粉虱傳雙生病毒在廣東分布廣泛、侵染寄主種類多、危害重。

煙粉虱傳雙生病毒種類眾多，目前國際上已報道的病毒多達445種。本研究從廣東省14市采集的病樣中鑒定出煙粉虱傳雙生病毒有21種，分別為TYL-CGdV、ToLCGdV、ToLCTV、TYLCV、TYLCTHV、CLCuMuV、SLCCNV、SPLCGV、SPLCV、AIILCV、AYVV、SbYVV、MI_CuGdV、RaMoV、SiYVVV、SiYMCNV、PouMGDV、LyYMV、KuMV、AIYVV、CIGMCNV，其中發(fā)現(xiàn)且已被國際病毒分類委員會批準的病毒新種有TYLCGdV、ToLCGdV、AllLCV、PouMGDVL、LyYMV5種。同時，還發(fā)現(xiàn)該類病毒新寄主3種，分別為：垂花懸鈴花是CLCuMuV的新寄主，微甘菊是TYLCV的新寄主，三裂葉薯是SPLCV的新寄主。由此可見，廣東煙粉虱傳雙生病毒較國內(nèi)其他地區(qū)復(fù)雜。

危害不同作物的病毒種類不同。從廣東番茄病樣中鑒定出的有TYLCGdV、ToLCGdV、ToLCTV、TYLCV和TYLCTHV 5種。該5種病毒均是從番茄植株中被鑒定發(fā)現(xiàn)的病毒種，其中TYLCGdV和ToLCGdV是從廣東番茄樣品中被發(fā)現(xiàn)的病毒新種，目前僅在廣東省內(nèi)有發(fā)生；ToLCTV是從中國臺灣番茄樣品中鑒定到的新種，2007年首次在廣東汕頭被檢測到，隨后在廣東多地暴發(fā)流行，2010年在浙江溫州地區(qū)被檢測到，在我國其他省份尚未發(fā)現(xiàn)。TYLCV最早發(fā)現(xiàn)于以色列，此后迅速擴散，是引起全球番茄黃化曲葉病的主要病原之一。國內(nèi)最早于2006年在上海番茄上檢測到，隨后在全國范圍暴發(fā)流行。2011年首次在廣東省佛山市的番茄產(chǎn)區(qū)檢測到TYLCV，目前在全省多個番茄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生和危害。TYLCTHV最早發(fā)現(xiàn)于泰國，隨后在臺灣、云南番茄上檢測到。2020年，首次在廣東汕頭番茄上檢測到該病毒，目前正在全省范圍內(nèi)擴散和蔓廷。監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，危害廣東番茄的煙粉虱傳雙生病毒種類階段性演替明顯，2003年-2010年以TYLCGdV和ToLCGdV為主；2011年-2019年ToLCTV為優(yōu)勢種；2019年至今TYLCV是優(yōu)勢種；同時發(fā)現(xiàn)，2020年首次檢測到的TYLCTHV正在全省范圍蔓延。至于病毒種類演替的原因，初步推測由栽培品種、傳播介體、栽培模式、氣候環(huán)境等多方面因素綜合作用所導(dǎo)致。持續(xù)開展病毒種類系統(tǒng)調(diào)查與監(jiān)測，及時了解病毒種類的動態(tài)變化，對于持續(xù)有效地防控番茄黃化曲葉病危害具有重要意義。

從南瓜、葫蘆、白瓜、冬瓜病樣中鑒定出的病毒為SLCCNV。SLCCNV是從廣西南寧南瓜曲葉病樣中發(fā)現(xiàn)的一個新種，煙粉虱在我國的大范圍發(fā)生和擴散，也導(dǎo)致SLCCNV在我國廣西、河南、海南等地葫蘆科作物上流行。2011年首次在廣東省廣州市的南瓜上檢測到SLCCNV；2019年在湛江市、惠州市、河源市和佛山市南瓜、惠州市葫蘆和冬瓜、佛山市白瓜上均檢測到?？梢姡摬《疽言趶V東省內(nèi)擴散，初步分析其可能通過帶毒煙粉虱在省內(nèi)傳播擴散。

從朱槿、黃秋葵、垂花懸鈴花曲葉病病樣等鑒定出的病毒均為CLCuMuV。該病毒最早發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦木爾坦地區(qū)。2006年，本團隊首次在廣州朱槿上檢測到該病毒，這也是該病毒入侵中國的首次報道。目前該病毒已擴散到廣東多個地級市以及廣西、海南、云南、福建、江蘇、新疆等多個?。ㄗ灾螀^(qū)）。該病毒基因組序列分析顯示，所獲得的CLCu-MuV中國分離物的基因組序列相似性在98%以上，說明入侵我國并已擴散的CLCuMuV基因組序列分子變異較小，種群遺傳穩(wěn)定；其中，78% CLCu-MuV中國分離物來自寄主朱槿。由此初步推測，該病毒可能通過帶毒植株調(diào)運在國內(nèi)傳播擴散。

雜草因其分布廣泛、生存能力強，是煙粉虱傳雙生病毒重要的原始寄主或中間寄主，在該類病毒的侵染循環(huán)和暴發(fā)流行中具有重要作用。本研究從各類雜草中鑒定到14種病毒，且多種病毒已報道可以侵染農(nóng)作物造成經(jīng)濟損失。如勝紅薊上檢測到的AYVV和微甘菊上檢測到的TYLCV均可侵染番茄引起黃化曲葉??；三裂葉薯上檢測到的SPL-CV可侵染甘薯引起曲葉病。因此，在煙粉虱傳雙生病毒病的防控中應(yīng)及時清除田間及周邊雜草，減少病毒初侵染源。

煙粉虱傳雙生病毒是一類重要的病原物，已給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失。本研究明確廣東煙粉虱傳雙生病毒分布廣、種類多，且病毒種類發(fā)生動態(tài)變化。廣東省獨特的氣候條件和地理位置以及作物栽培模式等均有利于煙粉虱傳雙生病毒病的發(fā)生和流行，因此，亟須持續(xù)對病害及病毒種類進行監(jiān)測，及時了解生產(chǎn)中病毒種群發(fā)生動態(tài)，為農(nóng)作物病害尤其是煙粉虱傳雙生病毒病的防控提供科學(xué)依據(jù)。