關(guān)鍵詞番茄花葉病毒；RPA;CRISPR/Cas12a;可視化檢測(cè)

番茄花葉病毒屬于植物桿狀病毒科Virgaviridae煙草花葉病毒屬Tobarnovirus，基因組分別編碼外殼蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、與復(fù)制相關(guān)的126kD蛋白和183kD蛋白。ToMV在全世界均有分布，主要危害番茄和辣椒，易侵染多數(shù)茄科植物，嚴(yán)重影響果實(shí)的品質(zhì)和產(chǎn)量。ToMV可以通過嫁接、植株間互相接觸、機(jī)械接種傳播，也可以通過種子傳毒。被ToMV侵染的葉片出現(xiàn)花葉癥狀，有時(shí)還會(huì)導(dǎo)致葉片變形，植株矮縮，甚至死亡；果實(shí)會(huì)出現(xiàn)著色不均或凹陷的褐色病斑。

目前檢測(cè)TolVIV的方法主要有雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（double antibody sandwich assay，DAS-ELISA）、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、膠體金免疫層析測(cè)定、RT-PCR、實(shí)時(shí)定量RT-PCR等。但是這些方法在實(shí)現(xiàn)快速和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)TolVIV方面存在一些局限性。目前使用的大多數(shù)檢測(cè)方法很耗時(shí)，而且需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技術(shù)知識(shí)，限制了在實(shí)驗(yàn)室之外的診斷應(yīng)用。因此，有必要建立一種快速、靈敏、可視化的ToMV現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymer-ase amplification，RPA）是一種在恒定溫度（37～42℃）啟動(dòng)DNA指數(shù)級(jí)擴(kuò)增的檢測(cè)技術(shù)。由于該技術(shù)反應(yīng)速度快、靈敏、不需要昂貴的儀器，已被廣泛應(yīng)用于多種植物病原物的檢測(cè)。CRISPR/Cas系統(tǒng)由簇狀規(guī)則間隔短鏈重復(fù)序列（clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats， CRISPR）及相關(guān)蛋白12a（CRISPR-associated12a，Cas12a）組成，存在于許多細(xì)菌和古細(xì)菌的先天免疫系統(tǒng)中。在該系統(tǒng)中，Cas蛋白與入侵病毒DNA序列互補(bǔ)的CRISPR RNA（crRNA）形成一個(gè)核糖核蛋白（ribo-nucleoprotein，RNP）復(fù)合物，來靶向特定的病毒序列。雖然該系統(tǒng)主要用于基因編輯，但最近有研究表明，一些Cas蛋白可用于檢測(cè)特定的核酸序列，例如，Cas12a在與其DNA底物特異性相互作用后獲得了非特異性的單鏈DNase活性。前人利用這一特性應(yīng)用Cas12a作為生物傳感器：除了Cas12a及其crRNA的RNP復(fù)合物外，還添加了一個(gè)熒光報(bào)告基因（FQ）標(biāo)記的單鏈DNA底物。在Cas12a激活后，它非特異性地降解單鏈DNA，釋放熒光基團(tuán)，產(chǎn)生熒光信號(hào)。該方法已被用于檢測(cè)人乳頭瘤病毒（human papillomavlrus，HPV）和新型冠狀病毒（corona virus disease 2019，COVID-19），表明該方法在病毒診斷方面具有巨大潛力。近年來，CRISPR/Cas12a被應(yīng)用于植物RNA病毒和DNA病毒的檢測(cè)，證明其在植物病毒病的檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用潛力。

1材料與方法

1.1材料

本研究中所用的帶病毒材料包括：ToMV、南芥菜花葉病毒（arabis mosalc vlrus，ArMV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosalc vlrus，CMV）、辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）、番茄褐色皺紋果病毒（tomato brown rugose fruit virus，To-BRFV）、番茄斑駁花葉病毒（tomato mottle mosalcvirus，ToMMV）、番茄環(huán)斑病毒（tomato ringspotvirus，ToRSV）、煙草環(huán)斑病毒（tobacco ring spot vi-rus，TRSV）、煙草花葉病毒（tobacco mosalc virus，TMV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWV）侵染的辣椒或番茄的葉片或種子樣品均由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院保存。

1.2方法

1.2.1總RNA提取

稱取1000粒健康或帶病毒的番茄或辣椒種子在干磨機(jī)中打碎至粉末狀，按質(zhì)量體積比1：2比例加入1XPBS緩沖液充分混合放置45min，取1mL上清液備用；取健康或帶病毒的番茄或辣椒葉片在液氮中充分研磨，稱取0.1g備用；按照植物總RNA提取試劑盒（DP432，天根生化科技有限公司）說明書提取RNA，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2RPA引物、crRNA及熒光報(bào)告基因FQ設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI中ToMV外殼蛋白對(duì)應(yīng)基因序列，進(jìn)行序列比對(duì)分析并設(shè)計(jì)引物，使用NCBI中Prim-er-BLAST （https：∥www. ncbi. nlm. nih. gov/tools/primer-blast/）對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證；使用在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站CRISPR進(jìn)行crRNA設(shè)計(jì)（表1），crRNA、熒光報(bào)告基因FQ序列和引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.3RPA檢測(cè)方法

本研究按照RPA恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒（WI。RB-8207KIT，安普未來生物科技有限公司）進(jìn)行RPA反應(yīng)，擴(kuò)增體系為50uL，每個(gè)反應(yīng)管中加入待測(cè)樣品RNA模板，混合均勻后在42℃反應(yīng)15min。反應(yīng)結(jié)束后純化擴(kuò)增產(chǎn)物：加入等體積的Tris飽和酚／氯仿／異戊醇（25：24：1）抽提液，混勻，12000r/min離心5min。取上清進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.2.4CRISPR/Cas12a等溫快速可視化檢測(cè)方法

本研究采用的CRISPR/Cas12a反應(yīng)擴(kuò)增體系為、熒光報(bào)告基因FQ（10umol/Lgt;0.8uL、將上述溶液加到反應(yīng)管中充分混合后，加入2uL純化好的RPA反應(yīng)產(chǎn)物，再次充分混勻，離心，37℃反應(yīng)15min。反應(yīng)結(jié)束后在藍(lán)光（440～460nm）下觀察，當(dāng)溶液發(fā)出綠色熒光時(shí)，判定待測(cè)樣品為ToMV陽性。

1.2.5CRISPR/Cas12a等溫快速可視化檢測(cè)體系優(yōu)化

對(duì)熒光報(bào)告基因FQ終濃度進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，將其終濃度依次設(shè)置為100、200、300、400、600、800 nmol/L，其他試驗(yàn)條件保持不變；對(duì)Cas12a/crRNA濃度比例進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，將其濃度比例分別設(shè)置為2：1、1：1、1：2、1：5、1：10，其他試驗(yàn)條件保持不變；在優(yōu)化好熒光報(bào)告基因FQ終濃度和Cas12a/crRNA濃度比例的基礎(chǔ)上，確定最終濃度，將Cas12a/crRNA最終濃度分別設(shè)置。

1.2.6特異性分析

提取辣椒和番茄上常見的ArMV、CMV、PM-MoV、ToBRFV、ToMMV、ToRSV、TRSV、TMV、TSWV樣品總RNA作為模板，使用建立的基于RPA-CRISPR/Cas的等溫快速可視化檢測(cè)體系對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，以驗(yàn)證該檢測(cè)體系是否與其他病毒有交叉反應(yīng)。

1.2.7靈敏度分析

參照《番茄花葉病毒檢疫鑒定方法》（GB/T36771-2018）[33設(shè)計(jì)RT-PCR引物，引物序列為：RT-ToMV-F（5'-CGAGAGGGGCAAcjAAACAT-3'），RT-ToMV-R（5'-ACCTGTCTCCATC'FCTTTGG-3'）；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為318 bp。參照全式金TransScriptII One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒配制2040s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。

1.2.8樣品檢測(cè)

收集10份辣椒和番茄的葉片或種子樣品提取總RNA（表2），使用建立的RPA-CRISPR/Cas12a體系進(jìn)行ToMV的檢測(cè)，并與RT-PCR檢測(cè)方法比較，分析檢測(cè)準(zhǔn)確率。

2結(jié)果與分析

2.1可視化反應(yīng)體系優(yōu)化

為建立最適的RPA-CRISPR/Cas12 a反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光報(bào)告基因FQ終濃度優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果如圖1a所示，當(dāng)熒光報(bào)告基因FQ終濃度達(dá)到400 nmol/L時(shí)，離心管中綠色熒光強(qiáng)度達(dá)到最亮，繼續(xù)增加濃度時(shí)亮度不再增加，因此選擇400 nmol/L為熒光報(bào)告基因FQ終濃度。

2.2檢測(cè)體系的特異性分析

為了評(píng)估RPA-CRISPR/Cas12檢測(cè)體系的特異性，根據(jù)優(yōu)化好的RPA-CRISPR/Cas12 a反應(yīng)體系對(duì)分別攜帶ArMV、CMV、PMMoV、ToBRFV、ToM[MV、ToRSV、TRSV、TMV、TSWV的樣品進(jìn)行檢測(cè)，以ddH2O為陰性對(duì)照（NC）。結(jié)果顯示，攜帶ToMV病毒的樣品檢測(cè)為陽性，帶有其他9種病毒的樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性（圖2）。

2.3檢測(cè)體系的靈敏度測(cè)定

以攜帶ToMV的番茄樣品總RNA為模板，RPA-CRISPR/Cas12a反應(yīng)能檢測(cè)到的極限為172ag/uL（圖3a），RPA反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度為1. 72fg/uL（圖3b），而普通RT-PCR的檢測(cè)靈敏度為1. 72pg/uL（圖3c），在此條件下，建立的RPA-CRISPR/Cas12a檢測(cè)的靈敏度顯著高于普通RT-PCR，是普通RT-PCR的10000倍。

2.4辣椒和番茄樣品的檢測(cè)

使用建立的RPA-CRISPR/Cas12a體系進(jìn)行ToMV的檢測(cè)，以ddH70為陰性對(duì)照（NC），攜帶ToMV的番茄樣品總RNA為陽性對(duì)照（P）。結(jié)果顯示，總共在3份樣品中檢出ToMV（圖4a），RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與RPA-CRISPR/Cas12a檢測(cè)結(jié)果一致（圖4b）。

3結(jié)論與討論

ToMV主要危害番茄、辣椒及多數(shù)茄科植物，在世界各地廣泛分布?？焖?、準(zhǔn)確地檢測(cè)該病毒有助于預(yù)防其進(jìn)一步傳播，然而，現(xiàn)有的ToMV診斷方法只能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。本研究開發(fā)了一種快速、特異、靈敏的RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù)的ToMV可視化檢測(cè)方法。在RPA-CRISPR/Cas12a檢測(cè)體系中加入熒光報(bào)告基因FQ（FAM-CCG-GAAAAAAAAAAAACCGG-BHQI），如果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列，熒光報(bào)告基因被切割出FAM基團(tuán)，可在藍(lán)光（440～460nm）下直接觀察到綠色熒光信號(hào)，增加了該方法的便攜性。因此，該方法具有在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中使用的潛力。

本研究構(gòu)建的RPA-CRISPR/Cas12a體系的靈敏度是RPA反應(yīng)的10倍，是RT-PCR的10000倍，顯著高于傳統(tǒng)的RT-PCR，RPA與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)相結(jié)合，能夠獲得比RPA反應(yīng)靈敏度更高的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)環(huán)境要求低，操作簡(jiǎn)單，不需要PCR儀和瓊脂糖凝膠電泳，可以實(shí)現(xiàn)在田間、口岸等現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。但是通常檢測(cè)靈敏度越高的技術(shù)，在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)生污染的可能性越大，因此可以優(yōu)先選用帶有濾芯的滅菌移液器槍頭和單獨(dú)開蓋的離心管進(jìn)行試驗(yàn)。后續(xù)可以考慮在同一個(gè)離心管中進(jìn)行RPA反應(yīng)和CRISPR/Cas12a可視化反應(yīng)，減少中途開蓋操作，降低污染的可能。

本研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a檢測(cè)方法只需反應(yīng)30min，利用便攜式恒溫金屬浴和充電式藍(lán)光燈，即可快速檢測(cè)ToMV，可用于田間和口岸檢疫等，為我國番茄花葉病毒的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)和田間診斷等提供了更為便捷的技術(shù)手段，具有廣泛的應(yīng)用前景，對(duì)我國番茄花葉病毒的防控具有重要意義。