關(guān)鍵詞棉鈴蟲(chóng)；蘇云金芽胞桿菌；免疫致敏；抗性；抗菌肽；脂肪體

近年來(lái)棉鈴蟲(chóng)暴發(fā)為害嚴(yán)重阻礙了甘肅河西地區(qū)玉米制種產(chǎn)業(yè)的良好發(fā)展。為治理此害蟲(chóng)，蘇云金芽胞桿菌作為一種友好型生物農(nóng)藥在田間被廣泛推廣，但同化學(xué)殺蟲(chóng)劑一樣，隨著長(zhǎng)期大規(guī)模使用，抗性問(wèn)題逐漸凸顯，現(xiàn)在已成為影響B(tài)t轉(zhuǎn)基因作物和Bt殺蟲(chóng)劑可持續(xù)利用的主要因素。為了治理害蟲(chóng)對(duì)Bt的抗性，學(xué)者從適合度代價(jià)、分子機(jī)理和內(nèi)環(huán)境免疫等多方面進(jìn)行了探索，其中體液免疫和細(xì)胞免疫是昆蟲(chóng)清除體內(nèi)病原物和防止致病或致死性微生物侵染的重要屏障，而在昆蟲(chóng)的免疫系統(tǒng)中，抗菌肽發(fā)揮了主要的抑菌活性。例如用一種非致病性大腸桿菌Escherichia coli誘導(dǎo)煙草天蛾Manduca seZta幼蟲(chóng)抗菌肽表達(dá)，能夠降低其感染毒性發(fā)光桿菌后的死亡率。經(jīng)金黃色葡萄球菌、粉虱座殼孢、枯草芽胞桿菌等多種菌源誘導(dǎo)的黃粉蟲(chóng)抗菌肽提取物對(duì)昆蟲(chóng)病原菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌Escherichia coli均有抑菌作用。由此可見(jiàn)，抗菌肽表達(dá)是害蟲(chóng)對(duì)生物殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的重要途徑。

截至目前，在植物和動(dòng)物中已有超過(guò)1200多種抗菌肽被相繼發(fā)現(xiàn)，其中昆蟲(chóng)抗菌肽超過(guò)200種，主要包括天蠶素、防御素、攻擊素、雙翅肽、葛佬素和溶菌酶等。對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)分析表明，幼蟲(chóng)期抗菌肽在消化道、血淋巴和脂肪體中相對(duì)表達(dá)量較高，且不易被胰蛋白酶和胃蛋白酶水解。另有研究表明，不同抗菌肽針對(duì)的病原微生物不同，但天蠶素抗菌肽具有相對(duì)較廣的抑菌范圍，不僅對(duì)黏質(zhì)沙雷氏菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌等病原細(xì)菌具有很強(qiáng)的抑制作用，而且對(duì)蟬擬青霉和白色念珠菌等病原真菌也有拮抗作用。因此天蠶素抗菌肽常被添加到動(dòng)物飼料中來(lái)防治微生物侵染引起的疾病，天蠶素抗菌肽主要存在于鱗翅目和部分雙翅目昆蟲(chóng)中，為一類小分子肽，由31～39個(gè)氨基酸殘基組成，等電點(diǎn)為9.52～11.17，100℃下暴露10～15mln仍可保持抑菌活性，其“螺旋一卷曲一螺旋”的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)能夠保持較高抗菌活性，而酰胺化的C端則對(duì)其廣譜作用極為重要。天蠶素抗菌肽并不是通過(guò)直接的毒理方式殺滅病原微生物，而是通過(guò)與細(xì)胞膜結(jié)合形成具有活性的功能結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變質(zhì)膜通透性，使病原菌滲透壓失衡而消亡。天蠶素抗菌肽在宿主防御中除了能殺死病原菌，還可阻斷由脂多糖等細(xì)菌組分誘導(dǎo)的基因表達(dá)，從而表現(xiàn)出抗菌和抗內(nèi)毒素的雙重性質(zhì)，這對(duì)害蟲(chóng)形成Bt抗性具有促進(jìn)作用。

綜上所述，免疫系統(tǒng)表達(dá)的抗菌肽能夠抵御多種病原菌的侵染，尤其天蠶素抗菌肽是昆蟲(chóng)抵御外源生物侵害的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，與害蟲(chóng)對(duì)生物農(nóng)藥的抗性密切相關(guān)。因此研究Bt對(duì)棉鈴蟲(chóng)天蠶素抗菌肽基因（HacD）轉(zhuǎn)錄的影響有助于進(jìn)一步理解棉鈴蟲(chóng)對(duì)Bt的抗性發(fā)展機(jī)制，對(duì)害蟲(chóng)抗藥性治理、降低農(nóng)藥用量等方面均具有重要借鑒意義。

1材料與方法

1.1試蟲(chóng)和Bt菌株來(lái)源

棉鈴蟲(chóng)采自甘肅省武威市黃羊鎮(zhèn)（37°41'N，102°56'E），帶回室內(nèi)在溫度（27±1）℃，相對(duì)濕度（75±1）%，光周期L∥D=16h∥8h條件下用人工飼料飼養(yǎng)，繁殖3代以上，形成穩(wěn)定種群備用。

Bt菌株由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，在LB培養(yǎng)液中37℃，240r/min振蕩培養(yǎng)24h，10000g離心10min，去上清液后收集菌體，后用PBS沖洗2次稱重備用。

1.2Bt誘導(dǎo)飼料制備

飼料配方參照梁革梅等的人工飼料配方4。在配制過(guò)程中，每1000mL人工飼料加50mgBt菌，使飼料中的菌濃度為0.05mg/mL。在加入Bt時(shí)需要進(jìn)行重懸浮處理，所用100mL蒸餾水從飼料配方中分取，待飼料溫度降至約40℃時(shí)加入，迅速攪拌均勻后倒出冷卻定型，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1短期Bt誘導(dǎo)

將備用的Bt誘導(dǎo)飼料切成1cm3的小塊，分裝在滅菌的24孔板中。用潤(rùn)濕的小毛筆挑取活躍且大小一致的棉鈴蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)，輕放在分裝的飼料上，每塊飼料接入1頭幼蟲(chóng)，完成后在24孔板上蓋一層95%乙醇滅菌的吹塑紙，后蓋上蓋子防止幼蟲(chóng)逃逸。最后將處理的試蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至人工智能培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件同1.1。Bt誘導(dǎo)處理每3板（24頭）試蟲(chóng)為1組重復(fù)，每處理設(shè)3組重復(fù)，同時(shí)設(shè)1組未添加Bt活菌的常規(guī)飼料作對(duì)照。

1.3.2持續(xù)Bt誘導(dǎo)

Bt誘導(dǎo)接蟲(chóng)方法和飼養(yǎng)條件同1.3.1。接蟲(chóng)時(shí)選取活躍且大小一致的初孵幼蟲(chóng)接人，每3d更換新的Bt誘導(dǎo)飼料，直至幼蟲(chóng)發(fā)育至5齡。Bt誘導(dǎo)處理每3板試蟲(chóng)為1組重復(fù)，每處理設(shè)3組重復(fù)，同時(shí)設(shè)1組未添加Bt活菌的常規(guī)飼料作對(duì)照。對(duì)照組幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育快，會(huì)較早發(fā)育至5齡，因此先提取對(duì)照組RNA，并在-80℃下保存待測(cè)。

1.3.3傳代培養(yǎng)

待持續(xù)Bt誘導(dǎo)且存活的老熟幼蟲(chóng)化蛹后，收集蛹并轉(zhuǎn)移至羽化盒中，10～14d時(shí)觀察羽化情況，并將羽化的成蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至產(chǎn)卵籠中，飼以30%蜂蜜水，促其產(chǎn)卵；后將卵在溫度（27±1）℃，相對(duì)濕度（75±1）%，光周期L∥D=16h∥8h條件下孵化，初孵幼蟲(chóng)飼以常規(guī)人工飼料，直至幼蟲(chóng)化蛹并再次羽化，飼養(yǎng)條件同1.1。Bt誘導(dǎo)處理每3板試蟲(chóng)為1組重復(fù)，每處理設(shè)3組重復(fù)，同時(shí)設(shè)1組未添加Bt活菌的常規(guī)飼料作對(duì)照。

1.3.4樣本采集

棉鈴蟲(chóng)天蠶素抗菌肽基因（HacD）在幼蟲(chóng)整體的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平、Bt誘導(dǎo)下不同組織中HacD的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平、HacD cDNA序列測(cè)定均在Bt短期誘導(dǎo)24h時(shí)采集3齡幼蟲(chóng)進(jìn)行試驗(yàn)。HacD隨Bt誘導(dǎo)時(shí)間的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平在3齡幼蟲(chóng)短期誘導(dǎo)0h時(shí)即開(kāi)始采集幼蟲(chóng)，后每隔6h采集1次，直至48h結(jié)束；Bt誘導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)不同階段HacD相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平根據(jù)發(fā)育時(shí)期采集樣本，直至F1代成蟲(chóng)。以上不同時(shí)間、不同組織及F1代的轉(zhuǎn)錄水平均以未添加Bt的常規(guī)飼料處理為對(duì)照，不同處理組每重復(fù)采集6頭幼蟲(chóng)，每處理共采集18頭幼蟲(chóng)。

1.3.5樣本組織收集

血淋巴收集：將試蟲(chóng)放置在冰塊上，待其活動(dòng)敏捷度降低或不動(dòng)時(shí)，用滅菌的昆蟲(chóng)針將其臀足刺破，輕輕擠壓蟲(chóng)體，使血淋巴溢出，并迅速轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管內(nèi)，液氮中保存。

中腸收集：將收集完血淋巴的試蟲(chóng)用滅菌的小剪刀從頸部刺入，向臀足方向剪開(kāi)表皮，暴露出中腸，用鑷子取下中腸，在4℃預(yù)冷的4% NaCI溶液中用昆蟲(chóng)針將中腸剖開(kāi)，洗去內(nèi)含物，再用預(yù)冷的蒸餾水沖洗，后轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管內(nèi)，于液氮中保存。

脂肪體收集：將收集完中腸的試蟲(chóng)用滅菌的鑷子刮取附著在表皮上的脂肪體，用濾紙吸去脂肪體上殘留的淋巴液，后轉(zhuǎn)移至滅菌的離心管內(nèi)，液氮中保存。

1.3.6樣本RNA提取、cDNA合成和目的基因擴(kuò)增

采用RNAprep Pure動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（Tiangen，DP431）提取樣品總RNA，采用FastKing -步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒（Tiangen，KR118-02）合成cDNA。根據(jù)HacD cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：EU041763.1）在NCBI（https：∥www.ncbi.nlm.nih. gov/）上設(shè)計(jì)擴(kuò)增HacD全長(zhǎng)的特異性引物（表1）。PCR總體積50uL，包括100umol/L的上下游引物各1uL，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35次；72℃延伸10min。HacD全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后送通用生物（安徽）股份有限公司（http：∥WWW.generalbiol. com/）測(cè)序。

1.3.7HacD轉(zhuǎn)錄分析

根據(jù)HacD cDNA序列（GenBank登錄號(hào)：EU041763）在NCBI（https：∥www. ncbi. nlm. nih.gov/）上設(shè)計(jì)RT-qPCR特異性引物（表1），以Actin為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR分析。反應(yīng)體系總體積25uL，包括100umol/L上、下游引物各1uL，SuperReal PreMix（SYBR Green） 12.5uL，模板cDNA 1uL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s；95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸30s，循環(huán)40次。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平計(jì)算采用2 -△△法。采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用IBM SPSS Statistics25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。其中多重比較采用Duncan氏新復(fù)極差法，置信區(qū)間為95%;兩兩比對(duì)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，置信區(qū)間為95%。

2結(jié)果與分析

2.1HacD cDNA序列與蛋白質(zhì)翻譯

棉鈴蟲(chóng)HacD cDNA序列大小為189 bp，其中G、C、A、T含量分別為26.46%、21.69%、25.40%和26.46%，其肽鏈翻譯為MNSKIVLFLCVCLV-LVSTATAWDFFKELEGAGQRVRDAIISAGPAV-DVLTKAKGLYDSSEEKD，以具有疏水性的甲硫氨酸起始，以酸性天冬氨酸結(jié)束，共有63個(gè)氨基酸。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，該序列與棉鈴蟲(chóng)HacDcDNA序列（GenBank登錄號(hào)：EU041763.1）的匹配度為100%，表明所獲得的棉鈴蟲(chóng)HacD基因完整性良好，序列準(zhǔn)確可靠。

2.2Bt誘導(dǎo)下棉鈴蟲(chóng)HacD的轉(zhuǎn)錄情況

Bt短期誘導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)3齡幼蟲(chóng)24h后，其HacD轉(zhuǎn)錄整體呈上調(diào)趨勢(shì)（圖1），但在中腸、血淋巴和脂肪體中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平不同（圖2），其中以脂肪體HacD轉(zhuǎn)錄上調(diào)最為顯著，且相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最高，其次為血淋巴；中腸轉(zhuǎn)錄水平最低，與對(duì)照無(wú)顯著差異。

2.3不同組織中HacD隨誘導(dǎo)時(shí)間的轉(zhuǎn)錄特性

Bt短期誘導(dǎo)下，HacD在中腸、血淋巴和脂肪體中的轉(zhuǎn)錄規(guī)律不同（圖3），整體以脂肪體中HacD的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最高，在Bt誘導(dǎo)前期呈持續(xù)升高的上調(diào)趨勢(shì)，24h時(shí)達(dá)到最高值，隨后逐漸下降；血淋巴中HacD的轉(zhuǎn)錄規(guī)律與脂肪體相似，但相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最高值為誘導(dǎo)18h，且整體上調(diào)程度較脂肪體低。中腸HacD相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最低，幾乎不受Bt影響，誘導(dǎo)期間沒(méi)有出現(xiàn)明顯的上調(diào)或下調(diào)趨勢(shì)。

2.4Bt誘導(dǎo)下HacD在兩代間的轉(zhuǎn)錄特征

為了明確Bt誘導(dǎo)下HacD在兩代間的轉(zhuǎn)錄特征，利用Bt從Fo代開(kāi)始對(duì)棉鈴蟲(chóng)進(jìn)行持續(xù)誘導(dǎo)。結(jié)果顯示（圖4），F(xiàn)0代初孵幼蟲(chóng)、5齡幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)的HacD相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于對(duì)照組各蟲(chóng)態(tài)，尤其以5齡幼蟲(chóng)相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平最高。傳代培養(yǎng)至F1代時(shí)，初孵幼蟲(chóng)、5齡幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)的HacD相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平較F0代呈顯著下調(diào)趨勢(shì)。在F1代HacD轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)趨勢(shì)下，除5齡幼蟲(chóng)外，初孵幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)與對(duì)照組對(duì)應(yīng)蟲(chóng)態(tài)的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性差異，但各蟲(chóng)態(tài)仍然保持了高于對(duì)照組的表達(dá)特性。

3結(jié)論與討論

近年來(lái)，棉鈴蟲(chóng)對(duì)河西地區(qū)制種玉米和高產(chǎn)玉米的為害居高不下，為了防治該害蟲(chóng)，Bt制劑成為諸多綠色防控技術(shù)集成的核心內(nèi)容，盡管多種Bt殺蟲(chóng)蛋白已經(jīng)被挖掘，但基于應(yīng)用成本和當(dāng)前開(kāi)發(fā)程度的限制，菌劑仍然是當(dāng)前推廣的首選防治藥劑。隨著B(niǎo)t菌劑長(zhǎng)期使用，抗藥性發(fā)展問(wèn)題逐漸凸現(xiàn)，并且許多研究發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)也參與了Bt抗性形成的過(guò)程，因此本研究從棉鈴蟲(chóng)體液免疫出發(fā)，對(duì)其HacD基因誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在Bt誘導(dǎo)下，HacD基因轉(zhuǎn)錄整體呈上調(diào)趨勢(shì)，這與小菜蛾抗菌肽的表達(dá)特征相似。小菜蛾取食Bt殺蟲(chóng)蛋白之后，體內(nèi)抗菌肽含量顯著增高，并且生測(cè)結(jié)果顯示血淋巴富集液表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。昆蟲(chóng)抗菌肽主要在脂肪體、血淋巴和消化道中表達(dá)，本研中Bt誘導(dǎo)的HacD基因在脂肪體中轉(zhuǎn)錄上調(diào)最高，其次為血淋巴。脂肪體內(nèi)HacD基因在誘導(dǎo)24h時(shí)轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高，這與鄭志華等對(duì)小菜蛾抗菌肽調(diào)控表達(dá)的研究結(jié)果高度相似，但與牛麗洋的研究不同。后者的研究結(jié)果表明，Bt誘導(dǎo)的天蠶素轉(zhuǎn)錄上調(diào)在5h達(dá)到峰值，這種差異性可能與物種對(duì)Bt的敏感程度有關(guān)，也可能與經(jīng)消化道誘導(dǎo)和血淋巴微注射誘導(dǎo)的方式有關(guān)。

為了明確Bt誘導(dǎo)下棉鈴蟲(chóng)HacD基因在兩代間的轉(zhuǎn)錄特征，本研究利用Bt對(duì)其進(jìn)行了持續(xù)誘導(dǎo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然子代（F1）棉鈴蟲(chóng)初孵幼蟲(chóng)、5齡幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)的HacD轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)于母代（F0）出現(xiàn)顯著下調(diào)，但均較對(duì)照高，而且F1代5齡幼蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照，這種現(xiàn)象可能與誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄在兩代間的傳遞有關(guān)。對(duì)黃粉蟲(chóng)的適應(yīng)性免疫研究表明，給黃粉蟲(chóng)母代注射細(xì)菌脂多糖能夠增強(qiáng)后代血淋巴的抗菌肽活性，這有力地證明了適應(yīng)性免疫可遺傳的存在可能。通常認(rèn)為免疫特性在兩代間的傳遞主要涉及表觀修飾和卵黃原蛋白傳遞2個(gè)方面的機(jī)制。Eggert等利用雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)赤擬谷盜子代中只有獲得免疫的雄蟲(chóng)才能提升致病菌感染下的存活率，這表明對(duì)子代的免疫保護(hù)機(jī)制是通過(guò)精子傳遞的，而在這個(gè)過(guò)程中表觀修飾發(fā)揮著潛在作用，但是這種遺傳的論證目前還不充分。其次，大多數(shù)免疫特性的傳遞是從雌蟲(chóng)傳遞給子代的，雌蟲(chóng)除了傳遞遺傳信息外還將一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如卵黃原蛋白）傳遞給子代，這些物質(zhì)也能參與免疫效應(yīng)的傳遞。另外，Salmela等證實(shí)了卵黃原蛋白在合成到轉(zhuǎn)運(yùn)至卵巢的過(guò)程中可以與細(xì)菌或病原相關(guān)分子結(jié)合，并遺傳給下一代，從而實(shí)現(xiàn)昆蟲(chóng)免疫特性在世代間的傳遞。截至目前，盡管昆蟲(chóng)免疫響應(yīng)的傳遞已經(jīng)在多種昆蟲(chóng)中報(bào)道，但免疫的傳遞涉及生殖和免疫兩個(gè)生理系統(tǒng)的共同作用，相關(guān)效應(yīng)元件復(fù)雜且多樣化，導(dǎo)致系統(tǒng)免疫產(chǎn)生的抗性在親、子代傳遞的潛在機(jī)理仍然不清晰，多限于研究性推測(cè)，其中機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。