摘要：茶梗對(duì)茯茶發(fā)花的感官品質(zhì)產(chǎn)生明顯影響，為探究茯茶中發(fā)花茶梗的活性成分及作用靶點(diǎn)，通過(guò)純化的冠突曲霉菌LJSC.2006（GenBank accession number：MZ147020）對(duì)茶梗發(fā)花，以非靶向代謝組學(xué)（LC-MS/MS）、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，運(yùn)用分子對(duì)接驗(yàn)證?；谄钚《伺袆e分析（OPLS-DA）篩選獲得發(fā)花茶梗與原茶梗的非靶向代謝組學(xué)差異代謝產(chǎn)物295種，其中碳水化合物41種、有機(jī)酸37種、酚類(lèi)及其衍生物33種、萜類(lèi)化合物27種、胺類(lèi)26種、含氮雜環(huán)化合物24種、酯類(lèi)21種、糖苷類(lèi)19種、黃酮及其衍生物15種、氨基酸及其衍生物14種、類(lèi)固醇及其衍生物9種、生物堿9種、酚酸6種、香豆素及其衍生物6種、兒茶素及其衍生物1種和其他7種。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明，發(fā)花茶梗有16個(gè)潛在活性成分，作用于248個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)蛋白質(zhì)互作（PPI）篩選得到13個(gè)潛在核心靶點(diǎn)。根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果，初步預(yù)測(cè)香豆雌酚、高良姜素、木犀草素和藏紅花酸是發(fā)花茶梗的主要核心活性成分。EGFR、ESR1、SRC和PTGS2是發(fā)花茶梗作用的主要核心靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：冠突曲霉LJSC.2006；茶梗；非靶向代謝組學(xué)；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：S571.1；R972⁺.6 """""""""""文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A """""""""""文章編號(hào)：1000-369X（2024）04-665-18

Prediction"and Analysis of Active Components"in"Tea Stem Fermented Product Based on Network"Pharmacology

HE Haotian¹， XIAO Juanjuan¹， TANG Yiyu¹， LUO Mi¹，"LIU Zhonghua^{1，2，3，4*}， YU Lijun^{1，2，3，4*}

1. Key Lab of Education Ministry of Hunan Agricultural University for Tea Science，"Changsha 410128， China; 2. National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Changsha 410128， China; 3. Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Changsha 410128， China; 4. Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Gene Resources of Horticultural Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China，Changsha 410128， China

Abstract："Tea stem has"a significant impact on the sensory quality for"Fucha fermentation product. To explore the active ingredients"and"targets of tea stems"in Fucha， Aspergillus cristatus"LJSC.2006"（GenBank accession number： MZ147020）"was used to ferment tea stem and obtain the end products."Non-targeted metabolomics （LC-MS/MS），"network pharmacology， and molecular docking"were used to verify the experimental results. Based on partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA）， 295"kinds"of non-targeted metabolites with differential expression between the fermented"tea stem"and raw tea stem"were identified， including 41 carbohydrates， 37 organic acids， 33 phenols and derivatives， 27 terpenoids， 26 amines， 24 nitrogen-containing heterocyclic compounds， 21 esters， 19 glyeosides， 15 flavonoids and derivatives， 14 amino acids and derivatives， 9 steroids and derivatives， 9 alkaloids， 6 phenolic acids， 6 coumarins and derivatives， 1 catechin and derivatives and 7 others. The network pharmacological analysis show that there were 16 potential active ingredients"acting on 248"targets， and 13 potential central"targets were obtained through Protein-Protein"Interaction （PPI） screening."According to the results of molecular docking， coumestrol， galangin， luteolin and crocetin were the main central"active ingredients."EGFR， ESR1， SRC and"PTGS2"were the main"targets of tea stem"fermented by Aspergillus cristatus.

Keywords："Aspergillus cristatus"LJSC.2006， tea stem， non-targeted metabolomics， network pharmacology

茯磚茶通過(guò)冠突曲霉菌^[1]對(duì)茶葉基質(zhì)的內(nèi)含成分進(jìn)行發(fā)花轉(zhuǎn)化，使得其具有調(diào)節(jié)腸道菌群^[2]、降脂減肥^[3]、調(diào)節(jié)免疫^[4]等功效。相關(guān)研究表明，茶樹(shù)不同部位的嫩莖內(nèi)含成分比幼嫩芽葉更為豐富^[5-6]，且春季新梢茶梗的氨基酸大量積累^[7]，可為茯磚茶發(fā)花期間的品質(zhì)轉(zhuǎn)化提供物質(zhì)條件。由傳統(tǒng)加工經(jīng)驗(yàn)可知，茯磚茶茶坯中含有一定量的嫩梗有助于金花茂盛生長(zhǎng)，提升茶湯甜醇回甘的滋味品質(zhì)。對(duì)湖南不同廠家的黑毛茶進(jìn)行散茶發(fā)花試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含梗的金花散茶滋味更加醇和、回甘度提升^[8-9]。由此可知，茯茶中的茶梗對(duì)其滋味醇甜度的增加具有重要貢獻(xiàn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于物質(zhì)代謝組學(xué)的活性成分與功能靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)模型分析^[10]，將復(fù)雜的藥理作用抽象表達(dá)為網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而分析網(wǎng)絡(luò)模型，揭示“成分-靶點(diǎn)-疾病”的復(fù)雜關(guān)系，預(yù)測(cè)相關(guān)活性成分和可能作用的機(jī)制。茶葉領(lǐng)域已有代謝組學(xué)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的綜合研究，分析了綠茶多重生物活性成分的“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)^[11]，茶花對(duì)高脂誘導(dǎo)小鼠酒精性脂肪肝的藥理作用機(jī)制^[12]，茯磚茶對(duì)非酒精性脂肪肝的干預(yù)作用及靶點(diǎn)^[13]和降血糖^[14]的作用機(jī)制。通過(guò)將代謝組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，為茶葉相關(guān)生化成分的體內(nèi)外驗(yàn)證試驗(yàn)提供了研究方向與理論基礎(chǔ)。

茶梗是茯茶品質(zhì)形成的重要組成部分，但其發(fā)花過(guò)程中的物質(zhì)代謝組學(xué)與其網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的內(nèi)在聯(lián)系，暫未看到相關(guān)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。為深入探明發(fā)花茶梗代謝物的變化及潛在功用，本研究以從一級(jí)黑毛茶中篩分出的幼嫩茶梗為主要原料，對(duì)其進(jìn)行散茶發(fā)花、獲得發(fā)花茶梗。以發(fā)花茶梗的非靶向代謝組學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)花茶梗的活性成分與潛在的作用靶點(diǎn)，并進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，以期為發(fā)花茶梗的目標(biāo)功能成分的開(kāi)發(fā)提供指導(dǎo)。

1"材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1.1 供試材料

冠突曲霉Aspergillus cristatus"LJSC.2006（從優(yōu)質(zhì)茯磚茶中分離純化得到，儲(chǔ)藏于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）在M40Y瓊脂斜面上保存，28 ℃培養(yǎng)7 d，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。

試驗(yàn)發(fā)花用的茶梗（來(lái)自湖南華萊生物科技有限公司，湖南省安化縣）從一級(jí)黑毛茶中獲得，經(jīng)過(guò)齒切、篩分，初步實(shí)現(xiàn)葉梗分離。通過(guò)靜電揀梗獲得相對(duì)較純的茶梗，再齒切茶梗獲得長(zhǎng)短規(guī)格相對(duì)一致的茶坯，其茶梗占比90%左右，用于散茶發(fā)花。

1.1.2 試劑

甲醇、甲酸、醋酸銨均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fishe公司。

1.1.3"主要設(shè)備

Q Exactive? HF-X質(zhì)譜儀、Vanquish UHPLC色譜儀、Hypesil Gold column（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱，Thermo Fisher公司；D3024R低溫離心機(jī)，Scilogex公司（美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 茶梗固態(tài)發(fā)花

茶梗散茶發(fā)花參考Xu等^[15]的方法進(jìn)行，基本工藝流程：茶梗→稱(chēng)樣→復(fù)水→滅菌→接種→發(fā)酵（發(fā)花）→干燥→發(fā)花茶梗。具體操作：1 000 g茶梗復(fù)水至含水量達(dá)到30%左右，轉(zhuǎn)入發(fā)酵容器121 ℃滅菌20 min，置于超凈工作臺(tái)備用；28 ℃活化培養(yǎng)冠突曲霉菌液至其孢子懸液濃度達(dá)1×10⁶～1×10⁷個(gè)·mL^-1；對(duì)每100 g茶梗接種7.5 mL孢子懸液，混勻后在28 ℃、濕度為80%的恒溫恒濕微生物培養(yǎng)箱中發(fā)酵16 d；收集發(fā)花16 d的茶梗（G16）儲(chǔ)存在無(wú)菌聚乙烯袋中，未發(fā)花的茶梗（G0）作為對(duì)照處理樣，一同置于﹣80 ℃冷凍保存以備分析測(cè)試。

1.2.2"茶梗感官審評(píng)

茶梗感官審評(píng)方法參考羅密等^[9]的散茯茶審評(píng)方法，對(duì)原茶梗及發(fā)花茶梗的外形、湯色、香氣、滋味、葉底5個(gè)因子進(jìn)行審評(píng)，加評(píng)金花菌的附著程度和顆粒顏色。稱(chēng)取3.0 g干茶樣于150 mL審評(píng)杯，依次加入100 ℃的純凈水，加蓋浸泡5 min后，茶湯依次瀝入評(píng)茶碗中，評(píng)湯色、嗅香氣、嘗滋味后，加評(píng)葉底。

1.2.3 非靶向代謝組學(xué)試驗(yàn)方法

非靶向代謝組學(xué)樣品的制備和提?。喝?00 mg樣本置于EP管，加入500 μL的80%甲醇水溶液渦旋振蕩，冰浴靜置5 min，15 000 r·min^-1、4 ℃離心20 min；取一定量上清液，加質(zhì)譜級(jí)水稀釋至甲醇含量53%；15 000 r·min^-1、4 ℃離心20 min，收集上清液，進(jìn)樣LC-MS分析^[16]。每個(gè)試驗(yàn)樣本取等體積混勻作為質(zhì)量控制（Quality control，QC）樣本，以評(píng)估LC-MS/MS的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

基于UHPLC-Q Exactive? HFX-LC-MS/MS分析：使用Vanquish UHPLC系統(tǒng)（Thermo Fisher Germany，Waltham，MA，USA）進(jìn)行LC-MS/MS分析，該系統(tǒng)具有Hypesil Gold column色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm；Thermo Fisher，Milford，MA，USA），該柱與Q Exactive? HFX質(zhì)譜儀（Thermo Fisher Germany，Waltham，MA，USA）耦合。正模式的流動(dòng)相A為0.1%甲酸，流動(dòng)相B為甲醇；負(fù)模式的流動(dòng)相A為5 mmol·L^-1醋酸銨、pH"9.0，流動(dòng)相B為甲醇；梯度洗脫程序：0～1.5 min （2%"B）、1.5～12 min（2%～100%"B）、12～14 min（100%"B）、14.0～14.1 min（100%～2%"B）、14.1～17.0 min（2%"B）直至結(jié)束。進(jìn)樣量1 μL、柱溫40 ℃、流速0.2 mL·min^-1。

Q Exactive? HFX質(zhì)譜儀在質(zhì)荷比（m/z）200～1 500全掃描范圍內(nèi)以負(fù)電離和正電離模式運(yùn)行。ESI源設(shè)置：噴淋電壓，3.2 kV；護(hù)套氣體流量，40 psi；輔助氣體流速，10 L·min^-1；毛細(xì)管溫度，320 ℃；離子導(dǎo)入射頻電平40%；輔助燃?xì)饧訜崞鳒囟龋?50 ℃；MS/MS二級(jí)掃描為數(shù)據(jù)相關(guān)掃描。

發(fā)花茶梗代謝產(chǎn)物的鑒定：將茶梗發(fā)花樣及原茶梗對(duì)照樣的非靶向代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入CD 3.1搜庫(kù)軟件中處理，對(duì)代謝物進(jìn)行保留時(shí)間、質(zhì)荷比等參數(shù)篩選，設(shè)置保留時(shí)間偏差0.2 min和質(zhì)量偏差5 mg·L^-1，進(jìn)行峰對(duì)齊；為使鑒定更準(zhǔn)確，設(shè)置質(zhì)量偏差5 mg·L^-1、信號(hào)強(qiáng)度偏差為30%、信噪比為3、最小信號(hào)強(qiáng)度、加和離子等，進(jìn)行峰提取、比對(duì)和集成?；贚inux操作系統(tǒng)（CentOS版本6.6）及軟件R、Python進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)、mzVault數(shù)據(jù)庫(kù)和MassList數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定到的代謝物進(jìn)行定性比較和注釋?zhuān)x用3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中在質(zhì)量容差范圍內(nèi)能匹配上的代謝物，共1 296種。

代謝產(chǎn)物的檢索和整理：利用HMDB（https：//hmdb.ca）、ChemSpider（https：//www.chemspider.com）、PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）等化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)發(fā)花茶梗中已鑒定到的代謝產(chǎn)物的分子線(xiàn)性輸入規(guī)范結(jié)構(gòu)式（Simplified molecular input line entry system，SMILES）、CAS號(hào)、化學(xué)名稱(chēng)、化合物分類(lèi)等信息收集整理。

1.2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法

活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：將茶梗發(fā)花樣及原茶梗樣的非靶向代謝組學(xué)差異代謝物的 SMILES輸入SWISS"ADME網(wǎng)站（http：//www.swissadme.ch），以胃腸道吸收（GI absorption）顯示為“High”，類(lèi)藥性（Drug-likeness，DL）項(xiàng)下的Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge至少滿(mǎn)足3個(gè)“Yes”為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行初篩。將初篩的差異代謝物的CAS號(hào)輸入TCMSP平臺(tái)（https：//tcmsp-e.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、DL≥0.18^[17-18]，篩選出潛在活性成分。將茶梗發(fā)花樣潛在活性成分的SMILES輸入Swiss Target Prediction網(wǎng)站^[19]"（http：//www.swissta-rgetprediction.ch），設(shè)置物種為“Homo Sapiens”，對(duì)潛在活性成分的干預(yù)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，導(dǎo)出Swiss"Target"Prediction"數(shù)據(jù)表，以Probability≥0.1篩選出潛在靶點(diǎn)。將潛在活性成分和潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2，剔除Degree≤1的節(jié)點(diǎn)，得到“潛在活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

蛋白質(zhì)互作（Protein-protein"interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析及潛在核心靶點(diǎn)篩選：將茶梗發(fā)花樣的潛在靶點(diǎn)信息的基因名導(dǎo)入STRING（https：//www.string-db.org），物種選擇“Homo sapiens”，進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析。保存PPI圖，并將分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2進(jìn)行解析。以解析結(jié)果中的點(diǎn)度中心性（Degree centrality，DC）、中介中心性（Between centrality，BC）和接近中心性（Closeness centrality，CC）值進(jìn)行篩選，先以三者的中位數(shù)進(jìn)行初篩，再調(diào)整篩選數(shù)值復(fù)篩，得到潛在核心靶點(diǎn)。

發(fā)花茶梗的基因本體（Gene ontology，GO）功能富集分析與京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of"genes and genomes，KEGG）通路分析：將茶梗發(fā)花樣的潛在靶點(diǎn)和潛在核心靶點(diǎn)的基因名導(dǎo)入DAVIO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。下載生物過(guò)程（Biological process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）等文件進(jìn)行GO功能富集分析；下載KEGG分析文件進(jìn)行KEGG通路分析。在微生信可視化云平臺(tái)（http：//bioinformatics.com.cn）中根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制GO分析柱狀圖及KEGG分析氣泡圖。

“潛在活性成分-潛在核心靶點(diǎn)-潛在核心通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建：將茶梗發(fā)花樣的潛在活性成分、潛在核心靶點(diǎn)和潛在核心通路分別導(dǎo)入Cytoscape 3.10.1，剔除Degree=0的節(jié)點(diǎn)，得到“潛在核心成分-潛在核心靶點(diǎn)-潛在核心通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

“核心活性成分-核心靶點(diǎn)”的分子對(duì)接及對(duì)接結(jié)果可視化：將茶梗發(fā)花樣的核心活性成分設(shè)為配體，茶梗發(fā)花樣的核心靶點(diǎn)設(shè)為受體。從PubChem網(wǎng)站中下載配體的SDF文件，用Chem3D"15.0對(duì)其進(jìn)行能量最低處理并改為PDB格式。從RCSB PDB網(wǎng)站（https：//www."rcsb.org）中下載受體的PDB文件，利用Pymol 2.5.7軟件對(duì)受體進(jìn)行去水、去配體處理。采用AutoDockTools-1.5.7對(duì)配體與受體進(jìn)行分子對(duì)接，并用Pymol 2.5.7進(jìn)行分子對(duì)接可視化驗(yàn)證。

1.2.5 數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)Microsoft Excel"2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并計(jì)算出差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）；利用SPSS"26.0進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)，獲得P值（P"value）；利用SIMCA"14.1進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），并得到變量投影重要性（Variable important of projective，VIP）。以P＜0.05、VIP≥1、FC≥2或FC≤0.5為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)差異代謝物進(jìn)行篩選，通過(guò)TBtools v2.042進(jìn)行差異代謝物熱圖繪制。

2"結(jié)果與分析

2.1"茶梗發(fā)花后的感官品質(zhì)變化

從感官審評(píng)拍攝的圖片（圖1）可發(fā)現(xiàn)：茶梗發(fā)花后，其感官品質(zhì)特征變化明顯，干茶色澤由原來(lái)的黃褐色轉(zhuǎn)為金黃色，布滿(mǎn)金花；內(nèi)質(zhì)審評(píng)發(fā)現(xiàn)，湯色由黃亮轉(zhuǎn)為橙紅較亮，葉底色澤由黃綠色轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤謳Ъt，香氣由花果香轉(zhuǎn)變成典型的菌香；滋味由醇和轉(zhuǎn)變?yōu)榇己?、回甘?/p>

2.2"發(fā)花茶梗的非靶向代謝組學(xué)分析

對(duì)發(fā)花茶梗及其原茶梗的非靶向代謝組學(xué)結(jié)果進(jìn)行OPLS-DA分析。如圖2A所示，主成分1和主成分2分別解釋了模型中總體方差的70.80%和4.41%，發(fā)花茶梗G16和原茶梗G0明顯分離并位于中軸兩側(cè)，在第一主成分上有明顯分離趨勢(shì)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)冠突曲霉發(fā)花后茶梗內(nèi)含物質(zhì)差異明顯。對(duì)該模型的穩(wěn)定性做進(jìn)一步研究，采用排列檢驗(yàn)200次的交叉驗(yàn)證模型進(jìn)行檢驗(yàn)。如圖1B所示，Q²回歸線(xiàn)與縱軸的相交點(diǎn)小于零（R²=0.928，Q²=﹣0.244），說(shuō)明模型不存在過(guò)擬合，驗(yàn)證有效，認(rèn)為該結(jié)果可用于發(fā)花茶梗與原茶梗的代謝物差異分析。

為進(jìn)一步闡明發(fā)花茶梗G16與原茶梗G0代謝產(chǎn)物的具體差異，以VIP≥1、P＜0.05、FC≥2或FC≤0.5為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。共得到295種差異代謝物，16個(gè)分類(lèi)，其中碳水化合物41種、有機(jī)酸37種、酚類(lèi)及其衍生物33種、萜類(lèi)化合物27種、胺類(lèi)26種、含氮雜環(huán)化合物24種、酯類(lèi)21種、糖苷類(lèi)19種、黃酮及其衍生物15種、氨基酸及其衍生物14種、類(lèi)固醇及其衍生物9種、生物堿9種、酚酸6種、香豆素及其衍生物6種、兒茶素及其衍生物1種和其他7種化合物。采用TBtools v2.042軟件進(jìn)行熱圖制作（圖3），可直觀地觀察發(fā)花茶梗G16與原茶梗G0差異代謝物的含量變化情況。由圖3可知，茶梗經(jīng)冠突曲霉菌發(fā)花后，經(jīng)篩選得到的發(fā)花茶梗的差異代謝物種類(lèi)豐富；與原茶梗相比，其含量變化主要表現(xiàn)為上升趨勢(shì)。

茶梗發(fā)花后的差異代謝物的種類(lèi)及數(shù)量變化情況如表1所示。254個(gè)代謝產(chǎn)物含量上升，41個(gè)代謝產(chǎn)物含量下降。不同種類(lèi)差異代謝物呈現(xiàn)上升數(shù)量高于下降數(shù)量的現(xiàn)象，但氨基酸及其衍生物與糖苷類(lèi)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中氨基酸及其衍生物下降數(shù)量與上升數(shù)量差異明顯，下降數(shù)量是上升數(shù)量的2.5倍。

2.3"發(fā)花茶梗潛在活性成分篩選與潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

為探究發(fā)花茶梗的潛在活性成分，利用Swiss ADME數(shù)據(jù)庫(kù)和TCMSP平臺(tái)對(duì)以上篩選

得到的295種差異代謝物進(jìn)行潛在活性成分篩選，其中胃腸道吸收程度（GI absorption）與口服生物利用度（OB）分別反映了被吸收入人體血液循環(huán)中的潛在活性成分占其口服攝入量的吸收程度與吸收比例^[17]；類(lèi)藥性五規(guī)則（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）與類(lèi)藥性（DL）反映了差異代謝物是否具備作為潛在藥物的能力^[18]。共篩選出16個(gè)潛在活性成分，如表2所示，黃酮及其衍生物有6個(gè)，碳水化合物、酚類(lèi)、萜類(lèi)和生物堿均有2個(gè)，含氮雜環(huán)化合物和酯類(lèi)分別有1個(gè)潛在活性成分，以上潛在活性成分在圖3中含量均顯著上升。該結(jié)果表明，發(fā)花茶梗的潛在活性成分可能主要為黃酮及其衍生物。

為探究發(fā)花茶梗的潛在活性成分可能作用的蛋白靶點(diǎn)，通過(guò)Swiss Target Prediction對(duì)以上16個(gè)潛在活性成分的靶點(diǎn)信息進(jìn)行預(yù)測(cè)，以Probability≥0.1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)去除重復(fù)的靶點(diǎn)后得到447個(gè)靶點(diǎn)信息。由此可知，發(fā)花茶梗的潛在活性成分可能影響的靶點(diǎn)較為豐富，但前人尚未對(duì)以上篩選得到的活性成分與靶點(diǎn)的潛在關(guān)聯(lián)進(jìn)行系統(tǒng)研究，后續(xù)研究可對(duì)其進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)論證。

為使發(fā)花茶梗的潛在活性成分和潛在靶點(diǎn)的潛在關(guān)系可視化，將潛在活性成分及預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.10.1，剔除Degree≤1的節(jié)點(diǎn)，得到“潛在活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（圖4）。分析網(wǎng)絡(luò)圖拓?fù)鋮?shù)，共生成264個(gè)節(jié)點(diǎn)，858條邊，紅色圓形代表潛在活性成分，黃色菱形代表靶點(diǎn)基因。圖中有16個(gè)潛在活性成分，248個(gè)潛在靶點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)以度（Degree）值表達(dá)，Degree值表示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相連的邊數(shù)，Degree值越大，潛在活性成分形狀越大，在網(wǎng)絡(luò)圖中關(guān)聯(lián)的靶點(diǎn)越多，進(jìn)一步說(shuō)明該潛在活性成分對(duì)人體靶點(diǎn)的干預(yù)潛力越大。圖中每個(gè)活性成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，其中Galangin（Degree 119）影響靶點(diǎn)最多，Miltirone（Degree 4）影響靶點(diǎn)最少。

圖4表明發(fā)花茶梗具備作用于多個(gè)蛋白靶點(diǎn)的潛力，后期可對(duì)圖中蛋白靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的通路進(jìn)一步探究。

2.4"發(fā)花茶梗的PPI構(gòu)建及潛在核心靶點(diǎn)篩選

將圖4的發(fā)花茶梗的潛在靶點(diǎn)基因名導(dǎo)入STRING進(jìn)行PPI分析，保存其潛在靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）并下載數(shù)據(jù)分析文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2，計(jì)算靶點(diǎn)的點(diǎn)度中心性（DC）、中介中心性（BC）和接近中心性（CC）。首先以三者的中位數(shù)進(jìn)行初篩，再調(diào)整數(shù)值進(jìn)行篩選，最后以DC≥0.50、BC≥0.01、CC≥0.55為標(biāo)準(zhǔn)篩選出核心靶點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)表3，共篩選出13個(gè)潛在核心靶點(diǎn)，其聚集于圖5的PPI圖中最密集處，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間相互關(guān)聯(lián)，互有影響，推測(cè)發(fā)花茶梗的潛在活性成分主要作用于潛在核心靶點(diǎn)來(lái)發(fā)揮功用。

2.5"發(fā)花茶梗的GO功能和KEGG通路分析

為探究發(fā)花茶梗的內(nèi)含成分在基因功能與信號(hào)通路中的作用，將發(fā)花茶梗的潛在靶點(diǎn)（圖3）與潛在核心靶點(diǎn)（表4）分別錄入DAVIO數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)潛在靶點(diǎn)與潛在核心靶點(diǎn)的GO功能和KEGG通路進(jìn)行分析。

GO分析由生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）組成。發(fā)花茶梗的GO分析共得到1 003個(gè)條目，BP有675個(gè)條目，CC有128個(gè)條目，MF有200個(gè)條目。分別選取發(fā)花茶梗潛在靶點(diǎn)與潛在核心靶點(diǎn)的BP、CC、MF的P值較小的前10個(gè)條目繪制梯度水平條形圖（圖6A、圖6C）。通過(guò)分析潛在靶點(diǎn)與潛在核心靶點(diǎn)的相同條目，可以得出發(fā)花茶梗具有的潛在GO功能，BP主要為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）、細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控（Negative regulation of apoptotic process）；CC主要為細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm）、胞漿（Cytosol）、質(zhì)膜（Plasma membrane）、膜筏（Membrane raft）；MF主要為蛋白質(zhì)結(jié)合（Protein binding）、相同蛋白質(zhì)結(jié)合（Identical protein binding）、酶結(jié)合（Enzyme binding）。由以上分析可得出，發(fā)花茶梗的內(nèi)含成分可能主要在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜等部位，通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)合和酶結(jié)合等分子功能對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控等生物過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)。

發(fā)花茶梗的KEGG分析共富集了149條通路，分別選取發(fā)花茶梗潛在靶點(diǎn)與潛在核心靶點(diǎn)P值較小的前20個(gè)的代謝通路繪制氣泡圖（圖6B、圖6D），并且將潛在靶點(diǎn)與潛在核心靶點(diǎn)的重合通路設(shè)為潛在核心通路。通過(guò)分析以上通路，可以得出發(fā)花茶梗的潛在核心通路有癌癥途徑（Pathways in cancer）、化學(xué)致癌-受體活化（Chemical carcinogenesis-receptor activation）、癌癥中的蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、內(nèi)分泌抵抗（Endocrine resistance）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）。由以上分析可以得出，發(fā)花茶梗可能主要作用于癌癥通路中的蛋白聚糖與受體，并且對(duì)人體內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)和EGFR酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性也具

有調(diào)控潛力。此外，潛在靶點(diǎn)影響的P值最小的通路為神經(jīng)活性配體-受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction），潛在核心靶點(diǎn)影響的P值最小的通路為脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化（Lipid and atherosclerosis），且兩者Gene Ratio值也相對(duì)較高，由此也可推測(cè)以上通路雖未歸為潛在核心通路，但具有被發(fā)花茶?；钚猿煞指深A(yù)的潛力。

2.6"發(fā)花茶梗的“潛在核心成分-潛在核心靶點(diǎn)-潛在核心通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將發(fā)花茶梗的潛在活性成分、潛在核心靶點(diǎn)和潛在核心通路導(dǎo)入Cytoscape 3.10.1進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖制作，將Degree=0的節(jié)點(diǎn)去除，結(jié)果見(jiàn)圖7。網(wǎng)絡(luò)圖中有潛在活性成分12個(gè)，潛在核心靶點(diǎn)10個(gè)，潛在核心通路5個(gè)。對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖7拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Degree值前三的潛在活性成分均為黃酮及其衍生物，Coumestrol（Degree 8）、Luteolin（Degree 6）、Galangin（Degree 6）；Degree值前三的潛在核心靶點(diǎn)為EGFR（Degree 14）、ESR1（Degree 12）、SRC（Degree 11）；前3個(gè)潛在核心通路為Pathways in cancer（Degree 8）、Proteoglycans in cancer（Degree 6）、Chemical carcinogenesis receptor activation（Degree 6）?？梢缘贸觯l(fā)花茶梗的潛在核心活性成分可能主要作用于與癌癥相關(guān)的靶點(diǎn)與通路，進(jìn)而發(fā)揮茶梗潛在的藥理功能。

2.7"發(fā)花茶梗的分子對(duì)接結(jié)果及可視化驗(yàn)證

在分子對(duì)接中，配體與受體構(gòu)象穩(wěn)定性能量越低，相互作用的可能性越大，結(jié)合能≤﹣5.00 kcal·mol^-1表明分子之間具有良好的結(jié)合活性^[20]。將“潛在核心成分-潛在核心靶點(diǎn)-潛在核心通路”網(wǎng)絡(luò)圖中，潛在活性成分作為配體，潛在靶點(diǎn)作為受體，進(jìn)行分子對(duì)接。以配體對(duì)接成功數(shù)大于3、受體對(duì)接成功數(shù)大于3、且配體與受體位于最低結(jié)合能時(shí)有氫鍵生成為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出核心活性成分與核心靶點(diǎn)（表4）。核心活性成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果的最低結(jié)合能均小于﹣5.00 kcal·mol^-1，表明發(fā)花茶梗的核心活性成分Coumestrol、Galangin、Luteolin、Crocetin與核心靶點(diǎn)EGFR、ESR1、SRC、PTGS2之間具有較高的結(jié)合活性。

將上述篩選得到的核心活性成分，香豆雌酚、高良姜素、木犀草素、藏紅花酸作為配體，核心靶點(diǎn)EGFR、ESR1、SRC、PTGS2作為受體，進(jìn)行分子對(duì)接展示（圖8）。結(jié)果表明，配體與受體之間均能生成氫鍵，且部分對(duì)接結(jié)果存在配體與受體的多個(gè)氨基酸殘基相連的現(xiàn)象，表明核心成分與核心靶點(diǎn)之間具有較高的生物活性。

3"討論

本研究對(duì)發(fā)花茶梗與原茶梗的非靶向代謝組學(xué)分析結(jié)果，與茯磚茶和散茶發(fā)花進(jìn)程中代謝物的變化趨勢(shì)不完全相同。代謝組學(xué)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)花茶梗的黃酮及其衍生物含量上升，與文獻(xiàn)[8-9，21]中關(guān)于散茶發(fā)花的HPLC分析結(jié)果的變化趨勢(shì)不同，但與Li等^[22]關(guān)于茯磚茶代謝產(chǎn)物在加工時(shí)期變化的研究結(jié)果趨勢(shì)相似；酚酸及其衍生物含量上升，與Xiao等^[21]和Li等^[22]研究的變化趨勢(shì)均不同；氨基酸及其衍生物與糖苷類(lèi)含量降低，這與湯依鈺等^[8]和羅密等^[9]研究中的變化趨勢(shì)相似，產(chǎn)生以上變化的原因可能是試驗(yàn)中基質(zhì)和菌株的不同。推測(cè)冠突曲霉LJSC.2006對(duì)茶梗發(fā)花，可使其包括黃酮和酚酸類(lèi)在內(nèi)的化合物含量上升。同時(shí)，冠突曲霉需利用發(fā)花基質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持生長(zhǎng)繁殖，使得茯茶中氨基酸和糖苷類(lèi)化合物含量下降^[23]。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)發(fā)花茶梗的潛在活性成分進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，獲知其主要活性成分為黃酮及其衍生物，香豆雌酚、高良姜素、木犀草素和藏紅花酸為核心活性成分，與癌癥、內(nèi)分泌抵抗等代謝通路相關(guān)的EGFR、ESR1、SRC和PTGS2為其核心靶點(diǎn)。香豆雌酚是一種存在于豆制品中的類(lèi)黃酮物質(zhì)，目前已知其與雌激素受體（Estrogen receptor，ER）具有高親和力^[24]，在驗(yàn)證香豆雌酚對(duì)去卵巢小鼠代謝功能障礙的保護(hù)作用中，證明其可影響ESR1與ESR2的蛋白表達(dá)，且香豆雌酚與ESR2親和力更強(qiáng)^[25]，但ESR1在乳腺癌細(xì)胞中的凋亡潛力可能高于ESR2^[26]。目前，香豆雌酚對(duì)EGFR、SRC、PTGS2研究尚未見(jiàn)前人研究論證，僅對(duì)以香豆雌酚作為活性成分的“黃芪-當(dāng)歸-大棗”方劑進(jìn)行探究，該方劑可降低氣血兩虛小鼠中PTGS2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到養(yǎng)氣補(bǔ)血的功效^[27]。高良姜素在姜科植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）根中和蜂膠中含量豐富，是一種重要的天然活性的黃酮化合物^[28-29]。其對(duì)ESR1的研究尚未提及，在已知驗(yàn)證試驗(yàn)中，高良姜素可抑制A549肺癌細(xì)胞的增殖，且與藥物吉非替尼聯(lián)用具有協(xié)同增效機(jī)制，但僅能顯著降低p-EGFR的蛋白表達(dá)，未能顯著改變EGFR的蛋白表達(dá)水平^[30]；高良姜素可通過(guò)抑制SRC等蛋白靶點(diǎn)，阻斷凝血素誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（SK-N-SH）中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-9）的表達(dá)，其可能是治療腦炎性疾病的潛在候選藥物^[31]；高良姜素還可通過(guò)抑制PTGS2的mRNA表達(dá)，有效地保護(hù)腎上皮細(xì)胞（NRK-52E）免受尿酸誘導(dǎo)的腎臟炎癥^[32]。木犀草素是廣泛存在于多種植物中的天然黃酮化合物^[33]，其藥理功能已被較為深入的探究，對(duì)EGFR、ESR1、SRC、PTGS2的研究均有涉及。Huang等^[34]將木犀草素作用于巨噬細(xì)胞的炎癥模型，可降低EGFR、SRC蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平，具有抗炎藥物的開(kāi)發(fā)潛力；Yu等^[35]通過(guò)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與肝癌細(xì)胞（Hepatocellular carcinoma，HCC）體外試驗(yàn)，驗(yàn)證木犀草素可使ESR1上調(diào)，顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，證明木犀草素具有抗肝癌的藥理作用；Wang等^[36]通過(guò)建立香煙煙霧和脂多糖誘導(dǎo)的ICR小鼠的慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型，證明三子養(yǎng)親湯中的木犀草素可顯著降低EGFR、PTGS2在模型組的蛋白表達(dá)水平，因此木犀草素可能具備治療COPD的潛力。藏紅花酸是存在于藏紅花（Crocus sativus L.）中的重要生物活性物質(zhì)^[37]，對(duì)PTGS2的影響尚未有試驗(yàn)論證。Zheng等^[38]通過(guò)構(gòu)建鏈脲霉素（Streptozotocin）誘導(dǎo)的妊娠期糖尿?。℅estational diabetes，GDM）大鼠模型，證實(shí)藏紅花酸可顯著改變EGFR的mRNA表達(dá)水平，對(duì)鏈脲霉素誘導(dǎo)的GDM大鼠具有保護(hù)作用；Cui等^[39]通過(guò)對(duì)頭頸部鱗狀癌細(xì)胞（HNSCC）的體外試驗(yàn)，證明藏紅花酸可顯著抑制HNSCC細(xì)胞的遷移和愈合效率，并降低ESR1的mRNA表達(dá)水平；但在Mohan等^[40]研究中，藏紅花酸并沒(méi)有顯著改變HCC中SRC的蛋白表達(dá)水平，但藏紅花酸具有抵抗HCC增殖的活性。以上核心活性成分與核心靶點(diǎn)之間，大部分已被前人通過(guò)構(gòu)建相關(guān)體內(nèi)或體外模型進(jìn)行論證，得到了較為可信的生物數(shù)據(jù)，證明其與以上核心通路關(guān)系較為密切。本研究中“核心活性成分-核心靶點(diǎn)”的相關(guān)性仍未得到充分研究，接下來(lái)可將其作為未來(lái)藥理試驗(yàn)的研究方向進(jìn)一步分析論證。此外，本研究與前人對(duì)茯茶的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中篩選出的核心活性成分和核心靶點(diǎn)不同^[13-14]，推測(cè)這可能與本研究中的試驗(yàn)菌株和發(fā)花基質(zhì)存在關(guān)聯(lián)。

4"結(jié)論

茶梗發(fā)花后代謝產(chǎn)物種類(lèi)豐富，且含量總體呈上升趨勢(shì)，但氨基酸及其衍生物與糖苷類(lèi)的代謝物含量下降，并且氨基酸及其衍生物的代謝產(chǎn)物下降比例最為明顯；通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接及其可視化驗(yàn)證，發(fā)花茶梗的主要活性成分為黃酮及其衍生物，預(yù)測(cè)具有較高生物活性的香豆雌酚、高良姜素、木犀草素和藏紅花酸為核心活性成分，與癌癥、內(nèi)分泌抵抗等代謝通路相關(guān)的EGFR、ESR1、SRC和PTGS2為核心靶點(diǎn)。推測(cè)經(jīng)由冠突曲霉LJSC.2006通過(guò)對(duì)茶梗進(jìn)行發(fā)花處理，發(fā)花后可使茶梗中的核心活性成分的含量升高，并使其作用于核心靶點(diǎn)，對(duì)癌癥和內(nèi)分泌抵抗等潛在核心通路進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而對(duì)部分癌癥及內(nèi)分泌相關(guān)疾病起到改善與緩解的功用。后續(xù)研究可嘗試對(duì)茶梗進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，比較不同發(fā)花方式的代謝產(chǎn)物差異，并構(gòu)建相關(guān)疾病的動(dòng)物或細(xì)胞模型，驗(yàn)證發(fā)花茶?；钚猿煞謱?duì)核心靶點(diǎn)的影響機(jī)制，進(jìn)而完善“核心活性成分-核心靶點(diǎn)-核心通路”協(xié)同作用的途徑與機(jī)制，可為后續(xù)開(kāi)發(fā)茯茶功能產(chǎn)品提供新思路。

參考文獻(xiàn)

[1]"Hubka V， Kola?ík M， Kubátová A， et al. Taxonomic revision of Eurotium"and transfer of species to Aspergillus"[J]. Mycologia， 2017， 105（4）： 912-937.

[2]"Xie Z， Zeng Z， Chen G， et al. Intracellular polysaccharides of Aspergillus cristatus"from Fuzhuan brick tea leverage the gut microbiota and repair the intestinal barrier to ameliorate DSS-induced colitis in mice [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2023， 71（21）： 8023-8037.

[3]"Liu T"T， Liu X"T， Huang G"L， et al. Theophylline extracted from Fu brick tea affects the metabolism of preadipocytes and body fat in mice as a pancreatic lipase inhibitor [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（5）： 2525-2546.

[4]"Xie Z， Bai Y， Chen G， et al. Immunomodulatory activity of polysaccharides from the mycelium of"Aspergillus cristatus， isolated from Fuzhuan brick tea， associated with the regulation of intestinal barrier function and gut microbiota [J]. Food Research International， 2022， 152： 110901-110917.

[5]"陳義， 楊轉(zhuǎn)， 尹鵬， 等. 茶樹(shù)新梢不同部位主要滋味物質(zhì)分布規(guī)律研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)， 2020， 41（13）： 56-59.Chen Y， Yang Z， Yin P， et al. Distribution of the main taste substances in different parts of tea shoots [J]. Food Research and Development， 2020， 41（13）： 56-59.

[6]"宛曉春. 茶葉生物化學(xué)[M]. 3版 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2016.

Wan"X C. Tea Biochemistry"[M]. 3rd ed. Beijing： China Agriculture Press， 2016.

[7]"Shen J， Wang Y， Ding Z， et al. Metabolic analyses reveal growth characteristics of young tea shoots in spring [J]. Scientia Horticulturae， 2019， 246： 478-489.

[8]"湯依鈺， 俞夢(mèng)瑤， 禹利君， 等. 冠突散囊菌LJSC.2005對(duì)茯茶主體黑毛茶發(fā)花品質(zhì)影響 [J]. 茶葉科學(xué)， 2022， 42（6）： 851-862.Tang Y Y， Yu M Y， Yu L J， et al. Effects of Eurotium cristatum"LJSC.2005 on the quality of primary dark tea， a major part of Fu tea [J]. Journal of Tea Science， 2022， 42（6）： 851-862.

[9]"羅密， 俞夢(mèng)瑤， 禹利君， 等. 冠突散囊菌LJSC.2001對(duì)不同黑毛茶發(fā)花品質(zhì)的影響 [J]. 食品科學(xué)， 2023， 44（14）： 106-115.Luo M， Yu M Y， Yu L J， et al. Effect of fermentation by Eurotium cristatum"LJSC.2001 on the fermentation quality of raw dark tea made from different varieties [J]. Food Science， 2023， 44（14）： 106-115.

[10]"Li X， Liu Z， Liao J， et al. Network pharmacology approaches for research of traditional Chinese medicines [J]. Chinese Journal of Natural Medicines， 2023， 21（5）： 323-332.

[11]"Zhang S， Shan L， Li Q， et al. Systematic analysis of the multiple bioactivities of green tea through a network pharmacology approach [J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine， 2014： 512081."doi： 10.1155/2014/512081.

[12]"Wu P， Liang S， He Y， et al. Network pharmacology analysis to explore mechanism of three flower tea against nonalcoholic fatty liver disease with experimental support using high-fat diet-induced rats [J]. Chinese Herbal Medicines， 2022， 14 （2）： 273-282.

[13]"Tian F"M， Yi J， Tang Y， et al. A UPLC-Q-TOF/MS and network pharmacology method to explore the mechanism of Anhua Fuzhuan tea intervention in nonalcoholic fatty liver disease [J]. Food amp; Function， 2023， 14（8）： 3686-3700.

[14]"Xiang X， You S， Zeng Z， et al. Exploration of the hypoglycemic mechanism of Fuzhuan brick tea based on integrating global metabolomics and network pharmacology analysis [J]. Frontiers in Molecular Biosciences， 2024， 10： 1-12."doi： 10.3389/fmolb.2023.1266156.

[15]"Xu S， Zhou Y， Yu L， et al. Protective effect of"Eurotium cristatum"fermented loose dark tea and"Eurotium cristatum"particle on MAPK and PXR/AhR signaling pathways induced by electronic cigarette exposure in mice [J]. Nutrients， 2022， 14（14）： 2843-2860.

[16]"Want E J， Masson P， Michopoulos F， et al. Global metabolic profiling of animal and human tissues via UPLC-MS [J]. Nature Protocols， 2012， 8（1）： 17-32.

[17]"Lipinski C A， Lombardo F， Dominy B W， et al. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings [J]. Advanced Drug Delivery Reviews， 2012， 64： 4-17."doi： 10.1016/jaddr.2012.09.019.

[18]"Oprea T I. Property distribution of drug-related chemical databases [J]. Journal of Computer-Aided Molecular Design， 2000， 14（3）： 251-264.

[19]"Daina A， Michielin O， Zoete V. Swiss target prediction： updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules [J]. Nucleic Acids Research， 2019， 47（1）： 357-364.

[20]"Du A， Zheng R， Disoma C， et al. Epigallocatechin-3-gallate， an active ingredient of traditional Chinese medicines， inhibits the 3CLpro activity of SARS-CoV-2 [J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2021， 176： 1-12."doi： 10.1016/j.ijbiomac.2021.02.012.

[21]"Xiao Y， He C， Chen Y， et al. UPLC-QQQ-MS/MS-based widely targeted metabolomic analysis reveals the effect of solid-state fermentation with Eurotium cristatum"on the dynamic changes in the metabolite profile of dark tea [J]. Food Chemistry， 2022， 378： 131999-132005."doi： 10.1016/jfoodchem.2021.131999.

[22]"Li Q， Jin Y， Jiang R， et al. Dynamic changes in the metabolite profile and taste characteristics of Fu brick tea during the manufacturing process [J]. Food Chemistry， 2021， 344： 128576-128607."doi： 10.1016/jfoodchem.2020.128576.

[23]"Xiang M， Chu J， Cai W， et al. Microbial succession and interactions during the manufacture of Fu brick tea [J]. Frontiers in Microbiology， 2022， 13： 892437-892448."doi： 10.3389/fmicb.2022.892437.

[24]"Miksicek R J. In situ localization of the estrogen receptor in living cells with the fluorescent phytoestrogen coumestrol [J]. The Joumal of Histochemistry and Cytochemistry， 1993， 41（6）： 801-810.

[25]"Park S， Sim K"S， Heo W， et al. Protective effects of coumestrol on metabolic dysfunction and its estrogen receptor-mediated action in ovariectomized mice [J]. Nutrients， 2023， 15（4）： 954-966.

[26]"Zafar A， Ahmad S， Naseem I. Insight into the structural stability of coumestrol with human estrogen receptor α"and β"subtypes： a combined approach involving docking and molecular dynamics simulation studies [J]. RSC Advances， 2015， 5（99）： 81295-81312.

[27]"周文靜， 張萌， 周榮榮， 等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討“黃芪-當(dāng)歸-大棗”角藥補(bǔ)氣養(yǎng)血的分子機(jī)制[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2020， 22（5）： 1725-1733.Zhou W J， Zhang M， Zhou R R， et al. Study on the molecular mechanism of"“astragalus-angelica-jujube”"triangular drugson tonifying qi and nourishing blood based on network pharmacology [J]. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica， 2020， 22（5）： 1725-1733.

[28]"Wang D， Chen J， Pu L， et al. Galangin： a food-derived flavonoid with therapeutic potential against a wide spectrum of diseases [J]. Phytotherapy Research， 2023， 37（12）： 5700-5723.

[29]"Zhang F， Yan Y， Zhang L"M， et al. Pharmacological activities and therapeutic potential of galangin， a promising natural flavone， in age-related diseases [J]. Phytomedicine， 2023， 120： 155061-155076."doi： 10.1016/j.phymed.2023.155061.

[30]"沈存思， 楊福州， 項(xiàng)瑩穎， 等. 中藥活性化合物高良姜素與吉非替尼抗非小細(xì)胞肺癌的協(xié)同增效作用及機(jī)制研究[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2021， 37（1）： 72-76.Shen C S， Yang F Z， Xiang Y Y， et al. Study on the synergistic effect and mechanism of traditional Chinese medicine active compound galangin and gefitinib on non-small cell lung cancer [J]. Journal of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， 2021， 37（1）： 72-76.

[31]"Yang C"C， Lin C"C， Hsiao L"D， et al. Galangin inhibits thrombin-induced MMP-9 expression in SK-N-SH cells via protein kinase-dependent NF-κB phosphorylation [J]. International Journal of Molecular Sciences， 2018， 19（12）： 4084-5102.

[32]"Lu H， Yao H， Zou R， et al. Galangin suppresses renal inflammation via the inhibition of NF-κB， PI3K/AKT and NLRP3 in uric acid treated NRK-52E tubular epithelial cells [J]. BioMed Research International， 2019： 3018357. doi：10.1155/2019/3018357.

[33]"Punia Bangar S， Kajla P， Chaudhary V， et al. Luteolin： a flavone with myriads of bioactivities and food applications [J]. Food Bioscience， 2023， 52： 102366-102380."doi："10.1016/j.fbio.2023.102366.

[34]"Huang X"F， Zhang J"L， Huang D"P， et al. A network pharmacology strategy to investigate the anti-inflammatory mechanism of luteolin combined with in vitro"transcriptomics and proteomics [J]. International Immunopharmacology， 2020， 86： 106727-106740."doi：10.1016/j.intimp.2020.106727.

[35]"Yu Y， Ding S， Xu X， et al. Integrating network pharmacology and bioinformatics to explore the effects of dangshen （Codonopsis pilosula） against hepatocellular carcinoma： validation based on the active compound luteolin [J]. Drug Design， Development and Therapy， 2023， 17： 659-673.nbsp;doi："10.2147/dddt.S386941.

[36]"Wang M， Gu W， Kui F， et al. The clinical efficiency and the mechanism of sanzi yangqin decoction for chronic obstructive pulmonary disease [J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine， 2021： 5565562."doi： 10.1155/2021/5565562.

[37]"Butnariu M， Quispe C， Herrera-Bravo J， et al. The pharmacological activities of Crocus sativus"L.： a review based on the mechanisms and therapeutic opportunities of its phytoconstituents [J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity， 2022： 8214821."doi： 10.1155/2022/8214821.

[38]"Zheng Y， Zhu N， Wang J， et al. Crocetin suppresses gestational diabetes in streptozotocin-induced diabetes mellitus rats via suppression of inflammatory reaction [J]. Journal of Food Biochemistry， 2021， 45（9）： 13857-13868.

[39]"Cui L"M， Zhang M"J， Wang X"J， et al. Inhibitory effect of saffron on head and neck squamous cell carcinoma via targeting of ESR1 and CCND1 by its active compound crocetin [J]. Traditional Medicine Research， 2024， 9（7）： 39-49.

[40]"Mohan C D， Kim C， Siveen K S， et al. Crocetin imparts antiproliferative activity via inhibiting STAT3 signaling in hepatocellular carcinoma [J]. IUBMB Life， 2021， 73（11）： 1348-1362.

《茶葉科學(xué)》征訂征稿啟事

《茶葉科學(xué)》——中文核心期刊、中國(guó)科技核心期刊及中國(guó)科學(xué)引文和中國(guó)學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源期刊。國(guó)內(nèi)各大數(shù)據(jù)庫(kù)全文收錄（中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普、超星、中教、博看等），國(guó)外的Scopus、EBSCO、FSTA、CAS、CAB等知名數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，影響因子等期刊評(píng)價(jià)指標(biāo)列同類(lèi)期刊前列。主要報(bào)道最新涉茶科技成果，內(nèi)容包括茶樹(shù)栽培﹑育種﹑病蟲(chóng)害防治、茶葉加工﹑生化﹑機(jī)械﹑技術(shù)經(jīng)濟(jì)﹑茶飲料、茶食品和保健品、茶的醫(yī)用保健等。歡迎來(lái)稿！投稿請(qǐng)?jiān)诰W(wǎng)站（www.tea-science.com）的采編系統(tǒng)上投稿?！恫枞~科學(xué)》自2008年起改為雙月刊，大16開(kāi)本。自2022年起，每期定價(jià)50元，全年訂價(jià)300元。為簡(jiǎn)化手續(xù)，可一次訂購(gòu)今后1～3年的期刊?？畹郊醇钠诳半娮影l(fā)票。免郵費(fèi)。

開(kāi)戶(hù)銀行：中國(guó)農(nóng)業(yè)銀行杭州市西湖支行，帳號(hào)：19000101040005296，開(kāi)戶(hù)名：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所。銀行匯款時(shí)請(qǐng)?jiān)诟窖灾凶⒚鳌安枞~科學(xué)”。

匯款后，請(qǐng)將匯款憑證及填好的《茶葉科學(xué)》征訂函發(fā)送至cykx@vip.163.com。

電話(huà)：0571-86651482

E-mail：cykx@vip.163.com（訂刊）

網(wǎng)址：www.tea-science.com