摘要： 【目的】細(xì)菌性斑點病是導(dǎo)致番茄S o l a n u m l y c o p e r s i c um 減產(chǎn)的主要因素之一，丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，Pst DC3000） 是細(xì)菌性斑點病的致病因子之一。瞬時沉默番茄JAZ7 基因?qū)е缕鋵st DC3000 的敏感性增加，然而，驗證JAZ7 基因抗細(xì)菌性斑點病的直接證據(jù)及其作用機理的報道較少。本研究從番茄葉片中克隆得到SlJAZ7 基因，創(chuàng)制穩(wěn)定遺傳的過表達SlJAZ7 的轉(zhuǎn)基因番茄，分析其抗病功能和機理，研究其在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上與抗病性密切相關(guān)的SlTGA7 的關(guān)系，為有效防治細(xì)菌性斑點病提供理論基礎(chǔ)。【方法】通過野生型和轉(zhuǎn)基因番茄接種Pst DC3000 的表型差異分析，鑒定SlJAZ7 基因的抗病功能。使用RT-qPCR 分析SlJAZ7 和SlTGA7 基因在Pst DC3000、茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA） 和水楊酸（Salicylic acid，SA） 處理下的表達模式和組織特異性。利用煙草瞬時表達的方法研究SIJAZ7 和SlTGA7 蛋白的亞細(xì)胞定位。利用酵母雙雜交（Y2H） 試驗、雙分子熒光互補（BiFC） 試驗和蛋白下拉（pull down） 試驗研究SlJAZ7 蛋白與SlTGA7 蛋白的互作關(guān)系，驗證SlJAZ7 的抗病功能和可能的抗病機理?！窘Y(jié)果】過表達SlJAZ7 基因的轉(zhuǎn)基因番茄葉片在Pst DC3000 處理時受到的過氧化損傷較野生型更少，轉(zhuǎn)基因株系中SlTGA7 表達量升高，SlJAZ7 基因在營養(yǎng)器官中高表達，且受到Pst DC3000 誘導(dǎo)，響應(yīng)MeJA、SA 處理，SlTGA7 基因在同樣的處理下呈相反的變化趨勢。SlJAZ7 和SlTGA7 蛋白均定位于細(xì)胞核。Y2H、BiFC 和pull down 試驗同時證明SlJAZ7 蛋白和SlTGA7 蛋白存在互作關(guān)系?！窘Y(jié)論】過表達SlJAZ7 基因有利于減少活性氧積累，提高番茄抗病性，同時SlJAZ7 在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控SlTGA7 基因表達。SlJAZ7 與SlTGA7 存在互作，推測SIJAZ7 基因可能通過提高Pst DC3000 病原菌侵染時SITGA7 基因的表達量，啟動SITGA7 下游抗病基因的表達來提高轉(zhuǎn)基因番茄的抗病性，也可能通過與SITGA7 蛋白結(jié)合，影響其調(diào)控MYC 等轉(zhuǎn)錄因子的活性。這為進一步研究SlJAZ7 的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 番茄；SlJAZ7；蛋白互作；抗病性；茉莉酸甲酯；水楊酸

中圖分類號： S641.2 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號： 1001-411X（2024）04-0525-10

番茄Solanum lycopersicum 因含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)而成為我國重要的蔬菜作物，也是研究果實發(fā)育、成熟的重要模式植物[1-2]。番茄種植過程中易受病原菌侵害，造成減產(chǎn)，細(xì)菌性斑點病、細(xì)菌性潰瘍病、細(xì)菌性枯萎病等細(xì)菌性病害是造成番茄減產(chǎn)的重要原因[ 3 ]。丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000，PstDC3000） 是番茄細(xì)菌性斑點病的致病變種之一，也是研究植物? 病原菌互作的模式菌株[ 4 ] 。P s tDC3000 吸附到番茄葉片表面，從氣孔或傷口侵入，引起局部壞死、周圍彌漫性黃化，危害番茄葉片、果實、花、莖稈等，給番茄產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的損失。

茉莉酸（Jasmonic acid，JA） 是一類廣泛存在于植物中的內(nèi)源激素，1971 年在一種真菌培養(yǎng)過濾液中獲得[5]。研究發(fā)現(xiàn)，外源JA 具有促進植物衰老和調(diào)控生長的作用，且昆蟲啃咬和真菌侵染均可以促進JA 和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA） 的積累[5-6]。植物在逆境條件下，積累不同形式的JA，最終生成活性的茉莉酸?異亮氨酸（Jasmonic acidisoleucine，JA-Ile）， JA-Ile 誘導(dǎo)JA 受體F-boxCORONATINE INSENSITIVE1（COI1） 與JasmonateZIM-domain（JAZ） 蛋白形成共受體復(fù)合體，促使JAZ 蛋白被泛素化降解，激活轉(zhuǎn)錄因子下游抗病反應(yīng)基因的表達[7-8]。例如SlJAZ25 基因在番茄對灰葉斑病的抗性反應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用[9]。通過病毒沉默番茄JAZ3 基因發(fā)現(xiàn)番茄對葉霉病的抵抗能力降低，同時，植株內(nèi)源JA 含量降低，水楊酸（Salicylicacid，SA） 含量升高[10]。AtJAZ7 基因的突變增加了擬南芥對尖孢鐮刀菌和Pst DC3000 的感病性[11]。SlJAZ2、SlJAZ6、SlJAZ7 瞬時沉默植株對PstDC3000 的敏感性增加[12]。Pst DC3000 的致病因子冠菌素與JA-Ile 在結(jié)構(gòu)上存在很大的相似性，冠菌素通過模仿JA-Ile，激活JA 信號傳導(dǎo)，抑制SA 介導(dǎo)的防御信號[12]。擬南芥ANAC032 轉(zhuǎn)錄因子與MYC2、NIMIN1 和PDF1.2 啟動子結(jié)合，激活SA 介導(dǎo)的防御反應(yīng)但抑制JA 反應(yīng)基因的表達，提高對Pst DC3000 的抗性[13]，說明JA 和SA 之間拮抗或協(xié)同的關(guān)系可幫助植物抵御外界不良環(huán)境[14]。

植物T G A 轉(zhuǎn)錄因子（ T G A C G - b i n d i n gtranscription factor） 是SA 抗病途徑的重要調(diào)節(jié)因子，也是JA/乙烯抗病信號途徑中的重要組成部分，發(fā)揮重要作用[15-16]。擬南芥TGA 轉(zhuǎn)錄因子家族共有10 個基因，分為5 組，每組都具有不同的功能。TGA 與病程相關(guān)（Pathogenesis related，PR） 蛋白基因啟動子上TGACG（as-1） 元件結(jié)合調(diào)節(jié)下游病程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平， 從而提高植物的抗病性[ 1 7 - 1 9 ]。研究表明TGA 轉(zhuǎn)錄因子I、II、III 組與SA 受體NON-EXPRESSOR of PR-1（NPR1） 均存在不同強度的互作[17-19]。在JA/ETH 誘導(dǎo)下tga2/5/63 份突變體中PDF1.2 和b-CHI 表達被抑制，使得番茄對壞死性番茄灰霉病更易感[20]。從大豆基因組中鑒定出的GmTGA8 和GmTGA19 明顯抑制大豆花葉病毒的增殖，對大豆花葉病具有明顯基礎(chǔ)抗性[21]。在獼猴桃中瞬時過表達AcTGA01、AcTGA06、AcTGA07、AcTGA09 有利于增強獼猴桃對細(xì)菌性潰瘍病的抗病性，其中瞬時過表達AcTGA7的獼猴桃葉片中細(xì)菌積累量最少[22]。JAZ 和TGA 轉(zhuǎn)錄因子分別是JA 和SA 途徑的重要調(diào)控因子，JAZ3 基因瞬時沉默可以同時影響JA 和SA 的含量，推測JAZ 和TGA 間可能有一定關(guān)聯(lián)[10]。

番茄1 3 個J A Z 家族成員中， S l J A Z 1 ～ 1 2基因均受到Pst DC3000 的誘導(dǎo)，其中SlJAZ7 在PstDC3000 病原菌誘導(dǎo)3 h 的表達量顯著上調(diào)，瞬時沉默SlJAZ7 基因后植株感病性增加[12]，然而其中的分子機制尚未闡明。為進一步探索SlJAZ7 在番茄抗病性中的調(diào)控機制，本研究首先通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得過表達SlJAZ7 基因的轉(zhuǎn)基因番茄，接種PstDC3000 驗證其抗病功能，通過RT-qPCR 明確SlJAZ7 響應(yīng)Pst DC3000、JA 及SA 處理，通過Y2H 等試驗探索SlJAZ7 與SlTGA7 的關(guān)系，這將為進一步研究SlJAZ7 基因的作用機理和防治番茄細(xì)菌性斑點病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料種植與試劑

野生小果型番茄‘Micro-Tom’（MT） 和本氏煙草由海南大學(xué)海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點實驗室、熱帶作物生物育種國家重點實驗室（本實驗室） 保存，種植于26 ℃ 溫室中，培養(yǎng)條件為16 h 光照/8 h 黑暗。

2× Taq PCR 試劑（目錄號：KT201-02）、多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（目錄號：DP441） 購自天根生化科技（北京） 有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（目錄號：D2639A） 和SYBR Premix Ex Taq Kit（目錄號：DRR081A）、Clontech 酵母雙雜交試劑盒（目錄號：630489） 及酵母培養(yǎng)基購自寶生物有限公司；PCR 產(chǎn)物回收純化試劑盒（目錄號：DR02）、質(zhì)粒提取試劑盒（目錄號：PL03） 購自艾德萊生物有限公司； 大腸埃希菌感受態(tài)D H 5 α 、農(nóng)桿菌感受態(tài)LBA4404 和酵母Y2H Gold 感受態(tài)細(xì)胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；植物表達載體pGAMBIA1300-eGFP 由本實驗室改造保存。

1.2 SlJAZ7 基因克隆

在Phytozome 13（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/） 數(shù)據(jù)庫中選擇番茄數(shù)據(jù)庫S. lycopersicumITAG4.0，根據(jù)基因序列號Solyc11g011030 搜索得到SlJAZ7 的基因序列，設(shè)計全長引物（表1），利用PCR 擴增得到SlJAZ7 全長片段。

1.3 SlJAZ7 過表達番茄植株創(chuàng)制及鑒定

將MT 番茄種子消毒后培養(yǎng)7～10 d 長出2 片完整子葉，切下子葉，放入D600 nm=0.35～0.40 的農(nóng)桿菌懸浮液中侵染15 min，然后于20～22 ℃ 下避光共培養(yǎng)2 d。將外植體轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷，一定時間后轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基中，待長出4～5 cm 不定芽，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中。將再生苗移栽至裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中培養(yǎng)成苗。

為鑒定SlJAZ7 的轉(zhuǎn)基因陽性植株，采集野生型植株（WT） 及轉(zhuǎn)基因植株（OE） 的葉片，利用RTqPCR，以SlTublin （Solyc10g086760） 為內(nèi)參基因，參考寶生物公司SYBR Premix Ex Taq II Kit 說明書操作完成RT-qPCR 反應(yīng)，檢測SlJAZ7 在轉(zhuǎn)基因植株的表達量。

1.4 Pst DC3000 處理對照和轉(zhuǎn)基因番茄

Pst DC3000 菌液于KB 平板（25 μg/mL 利福平） 上劃線純化，挑取單菌落，使用10 mmol/L 氯化鎂溶液稀釋， 使懸浮液D 6 0 0 n m 為0 . 2 ， 加入0.025%（φ） 的表面活性劑，均勻噴灑至野生型植株（WT） 葉片和過表達SlJAZ7 植株（SlJAZ7-OE） 葉片正反面，23 ℃ 暗培養(yǎng)1 d 后轉(zhuǎn)入26 ℃ 培養(yǎng)房中正常培養(yǎng)3 d，拍照保存。

1.5 DAB 染色

使用純水溶解DAB 粉末，配置終質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的DAB 染色液，將葉片浸泡至染色液中，于錫箔紙中避光染色4 h。按照無水乙醇、甘油、冰醋酸的體積比為3∶1∶1 的比例配制成脫色液。將染色后的葉片放入脫色液中煮沸15 min，至葉片底色變白，棄脫色液，超純水清洗多次，拍照保存。

1.6 番茄樣本處理與采集

為了研究SlJAZ7 和SlTGA7 基因的組織表達模式，采集種植45 d MT 番茄的根、莖、葉、花和不同時期果實的樣品，液氮保存，備用。為了研究SlJAZ7 和SlTGA7 基因?qū)Σ煌{迫的響應(yīng)模式，生長期45 d 左右、生長勢一致的MT 幼苗被用于脅迫處理試驗，將2 mmol/L SA、100 μmol/L MeJA、D600 nm為0.2 的Pst DC3000 菌液噴施在葉片背面，于0、0.25、0.5、1、2、4、6、24 h 采集植株葉片。提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 作為模板，以SlTublin（Solyc10g086760） 為內(nèi)參基因，參考寶生物公司SYBR Premix Ex Taq II Kit 說明書操作完成RTqPCR反應(yīng)，儀器為Step-One Plus （ABI，USA），利用2? Δ Δ C t 計算相對表達量，使用GraphPad Prism8.0.1 軟件繪圖。

1.7 亞細(xì)胞定位分析

將去掉終止密碼子的SlJAZ7 和SlTGA7 基因的CDS 序列重組至pGAMBIA1300：eGFP 載體中，構(gòu)建3 5 S ： S l J A Z 7 ： e G F P ： p G A M B I A 1 3 0 0 、35S：SlTGA7：eGFP：pGAMBIA1300 植物表達載體。以pGAMBIA1300：eGFP 為對照，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞LBA4404，挑取單菌落活化至D600 nm 為0.4，濃縮至D600 nm 在0.8 左右，加入終濃度200 μmol/L 的乙酰丁香酮，混勻后室溫避光靜置3 h，注射煙草葉片下表皮細(xì)胞，48 h 后觀察綠色熒光蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.8 Y2H 驗證SlJAZ7 和SlTGA7 蛋白互作關(guān)系

將S l T G A 7 - p G B K T 7 質(zhì)粒與S l J A Z 7 -pGADT7 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至酵母感受態(tài)Y2H Gold 中，涂布酵母培養(yǎng)基DDO（SD/-Trp-Leu） 上，挑取單菌落，用pGADT7 和pGBKT7 的通用引物進行PCR 鑒定，得到陽性菌株后，用9 g/L 氯化鈉溶液重懸并調(diào)整菌液D600 nm 為0.002，9 g/L 氯化鈉溶液稀釋不同的濃度梯度，點至DDO/X/A（SD/-Trp-Leu/X-α-Gal/AbA）、QDO/X/A（SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal/AbA） 平板上培養(yǎng)3～5 d，觀察菌斑是否變藍(lán)，以驗證兩者是否存在互作。

1.9 BiFC 驗證互作關(guān)系

通過Sal I 和BamH I 內(nèi)切酶將已去掉終止密碼子的SlJAZ7 和SlTGA7 基因CDS 片段分別重組得到SlJAZ7：nYFP、SlTGA7：cYFP 載體，轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101（pSoup-p19），菌液經(jīng)PCR 鑒定正確后，將兩者與核定位標(biāo)記基因的農(nóng)桿菌按照1∶1∶1 的體積比混合均勻注射至煙草葉背面。3 d 后在共聚焦顯微鏡下觀察熒光。

1.10 pull down 試驗驗證蛋白互作關(guān)系

將番茄SlJAZ7 基因重組至pet28（a）-sumoflag、SlTGA7 重組至pet28（a）-sumo-strep 構(gòu)建原核表達載體（原核表達載體由本實驗室改造保存），經(jīng)測序正確后，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)Rosetta （DE3）中大量表達蛋白，使用IPTG 誘導(dǎo)提取細(xì)菌蛋白，BCA 法測定蛋白濃度[23]，經(jīng)Western blot 和考馬斯亮藍(lán)染色后檢測蛋白質(zhì)表達量。Input 組A、B 設(shè)置為等比例混合的SlJAZ7： pet28（a）-sumo-flag 和SlTGA7： pet28（a）-sumo-strep、SlJAZ7： pet28（a）-sumo-flag 和pet28（a）-sumo-strep 空載蛋白，IP 組設(shè)置為使用帶有flag 抗體的磁珠下拉處理過的上述蛋白，經(jīng)S D S - P A G E 驗證后分別使用f l a g 和strep 抗體孵育，檢測flag 和strep 標(biāo)簽的存在。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

定量數(shù)據(jù)均設(shè)計3 次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用Excel 表格對數(shù)據(jù)進行整理分析，使用公式2?ΔΔCt 計算相對表達量，以t 檢驗作為差異顯著性分析方法，使用GraphPad Prism 8.0.1 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達SlJAZ7 番茄的鑒定及表型分析

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系，創(chuàng)制穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因番茄植株，并通過R T -qPCR 鑒定獲得6 株陽性株系。所有過表達株系SlJAZ7-OE 中，SlJAZ7 的表達量均顯著高于野生型（WT），其中SlJAZ7 基因在OE5 株系表達量最高（圖1）。為研究SlJAZ7 基因在防御番茄細(xì)菌性斑點病中的功能，對W T 和S l J A Z 7 - O E 接種P s tDC3000，結(jié)果顯示，接種4 d 后，WT 和SlJAZ7-OE 葉片均產(chǎn)生黃色病斑，但是，WT 病斑的面積更大（圖2A）。

由于Pst DC3000 侵染會引起活性氧的積累，導(dǎo)致植物細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷。本研究使用DAB 染色檢測接種4 d 后番茄葉片中活性氧的積累。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DAB 染色后WT 葉片的黃褐色沉淀比SlJAZ7-OE 多而深，說明WT 較SlJAZ7-OE 積累了更多的活性氧（圖2B）。以上結(jié)果表明過表達SlJAZ7 基因減少了Pst DC3000 接種后番茄的活性氧積累，減輕了轉(zhuǎn)基因番茄的病癥。

2.2 番茄SlTGA7 和SlJAZ7 基因表達模式的比較

為了探究TGA 家族與JAZ 家族基因間的關(guān)系，前期通過RT-qPCR 研究了番茄TGA 轉(zhuǎn)錄因子家族13 個成員對Pst DC3000、SA 和JA 處理的響應(yīng)模式，結(jié)果顯示SlTGA7 （Solyc12g056860） 對PstDC3000、SA 和MeJA 都有響應(yīng)。在Pst DC3000和MeJA 處理下，SlTGA7 表達被顯著抑制，而在SA 處理下，SlTGA7 表達顯著上調(diào)，在6 h 時表達量達到最高（圖3A～3C）。與SlTGA 基因的表達模式不同，在Pst DC3000 處理0～24 h 內(nèi)，SlJAZ7 基因的表達量顯著上調(diào)。在M e J A 處理過程中SlJAZ7 基因表達量除6 h 顯著下調(diào)外，其余時間點均顯著上調(diào)。在SA 處理0.5、4 h 時，SlJAZ7 基因表達量顯著上調(diào)，2、6～24 h 時，SlJAZ7 表達量顯著下調(diào)（圖3D～3F）。

兩者的組織特異性表達分析結(jié)果顯示，SlTGA7基因在成熟紅果中的表達量最高，在根、莖和老葉等營養(yǎng)器官中也高表達（圖4A）；說明SlTGA7 可能參與番茄生殖和營養(yǎng)生長。SlJAZ7 在莖中的表達量最高，在老葉、幼葉、根中次之，在果和花中表達量最低，在營養(yǎng)器官中總體表達水平要高于生殖器官（圖4B），這表明SlJAZ7 可能主要在營養(yǎng)器官中發(fā)揮功能。利用R T - q P CR 檢測S l T G A 7 基因在SlJAZ7 過表達株系中的表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SlJAZ7過表達后，SlTGA7 基因的表達量均顯著高于野生型（圖5）；說明SlJAZ7 在轉(zhuǎn)錄水平的變化可以影響SlTGA7 的轉(zhuǎn)錄水平。

2.3 SlJAZ7 和SlTGA7 蛋白亞細(xì)胞定位

通過注射煙草下表皮細(xì)胞，使用共聚焦顯微鏡觀察。35S：eGFP：pGAMBIA1300 蛋白是質(zhì)膜共定位，而SlJAZ7 和SlTGA7 蛋白均在細(xì)胞核中呈現(xiàn)綠色熒光信號（圖6），與核定位Marker 的紅色熒光信號重疊后呈現(xiàn)黃色熒光，表明S l J A Z 7 和SlTGA7 蛋白定位于細(xì)胞核中，主要在細(xì)胞核中行使功能。

2.4 Y2H 驗證SlJAZ7 與SlTGA7 的互作關(guān)系

通過Y2H 點對點試驗驗證SlJAZ7 蛋白與SlTGA7 蛋白的互作關(guān)系。如圖7 所示，pGADT7-S l J A Z 7 與p G B K T 7 - S l T G A 7 在D D O / X /A 和QDO/X/A 平板上和陽性對照一樣，正常生長且變藍(lán)，而陰性對照沒有生長、變藍(lán)，表明SlJAZ7 和SlTGA7 蛋白可能存在互作。

2.5 BiFC 驗證SlJAZ7 與SlTGA7 的互作關(guān)系

分別將SlJAZ7：nYFP、SlTGA7：cYFP 菌液與核定位Marker 等比例混合后共注射至煙草中，于共聚焦顯微鏡的疊加場下觀察到細(xì)胞核中存在黃色熒光信號，與陽性對照nYFP、cYFP 載體一致。但是，SlJAZ7：nYFP/cYFP、SlTGA7：cYF/nYFP 無綠色熒光，這進一步證明SlJAZ7 和SlTGA7 蛋白可能在細(xì)胞核中共同發(fā)揮功能（圖8）。

2.6 pull down 驗證SlJAZ7 與SlTGA7 互作關(guān)系

將構(gòu)建的原核表達載體SlJAZ7-pet28（a）-sumo-flag 和SlTGA7-pet28（a）-sumo-strep 通過細(xì)菌表達蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE 電泳檢測蛋白相對分子質(zhì)量均正確，分別為41 280、51 590（圖9）。使用Flag 磁珠處理IP 組，一抗分別使用flag 和strep 抗體進行孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在試驗組和陰性對照組的Input 組和IP 組中均檢測到flag 標(biāo)簽蛋白，同時試驗組的Input 和IP 組也檢測到strep 標(biāo)簽，但在陰性對照IP 組中不存在strep 標(biāo)簽蛋白，進一步證明SlJAZ7 和SlTGA7 蛋白存在互作關(guān)系（圖10）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本研究通過轉(zhuǎn)基因番茄的抗病表型試驗，發(fā)現(xiàn)Pst DC3000 處理后SlJAZ7-OE 番茄葉片積累的H2O2 更少，說明過表達SlJAZ7 后番茄的抗病性增強。這與前期瞬時沉默SlJAZ7 基因后植株感病性增強的研究結(jié)果一致[12]，再次驗證了SlJAZ7 基因正調(diào)控番茄對細(xì)菌性斑點病抗性的結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)SlTGA7 基因在番茄SlJAZ7 過表達株系中均上調(diào)表達，證實了SlJAZ7 和SlTGA7 基因可能存在協(xié)同作用的推測。番茄TGA 轉(zhuǎn)錄因子通過與SA 受體及參與植物免疫的主要調(diào)節(jié)因子NPR1 相互作用，調(diào)節(jié)防御相關(guān)基因的表達來發(fā)揮作用[24]。擬南芥AtTGA1 和AtTGA4 與乙烯響應(yīng)因子ERF 互作調(diào)控植物抗逆性[ 2 5 ]。擬南芥AtTGA7 負(fù)調(diào)控下游AtBG1 基因的表達影響植物體內(nèi)ABA 含量，從而響應(yīng)干旱脅迫[26-27]。番茄SlTGA7 與擬南芥中廣泛參與SA 調(diào)控的抗病反應(yīng)基因AtTGA4、AtTGA7 聚在同一分支[24， 28-29]，猜測SlTGA7 可能也具有相似的功能。根據(jù)上述結(jié)果推測SlJAZ7 基因可能通過提高Pst DC3000 病原菌侵染時SlTGA7 基因的表達量，啟動SlTGA7 下游抗病基因的表達，從而提高SlJAZ7 轉(zhuǎn)基因番茄的抗病性。

MeJA 比JA 更穩(wěn)定，但與JA 作用相同，常被用來代替JA[30]。在對番茄JAZ 基因的表達分析中，發(fā)現(xiàn)幾乎所有SlJAZs 的表達都受到JA 和SA 的調(diào)節(jié)，因此，Sun 等[9] 推測SlJAZs 參與抗病的途徑可能與J A 和S A 激素密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)MeJA 處理0.5 h 時，SlJAZ7 基因表達量顯著上調(diào)，在1 h 時達到最大值，說明SlJAZ7 在JA 誘導(dǎo)的抗病反應(yīng)過程中屬于早期基因，與番茄SlJAZ11 基因的研究結(jié)果[30] 一致。在SA 處理過程中，SlJAZ7 表達響應(yīng)SA 的模式與JA 并不相同，大多處于相反狀態(tài)， S l T G A 7 基因?qū)? 種激素的響應(yīng)模式與SlJAZ7 基因相反，這與JA 與SA 信號之間存在拮抗的報道[31-32] 一致。JA 與SA 之間的協(xié)同作用表現(xiàn)在植物受到脅迫時，先激活JA 介導(dǎo)的防御基因，隨后激活SA 信號介導(dǎo)的防御基因的表達[ 3 3 ]。已知JAZ 基因家族在JA 信號通路起作用，TGA 基因家族在SA 信號通路起作用，正是因為JA 與SA 信號之間存在串?dāng)_，因此，我們猜測SlJAZ7 基因和TGA基因家族成員之間可能存在互作，共同調(diào)控番茄對Pst DC3000 的抗病性。

本研究通過組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)SlJAZ7和SlTGA7 在營養(yǎng)器官中都高表達，猜測兩者都在營養(yǎng)生長中發(fā)揮功能，SlTGA7 可能也參與果實發(fā)育。亞細(xì)胞定位顯示SlJAZ7 和SlTGA7 蛋白均定位于細(xì)胞核，兩者主要在細(xì)胞核中行使功能，這與SlJAZ7 和SlTGA7 基因家族的眾多同源基因的研究結(jié)果類似，如SlJAZ11[30]、SlJAZ25[9]、GmJAZ3[34]、SlTGA2[28]、AtTGA7[27] 均定位于細(xì)胞核中。JAZ 蛋白作為JA 反應(yīng)的抑制子，已報道可通過與蛋白結(jié)合形成特異性的JAZ/TF 復(fù)合物調(diào)控許多生理過程[35]，通常涉及到絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、氧化還原調(diào)節(jié)谷胱甘肽（GRX）、MYC2、PDF1.2、WRKY70 等[36]。植物體內(nèi)JA 含量高時，JAZ 抑制因子被泛素化降解，釋放轉(zhuǎn)錄因子，啟動JA 應(yīng)答基因的表達。植物體內(nèi)缺少JA 時，JAZ 蛋白抑制轉(zhuǎn)錄因子MYC2、MYC3、MYC4，從而抑制JA 應(yīng)答基因的表達[ 1 1 ]。本研究證明SlJAZ7 蛋白可以與SlTGA7 蛋白結(jié)合，猜測在SlJAZ7 過表達的番茄株系中，SlJAZ7 可能通過與SlTGA7 蛋白結(jié)合，影響SlJAZ7 與MYC2 等轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物的功能，繼而影響JA 應(yīng)答基因的表達。后期將細(xì)化轉(zhuǎn)基因番茄的抗病試驗，如通過在番茄中瞬時過表達及瞬時沉默SlTGA7 后接種Pst DC3000，檢測抗病相關(guān)基因如PR 基因的表達量，驗證SlTGA7 的抗病功能，以及對SlJAZ7 轉(zhuǎn)基因植株接種Pst DC3000，利用定量PCR 檢測SlTGA7 下游抗病相關(guān)基因的表達，檢測SlJAZ7 是否抑制SlTGA7 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

3.2 結(jié)論

為研究SlJAZ7 的抗病機理，從番茄葉片中克隆得到SlJAZ7 基因。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系創(chuàng)制番茄過表達SlJAZ7 轉(zhuǎn)基因株系，接種PstDC3000 后，發(fā)現(xiàn)過表達SlJAZ7 轉(zhuǎn)基因株系積累了更少的活性氧，表明過表達SlJAZ7 基因增強番茄對細(xì)菌性斑點病的抗性。表達模式分析發(fā)現(xiàn)SlJAZ7和SlTGA7 都響應(yīng)Pst DC3000、JA 和SA 處理，SlTGA7 在SlJAZ7 過表達的番茄株系中也高表達，說明SlJAZ7 在轉(zhuǎn)錄水平正調(diào)控SlTGA7 的表達。SlJAZ7 和SlTGA7 均定位于細(xì)胞核中，說明其主要在細(xì)胞核中行使功能。Y2H、BiFC 和pull down 試驗證明SlJAZ7 和SlTGA7 蛋白存在互作，猜測SlJAZ7 可能通過與SlTGA7 互作，在蛋白水平參與番茄對細(xì)菌性斑點病的調(diào)控。

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【責(zé)任編輯 李慶玲】