摘要： 【目的】偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV） 屬甲型皰疹病毒科，是一種嗜神經(jīng)性病毒，通過接觸傳播感染造成神經(jīng)和呼吸系統(tǒng)疾病。豬是PRV 的自然宿主，PRV 的感染和流行對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。PRV 侵染宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，引發(fā)神經(jīng)肽S（Neuropeptide S，NPS） 系統(tǒng)表達(dá)水平的改變。NPS 是一種神經(jīng)肽物質(zhì)，作為神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的關(guān)鍵成員在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，與慢性疾病相關(guān)聯(lián)，NPS 通過神經(jīng)肽S 受體（Neuropeptide S receptor，NPSR） 介導(dǎo)多樣化的生理功能，在機體內(nèi)以NPS/NPSR 系統(tǒng)形式共同參與神經(jīng)內(nèi)分泌?免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)。本研究探討了NPS/NPSR 系統(tǒng)在PRV 感染宿主細(xì)胞中的作用，以期待開發(fā)新的抗PRV 靶點。【方法】通過CRISPR/Cas9 構(gòu)建NPS 和NPSR 敲除的PK15 細(xì)胞系，利用qPCR、免疫熒光、Western blot、免疫共沉淀（CO-IP） 等方法檢測感染PRV 病毒后細(xì)胞系的抗病毒能力及NPSR 與病毒表面糖蛋白的結(jié)合能力?！窘Y(jié)果】NPSR 敲除能減弱PRV 對PK15 細(xì)胞的感染能力，而NPS 基因敲除增強了PRV 對PK15 細(xì)胞的感染能力。NPSR 敲除細(xì)胞在PRV 吸附過程中能減少病毒的侵入量，因此NPSR 是潛在的PRV 入侵受體。CO-IP 試驗證明，NPSR 與病毒包膜蛋白gB 和gD 存在相互作用?！窘Y(jié)論】NPSR 通過與病毒表面糖蛋白結(jié)合促進(jìn)PRV 感染，NPSR 可能是PRV 感染神經(jīng)系統(tǒng)的受體因子之一。NPSR 敲除能顯著抑制PRV 對PK15 細(xì)胞的感染。NPSR 可為開發(fā)PRV 防控藥物和治療策略提供新的研究靶點。

關(guān)鍵詞： 神經(jīng)肽S 受體；偽狂犬病病毒；病毒受體；宿主病毒相互作用

中圖分類號： S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1001-411X（2024）04-0457-12

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV） 又稱I 型豬皰疹病毒（Suid herpesvirus I），屬于α?皰疹病毒亞科，是具有包膜的雙鏈DNA 病毒，傳播范圍廣泛，能在宿主體內(nèi)快速復(fù)制[1]。PRV 能感染多種家畜、家禽和野生動物[2]，感染動物可在發(fā)病數(shù)天后死亡[3]。豬是PRV 的唯一自然宿主，主要病癥體現(xiàn)在呼吸及神經(jīng)性疾病，病毒感染病癥伴隨著豬的生長及種類有著不同的表現(xiàn)，其中仔豬致病率高，感染后出現(xiàn)高熱、腹瀉、精神萎靡及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，伴有呼吸衰竭，以死亡轉(zhuǎn)歸；育肥豬呼吸困難，生長停滯；成年豬感染后主要為呼吸道疾病；種豬表現(xiàn)為不育；妊娠母豬出現(xiàn)生殖系統(tǒng)疾病甚至流產(chǎn)，流產(chǎn)胎兒的肝、脾和肺等存在多種病變[4-6]。PRV 具有神經(jīng)性的傳播特征，主要通過鼻腔黏膜等上皮細(xì)胞進(jìn)入機體并通過周圍神經(jīng)逆行到三叉神經(jīng)感染呼吸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，然后在大腦和機體內(nèi)復(fù)制擴散[6-7]，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中建立潛伏感染[8]。目前已有研究報道PRV 具有人畜共患的風(fēng)險。自2011 年報道P RV 的變異株[ 8 - 9 ] 以來，已有多例人感染PRV 的病例，研究表明病豬可能是人感染PRV 的來源[10-11]。從感染者體內(nèi)分離的毒株hSD-1/2019 由多個PRV 變異株重組而來[12]，PRV 變異株可引起人的眼內(nèi)炎和腦炎[3， 13-14]。

PRV 入侵細(xì)胞需通過包膜糖蛋白與細(xì)胞受體間的級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)，主要是由gD、gB、gC、gH 和gL 幾種包膜糖蛋白介導(dǎo)。gB 糖蛋白是病毒包膜的重要結(jié)構(gòu)蛋白[15]。病毒侵入細(xì)胞時，gB 糖蛋白和細(xì)胞表面的硫酸肝素蛋白聚糖相互作用，并與gH、gL形成復(fù)合物共同調(diào)節(jié)細(xì)胞膜和病毒包膜的融合[16-17]。而gD 糖蛋白與細(xì)胞表面受體結(jié)合，促進(jìn)PRV 囊膜與靶細(xì)胞胞質(zhì)膜的快速融合，加速gB、gH、gL 復(fù)合物與細(xì)胞膜的滲透，將衣殼和病毒DNA 運輸至細(xì)胞內(nèi)[17-18]。許多研究表明與PRV 包膜主要糖蛋白作用的受體蛋白在病毒感染細(xì)胞時起重要作用，如宿主細(xì)胞受體Nectin-1 能與PRV 糖蛋白gD 結(jié)合介導(dǎo)PRV 進(jìn)入的過程[19]，THBS3 作為一種PRV 輔助受體，通過其N 和C 末端與PRV gD 相互作用促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞[20]。

PRV 感染宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，宿主的神經(jīng)肽S（Neuropeptide S，NPS） 系統(tǒng)發(fā)生表達(dá)水平的改變，NPS 是一個配體/受體相互作用的神經(jīng)肽系統(tǒng)，與炎癥反應(yīng)相關(guān)。另有研究顯示NPS 可以調(diào)節(jié)焦慮相關(guān)的神經(jīng)活動[21-23]。 NPS 是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的關(guān)鍵成員，與慢性炎癥性疾病相關(guān)聯(lián)，影響哺乳動物、嚙齒動物和一些鳥類動物的炎癥反應(yīng)、精神性狀、生育性狀[ 2 4 - 2 6 ] ， N P S 與其同源受體N P S R（Neuropeptide S receptor） 作用發(fā)揮生理活性[27]。NPS/NPSR 在腦中形成一個神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，在機體組織和大腦內(nèi)都廣泛表達(dá)。作為N P S 的受體，NPSR 在動物大腦內(nèi)廣泛分布，在皮層、丘腦、下丘腦和杏仁核中表達(dá)[23， 28]。研究發(fā)現(xiàn)外源性的NPS 能促使宿主感染PRV 后的病理癥狀加劇，而干擾NPSR 基因的表達(dá)后能有效減少PRV 的復(fù)制，降低病毒感染水平[28-29]，因此可將其作為潛在的PRV 的研究靶點。

PRV 嚴(yán)重影響生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，在生產(chǎn)中主要依賴于疫苗接種進(jìn)行防控，但是由于病毒的變異和毒力加強，造成疫苗保護力不足，PRV 目前依然是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要病原之一。本研究旨在探討NPS/NPSR 系統(tǒng)在PRV 感染中的作用，為防控PRV 開發(fā)新的藥物靶點和抗病育種候選位點。本研究利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除NPS 和NPSR 在PK15 細(xì)胞中的表達(dá)后，通過qPCR、IF、Westernblot 等技術(shù)檢測NPS 和NPSR 敲除（Knockout，KO） 細(xì)胞對PRV 的感染能力，并通過CO-IP 試驗檢測與N P SR 相互作用的病毒表面蛋白，闡明NPSR 在PRV 感染中的關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 材料

P K 1 5 細(xì)胞、H E K - 2 9 3 T 細(xì)胞、P R V 毒株（Genbank 登錄號：MT197597）、PX495-neo 質(zhì)粒、PCR 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒pMD-gE、pcDNA3.1 質(zhì)粒保存于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院國家生豬種業(yè)工程技術(shù)中心。采用PCR 或RT-PCR 擴增NPSR、NPS、PRV-gB、PRV-gD、PRV-gC、PRV-gH、PRV-gL 真核表達(dá)載體目的基因編碼區(qū)（CDS） 并克隆入pcDNA3.1質(zhì)粒。PK15 細(xì)胞、HEK-293T 細(xì)胞采用完全培養(yǎng)基[DMEM（GBICO）、10%（φ）FBS（viva cell）、1 % （ φ ） P e n i c i l l i n - S t r e p t o m y c i n S o l u t i o n （ p e nstrep）（GBICO）] 培養(yǎng)，于37 ℃、5%（φ）CO2 條件下培養(yǎng)。PRV 毒株于?80 ℃ 保存。本研究使用的抗體包括抗NPSR 抗體（Affinity）、抗PRV 抗體（abcam）、抗HIS 標(biāo)簽抗體（proteintech）、抗Flag 標(biāo)簽抗體（TRANSGEN Biotech）、抗Tubulin 抗體（PTMBIO）、抗Gapdh 抗體（TRANSGEN Biotech）、H R P 標(biāo)記的山羊抗小鼠I g G 二抗（ B B I L i f eSciences）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（BBI LifeS c i e n c e s ） 、A l e x a F l u o r 4 8 8 標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L） 二抗（Beyotime）。

1.2 方法

1 . 2 . 1 利用C R I S P R / C a s 9 系統(tǒng)構(gòu)建N P S 和NPSR 基因敲除的細(xì)胞系 本研究構(gòu)建了NPS 和NPSR 基因敲除的PK15 細(xì)胞。利用CRISPR 基因敲除原理設(shè)計靶向NPS 和NPSR 基因CDS 的sgRNA，sgRNA 序列及PCR 鑒定引物如表1 所示。合成sgRNA 序列并連接入CRISPR 打靶質(zhì)粒P X 4 9 5 - n e o 構(gòu)建相應(yīng)的基因打靶載體。進(jìn)行PK15 基因打靶時，轉(zhuǎn)染前在24 孔板鋪板PK15 細(xì)胞，細(xì)胞匯合度在60%～70% 時利用Lipofectamine3000（Thermo Fisher Scientific） 轉(zhuǎn)染0.5 μg 打靶質(zhì)粒/孔，在24 h 后將細(xì)胞梯度稀釋，利用600 μg/mL 的G418（MACKLIN） 篩選15 d 形成單細(xì)胞克隆，利用克隆環(huán)挑取單細(xì)胞克隆并擴大培養(yǎng)。對單細(xì)胞克隆逐個提取基因組DNA（Omega Bio-Tek），以引物NPS-F/R 和NPSR-F/R（表1）擴增NPS 和NSPR 打靶位點并測序鑒定基因型的變化。

1.2.2 病毒感染 細(xì)胞（PK15、NPSR-KO 和對照） 于37 ℃、5%（φ）CO2 培養(yǎng)條件下在24 孔板中培養(yǎng)，在100% 匯合度時以PBS（GIBCO） 清洗細(xì)胞3 次，加入無血清DMEM（GIBCO） 稀釋的PRV 感染細(xì)胞，1 h 后棄去病毒液，用PBS 清洗細(xì)胞3 遍，加入無血清的DMEM 培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后收集病毒上清液，利用病毒DNA/RNA 總核酸提取試劑盒（MAGEN） 提取病毒DNA，通過qPCR 分析細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒含量。同時收集下層細(xì)胞，采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR 分析細(xì)胞內(nèi)源基因的表達(dá)水平。

1.2.3 病毒吸附和內(nèi)化 （NPSR-KO 和對照） 于37 ℃、5 % （ φ ） C O 2 培養(yǎng)條件下在2 4 孔板中培養(yǎng)， 在100% 匯合度時分別加入MOI=5.0 和MOI=0.1 的病毒劑量進(jìn)行感染，將24 孔板放入4 ℃ 冰箱吸附1 h，每15 min 進(jìn)行手動混勻，1 h 后棄去病毒液并用PBS 清洗細(xì)胞3 次，并使用0.5 ng/mL 蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific） 和0.5 g/L Trypsin-EDTA （1×）（GIBCO） 清洗細(xì)胞3 次，減少表面多余病毒附著。而后裂解細(xì)胞抽提并檢測胞內(nèi)病毒DNA 含量，即為吸附的病毒量。檢測病毒內(nèi)化時，4 ℃ 吸附后將培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入37 ℃、5%（φ）CO2 條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h，裂解細(xì)胞檢測胞內(nèi)病毒DNA 含量，即為內(nèi)化水平。

1 . 2 . 4 免疫共沉淀 2 9 3 T 細(xì)胞在3 7 ℃ 、5%（φ）CO2 條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1 d 消化細(xì)胞均勻鋪于6 孔板中，在匯合度70% 時將pcDNA3.1-gBflag、pcDNA3.1-gD-flag、pcDNA3.1-gC-flag、pcDNA3.1-gH-flag、pcDNA3.1-gL-flag、pcDNA3.1-NPSR-His 和pcDNA3.1 質(zhì)粒利用Lipofectamine3000 共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染24 h 后按1∶100 的體積比加入PMSF（Beyotime） 及RIPA（Beyotime） 裂解液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)，加入抗HIS 標(biāo)簽抗體在4 ℃ 條件下進(jìn)行免疫沉淀，留取部分作為細(xì)胞總蛋白分析。12 h 后在免疫沉淀樣品中加入Pierce 蛋白磁珠（Thermo Fisher Scientific） 吸附抗體/蛋白復(fù)合物， 吸附2 h 后收集磁珠， 并將蛋白變性進(jìn)行Western blot 分析。

1.2.5 PCR 和qPCR 試驗中細(xì)胞基因組DNA 采用Tissue DNA Kit 試劑盒（Omega Bio-Tek） 提取，細(xì)胞總R N A 采用T R I z o l （ T h e r m o F i s h e rS c i e n t i f i c ） 法提取。病毒D N A 采用病毒DNA/RNA 總核酸試劑盒（MAGEN） 提取。檢測NPS/NPSR 基因敲除情況時，采用基因組DNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴增，PCR 程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃5 min。4 ℃ 保存。病毒DNA 含量采用TaqMan 探針法qPCR 進(jìn)行檢測，細(xì)胞內(nèi)源基因的mRNA 表達(dá)水平采用SYBR Green qPCR 進(jìn)行檢測。病毒qPCR 采用gE 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行絕對定量分析。目的基因mRNA 表達(dá)水平以GAPDH 作為內(nèi)參基因采用ΔΔCt 法進(jìn)行相對定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS19.0 進(jìn)行單因素方差分析或t 檢驗分析，P lt; 0.05 認(rèn)為存在顯著差異并有統(tǒng)計學(xué)意義。圖表采用GraphPad Prism 5 進(jìn)行繪制。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用CRISPR/Cas9 進(jìn)行NPS 和NPSR 基因敲除PK15 細(xì)胞的篩選

為驗證NPS 和NPSR 在PRV 感染后的表達(dá)情況，采用MOI=1.0 的PRV 對PK15 細(xì)胞進(jìn)行感染，在24 h 后收取感染細(xì)胞，提取總RNA 后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qPCR 檢測目的基因mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在攻毒后，PK15 細(xì)胞中的NPSR mRNA 表達(dá)量顯著下降（P lt; 0.001），而NPS mRNA 表達(dá)量則顯著上升（P lt; 0.001）（圖1），且利用Western blot 檢測NPSR 在蛋白水平變化趨勢（P lt; 0.05）（圖2、3）與NPSR mRNA 表達(dá)情況一致。表明PRV 感染顯著影響了NPS 和NPSR 的表達(dá)量。為了進(jìn)一步研究N P S / N P S R 對P RV 感染能力的影響，利用PK15 細(xì)胞進(jìn)行NPS/NPSR 基因敲除單克隆細(xì)胞的篩選。選取NPS/NPSRCDS 的20 個堿基片段構(gòu)建CRISPR/Cas9 打靶質(zhì)粒載體進(jìn)行基因敲除；結(jié)果如圖4 所示，NPS 基因敲除的單克隆細(xì)胞系在目標(biāo)sgRNA 處有1 或2 bp 純合堿基片段缺失，NPSR 基因敲除的單克隆細(xì)胞系在gRNA 位點處分別含有+1 bp 的純合插入和（+1/?1）bp 的雙等位基因變異。進(jìn)一步利用Western blot 檢驗NPSR 敲除細(xì)胞在蛋白水平的表達(dá)情況，通過選取經(jīng)過同樣篩選過程的野生型細(xì)胞（WT） 作為對照組，每組進(jìn)行3 次重復(fù)，結(jié)果（圖5） 顯示，NPSR 在KO2 細(xì)胞系的蛋白表達(dá)被完全敲除，而K O 3 細(xì)胞系殘留部分NPSR 蛋白，但是表達(dá)量相比于野生型明顯降低。

2.2 NPS/NPSR 基因敲除PK15 細(xì)胞對PRV 感染具有抗性

為了驗證NPS/NPSR-KO 細(xì)胞對PRV 感染能力的變化，我們對KO 細(xì)胞和野生型對照細(xì)胞進(jìn)行PRV 感染。以MOI=1.0 的PRV 感染細(xì)胞，24 h 后檢測細(xì)胞上清液中g(shù)E 拷貝數(shù)，作為培養(yǎng)上清液中的病毒載量指標(biāo)，結(jié)果如圖6 所示。病毒在NPSRKO細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)顯著降低（P lt; 0.001），有明顯的抗病毒效果（圖6A）；而NPS-KO 細(xì)胞內(nèi)的病毒感染量則顯著上升（P lt; 0.01）（圖6B）。為了進(jìn)一步驗證NPS/NPSR 對PRV 感染的影響，我們在細(xì)胞中過表達(dá)NPS 或NPSR 質(zhì)粒。NPS 和NPSR 過表達(dá)質(zhì)粒（NPS-OE、NPSR-OE） 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h 后再進(jìn)行PRV 感染（MOI=1.0），結(jié)果如圖6C 所示，過表達(dá)NPSR （NPSR-OE） 后病毒表達(dá)量上升（P lt; 0.05）。另外我們分別使用MOI=0.1 和MOI=1.0 檢測細(xì)胞在PRV 感染下的存活率，MOI=0.1 時，36 h 時野生型（WT） 對照組細(xì)胞死亡較多，敲除細(xì)胞存活率高且存在顯著差異（P lt; 0.05）；而MOI=1.0 時，野生型細(xì)胞存活率隨時間逐步下降，而NPSR-KO 細(xì)胞存活率相對較高且存在顯著差異（圖7）。在顯微鏡下可以觀測到，在PRV 感染下，野生型（WT） 對照組細(xì)胞死亡相比于敲除組（KO） 更加嚴(yán)重（圖8）。

2.3 免疫熒光驗證PRV 對NPSR 基因敲除細(xì)胞的感染能力

為了進(jìn)一步驗證PRV 在野生型（WT） 和敲除細(xì)胞內(nèi)的增殖情況，我們采用2 種感染復(fù)數(shù)MOI=1.0 （圖9A） 和MOI=0.1（圖9B） 感染PK15 細(xì)胞后進(jìn)行免疫熒光（IF） 染色。通過選取1 個野生型和2 個敲除型細(xì)胞，每組設(shè)置3 次重復(fù)，在細(xì)胞密度達(dá)到100% 時進(jìn)行PRV 感染，感染24 h 后進(jìn)行PRV 抗體IF 染色，利用倒置熒光顯微鏡采集圖片。在2 種MOI 感染的情況下，相比于WT 細(xì)胞，NPSR-KO 細(xì)胞的病變程度明顯減弱，蝕斑大小和細(xì)胞脫落都明顯降低，感染傳播范圍也較小。通過定量熒光細(xì)胞數(shù)量，NPSR-KO 細(xì)胞中PRV 陽性細(xì)胞數(shù)相比于WT 組顯著減少（P lt; 0.05） （圖10）。

2.4 NPS 和NPSR 敲除細(xì)胞感染PRV 后炎癥因子的表達(dá)量變化

NPS/NPSR 介導(dǎo)機體的炎癥反應(yīng)[30-31]，炎癥因子可以調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)并對外界病毒的入侵做出調(diào)節(jié)[32]。為了驗證敲除NPS/NPSR 后細(xì)胞調(diào)節(jié)病毒感染的機制，我們檢測IL-6、IFN-β 基因的表達(dá)水平，探究NPS/NPSR 敲除后免疫應(yīng)答相關(guān)因子的表達(dá)量變化。以MOI=0.1 的PRV 感染細(xì)胞24 h后，NPSR-KO 細(xì)胞中的IFN-β 表達(dá)水平相較野生型（WT） 細(xì)胞顯著降低（P lt; 0.001），WT 和NPSKO細(xì)胞的IFN-β 表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異（圖11A、11B）。在IL-6 的表達(dá)上，感染病毒后的NPSRKO細(xì)胞的IL-6 表達(dá)水平顯著下降（P lt; 0.01），而NPS-KO 細(xì)胞的IL-6 表達(dá)水平顯著上升（P lt; 0.01）（圖11C、11D）。這些結(jié)果顯示NPSR 或NPS 基因敲除后，免疫相關(guān)因子的表達(dá)并沒有預(yù)期的變化（提升IFN-β 水平以抑制病毒感染），因此可能存在其他信號通路調(diào)節(jié)NPS/NPSR對PRV 的感染能力。

2.5 NPSR 基因敲除影響PRV 病毒吸附

PRV 通過病毒包膜糖蛋白與細(xì)胞受體的相互作用入侵宿主細(xì)胞。皰疹病毒的糖蛋白gD、gB 與多種宿主表面蛋白在入侵過程中相互作用將病毒輸入細(xì)胞質(zhì)[19， 33]。為了解NPSR 蛋白是否在病毒吸附及內(nèi)化過程中起作用，我們選取MOI=5.0 的高病毒量和MOI=0.1 的低病毒量進(jìn)行PRV 感染，吸附試驗中，感染病毒后將細(xì)胞放入4 ℃ 孵育，定時輕搖保證病毒充分吸附，1 h 后收取細(xì)胞提取胞內(nèi)病毒DNA 進(jìn)行qPCR 分析。與吸附試驗采取相同感染復(fù)數(shù)進(jìn)行病毒感染，4 ℃ 吸附1 h 后放入37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h 促進(jìn)病毒內(nèi)化，之后收集細(xì)胞提取胞內(nèi)病毒DNA 進(jìn)行qPCR 分析。結(jié)果顯示，在低病毒感染復(fù)數(shù)條件下，NPSR-KO 細(xì)胞吸附的病毒量顯著減少（P lt; 0.01），而在內(nèi)化過程中則沒有顯著的差異（圖12）。細(xì)胞在吸附水平的病毒量下降說明NPSR 蛋白在病毒入侵過程中起重要作用，NPSR 可能與病毒胞膜蛋白相互作用介導(dǎo)PRV感染。

2.6 NPSR 通過與PRV 表面糖蛋白相互作用影響病毒感染

在P R V 入侵過程中主要糖蛋白g D 誘導(dǎo)gH/gL 蛋白復(fù)合物的相互作用，進(jìn)而激活融合蛋白gB 進(jìn)行質(zhì)膜融合[34]，有研究顯示gD 突變體能顯著提高PRV 的吸附和內(nèi)化能力[35]。在病毒入侵過程中多種病毒表面糖蛋白起重要作用，而宿主細(xì)胞表面的潛在受體蛋白通過與病毒表面糖蛋白相互作用介導(dǎo)病毒入侵，敲除或敲低受體蛋白能降低病毒對宿主細(xì)胞的感染能力。我們采用免疫共沉淀（CO-IP） 試驗檢測NPSR 和病毒表面糖蛋白的相互作用。試驗選擇病毒包膜糖蛋白g B 、g D 、g H 、gL 和gC，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒且攜帶FLAG 標(biāo)簽位點。同時構(gòu)建NPSR-HIS 真核表達(dá)質(zhì)粒，以HIS 標(biāo)簽和FLAG 標(biāo)簽作為檢測方式。利用293T 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2 種質(zhì)粒，分別設(shè)立對照組和試驗組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在36 h 后收取樣品，一部分用HIS 標(biāo)簽抗體進(jìn)行CO-IP 試驗，剩余樣品用于INPUT 對照，抗體孵育完畢后加入磁珠對抗體?抗原結(jié)合物進(jìn)行下拉，收集磁珠進(jìn)行蛋白變性，將2 種不同處理的樣品收集后進(jìn)行Western blot 試驗。糖蛋白gB、gD 和gH 能被抗體下拉，因此存在與NPSR 蛋白的互作，暗示NPSR 可能通過與gB、gD 和gH 結(jié)合介導(dǎo)PRV 入侵細(xì)胞的過程。其中g(shù)B 和gD 與NSPR 作用較強，而gH 與NSPR作用較弱（圖13A～13C）。gL、gC 與NPSR 沒有互作（圖13D、13E）；可能原因是gL 與gB 形成蛋白復(fù)合體發(fā)揮作用，單獨的gL 并不能與受體互作，而gC 則是與細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸肝素蛋白聚糖相互作用附著在細(xì)胞上。為了進(jìn)一步驗證采用雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的CO-IP 試驗結(jié)果，我們檢測內(nèi)源性NSPR 和PRV 糖蛋白的結(jié)合情況，通過分別在PK15 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Flag 標(biāo)記的gB、gD、gH、gL 和gC 表達(dá)質(zhì)粒，用Flag 標(biāo)簽進(jìn)行COIP檢測，結(jié)果（圖14） 顯示，內(nèi)源性的NPSR 能被gB 和gD 下拉。由于gH 與NPSR 相互作用較弱，因此內(nèi)源性的NPSR 可能較難與gH 進(jìn)行CO-IP。這里的結(jié)果與雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染結(jié)果一致，證實了gB 和gD與NSPR 的相互作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

自發(fā)現(xiàn)PRV 以來，通過撲殺消毒、疫苗接種等多種方法漸漸杜絕了PRV 在家豬中的廣泛流行，但隨著病毒變異和毒力加強，近年來PRV 不時卷土重來，甚至已經(jīng)蔓延到其他物種[1]。Bartha-K61疫苗株廣泛用于預(yù)防PRV，而自2011 年以來，PRV變異株開始在全國范圍內(nèi)傳播，由于傳統(tǒng)疫苗的保護力下降使得PRV 防控變得困難。由于PRV 感染的嗜神經(jīng)性，因此宿主神經(jīng)系統(tǒng)的一些蛋白可能在介導(dǎo)P RV 感染和傳播過程中起關(guān)鍵作用[ 3 ， 5 ] 。NPS 是由20 個氨基酸組成的神經(jīng)肽[23]。NPS 通過與其受體N P SR 結(jié)合介導(dǎo)多樣化的生理功能。NPS/NPSR 系統(tǒng)在調(diào)節(jié)中樞和外周神經(jīng)功能中都起著重要作用[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)NPS/NPSR mRNA 在豬的各組織中也廣泛表達(dá)，且與人相同，在多種生理功能中發(fā)揮重要作用，如NPS 可能是有效的神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)因子，通過NPSR 誘導(dǎo)慢性炎癥，并通過募集依賴性炎癥單核細(xì)胞形成一個持續(xù)的反饋循環(huán)，影響免疫穩(wěn)態(tài)的維持[30]。本研究在體外培養(yǎng)細(xì)胞上探討了NPS/NPSR 系統(tǒng)在PRV 感染過程中的作用，為PRV 防控提供新的研究靶點。

Li 等[29] 研究表明在干擾NPSR 后細(xì)胞的抗病毒能力上升，說明基因?qū)用娴男揎椏梢栽黾铀拗鲗Σ《镜目剐?。我們選擇C R I S P R / C a s 9 系統(tǒng)對NPS/NPSR 基因在PK15 細(xì)胞中進(jìn)行敲除，建立了穩(wěn)定的N P S / N P S R - KO 細(xì)胞系，對細(xì)胞系進(jìn)行PRV 感染，結(jié)果表明在NPSR-KO 細(xì)胞中PRV 的感染能力顯著下降，但NPS-KO 細(xì)胞反而促進(jìn)病毒的復(fù)制，存在與NPSR-KO 細(xì)胞相反的作用。進(jìn)一步研究顯示，PRV 感染后，NPSR-KO 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞病變效應(yīng)明顯減少， 細(xì)胞的存活率也相對較高。

PRV 抗體的免疫熒光檢測也表明NPSR-KO 細(xì)胞對PRV 感染具有抗性。我們探討的NPSR 影響PRV 感染的機制與前人研究不同，Li 等[ 2 9 ] 顯示NPSR/NPS 系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)宿主的先天免疫系統(tǒng)影響病毒復(fù)制，但是我們通過檢測相關(guān)免疫因子并未發(fā)現(xiàn)與預(yù)期一致的變化。進(jìn)一步研究顯示，NPSR 可以與多種PRV 表面糖蛋白相結(jié)合，考慮到PRV 對神經(jīng)系統(tǒng)的嗜性，并且其為膜蛋白，我們猜測NPSR 是PRV 感染神經(jīng)系統(tǒng)的輔助受體因子。因此NPSR 可以為開發(fā)PRV 及其他皰疹病毒感染的防控藥物和治療策略提供新的靶點。

PRV 的感染主要分為4 個不同階段：1） 病毒吸附細(xì)胞；2） 病毒內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞；3） 病毒基因組復(fù)制；4） 病毒釋放。通過不同病毒感染復(fù)數(shù)檢測PRV 在NPSR-KO 細(xì)胞上的吸附和內(nèi)化能力，可以看到在吸附階段，較低感染復(fù)數(shù)情況下，病毒吸附結(jié)合能力明顯減弱，與WT 細(xì)胞存在顯著差異。這個結(jié)果顯示PRV 可能與較多的細(xì)胞表面蛋白結(jié)合，因此高滴度感染造成病毒的飽和吸附，掩蓋了NPSR 缺失造成的少量降低。上述研究表明NPSR可能與PRV 包膜糖蛋白存在潛在結(jié)合，在病毒入侵階段起作用。在預(yù)計的結(jié)合蛋白gD、gB、gC、gH、gL 中，通過CO-IP 檢測到gB 和gD 與NPSR存在較強的相互作用。NPSR 的敲除減少了病毒糖蛋白與靶細(xì)胞的識別及入侵能力，從而降低了PRV 對宿主細(xì)胞的感染。

3.2 結(jié)論

本研究結(jié)果表明NPSR 是PRV 感染PK15 細(xì)胞的宿主因子， NPSR 可以與PRV 表面糖蛋白gB 和gD 相結(jié)合促進(jìn)病毒感染。NPSR 基因敲除降低PRV 對PK15 細(xì)胞的感染能力，但NPS 敲除細(xì)胞對PRV 感染沒有抑制效果。本研究證明了NPSR的表達(dá)與PRV 感染的相關(guān)性，為PRV 防控和抗病育種提供有效的研究靶點和候選基因位點。

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【責(zé)任編輯 李慶玲】