摘 要：為評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測 T 細(xì)胞受體剪切環(huán)（TREC）時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法或自動(dòng)閾值法對(duì)不同操作批次重復(fù)檢測結(jié)果穩(wěn)定性的影響，采用同一批次TREC檢測試劑盒重復(fù)檢測標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中內(nèi)參基因與靶標(biāo)TREC的Ct值，同時(shí)重復(fù)檢測一組TREC低值樣本的Ct值；分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和自動(dòng)閾值法對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行分析，比較兩種分析方法得到結(jié)果（Ct值）的穩(wěn)定性。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和TREC低值樣本的檢測結(jié)果表明，兩種分析方法得到的Ct值與兩個(gè)靶標(biāo)的標(biāo)稱濃度（log10）均呈線性相關(guān)，R²為1.00。兩種方法獲得標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中內(nèi)參基因Ct平均值，標(biāo)準(zhǔn)曲線法較自動(dòng)閾值法平均低1.26，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中TREC基因Ct平均值，前者較后者平均低0.96。對(duì)TREC低值樣本重復(fù)檢測結(jié)果表明，同一樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得的兩種靶標(biāo)Ct值的變異系數(shù)（CV）和極差均低于自動(dòng)閾值法。表明在以實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測TREC靶標(biāo)從而進(jìn)行重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的篩查時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法的分析結(jié)果穩(wěn)定性優(yōu)于自動(dòng)閾值法。

關(guān)鍵詞：重癥聯(lián)合免疫缺陷；T細(xì)胞受體剪切環(huán)；實(shí)時(shí)熒光PCR；標(biāo)準(zhǔn)曲線

中圖分類號(hào)：Q819

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Influence of standard curve method and automatic threshold method on the stability of TREC test results

XU Weijia， SHI Lin， ZHAO Shumin， LU Daru

（School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200433， China）

Abstract： To evaluate the effects of standard curve method or automatic threshold method on the results stability of repeated detection in different batches when real-time fluorescent PCR was used to detect T-cell receptor excision circles （TREC）. Ct values of reference gene and target TREC in standard plasmid were repeatedly detected with the same batch of TREC detection kit， and Ct values of a group of samples with low TREC value were repeatedly detected. Standard curve method and automatic threshold method were used to analyze the detection results respectively， and the stability of the results （Ct value） obtained by the two analysis methods was compared. The detection results of standard plasmid and TREC samples with low value show that the Ct values obtained by the two analysis methods were linearly correlated with the nominal concentration （log10） of the two targets， R² was 1.00. The average Ct values of reference genes in standard plasmid were obtained by the two methods. The average Ct values of TREC gene in standard plasmid using standard curve method were 1.26 lower than those using automatic threshold method， and the average Ct values of TREC gene in standard plasmid using standard curve method were 0.96 lower than those using automatic threshold method. The results of repeated detection of low-value TREC samples show that the coefficient of variation （CV） and range of Ct values of two targets obtained by standard curve method in the same sample were lower than those obtained by automatic threshold method. The findings indicate that the stability of the standard curve method was better than the automatic threshold method when the TREC target was detected by real-time fluorescent PCR for screening severe combined immunodeficiency （SCID）.

Key words： severe combined immunodeficiency （SCID）; T-cell receptor excision circles （TREC）; real-time fluorescent PCR; standard curve

在T細(xì)胞成熟過程中，每產(chǎn)生一種T細(xì)胞受體（TCR），均伴隨一個(gè)TCR剪切環(huán)（TREC）的形成，且TREC不隨細(xì)胞的分裂而復(fù)制［1-2］。因此，TREC檢測（TREC assay）被廣泛應(yīng)用于T細(xì)胞缺陷相關(guān)的新生兒先天性重癥聯(lián)合免疫缺陷（SCID）的篩查［2-4］。在T細(xì)胞缺陷相關(guān)的SCID中，由于T細(xì)胞成熟障礙， TCR受體形成受阻，在新生兒血樣中往往無法檢出足量的TREC［3，5］。目前已有相應(yīng)的商品化TREC檢測試劑盒，如PE公司的EnLiteTM Neonatal TREC Kit ［6］，ThermoFisher公司的TaqManTM SCID/SMA Plus 測定試劑盒［7］，但學(xué)界在TREC的量綱以及檢測技術(shù)方法等諸多方面仍存在爭議。如KWOK等［8］探討了TREC檢測中，兩種不同量綱（copies/μL、copies/106cells）的合理性。在方法學(xué)上，EnLiteTM Neonatal TREC Kit對(duì)待檢樣本中內(nèi)參基因和TREC同時(shí)進(jìn)行絕對(duì)定量的方法，并以copies/105 cells為量綱進(jìn)行結(jié)果報(bào)告［9］；而TaqManTM SCID/SMA Plus 測定試劑盒是以定性方式進(jìn)行結(jié)果報(bào)告，即以TREC無法檢出作為陽性結(jié)果［10］。國內(nèi)亦有公司開發(fā)了基于多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的TREC試劑盒。對(duì)于大部分基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)的IVD產(chǎn)品，例如SARS-COV-2檢測試劑盒，檢測中是以擴(kuò)增信號(hào)陽性作為臨床陽性結(jié)果，當(dāng)Ct值大于35時(shí)判為陰性；而SCID的檢測與此相反，患兒通常存在TREC缺失，則在實(shí)時(shí)熒光PCR檢測時(shí)以加入足夠擴(kuò)增模板的情況下Ct值仍大于35作為陽性結(jié)果［11］。因此，對(duì)TREC檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷時(shí)，不同的分析方案（如使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，或采用熒光PCR儀的自動(dòng)閾值分析法）對(duì)最終檢測結(jié)果判定的影響可能將無法忽略。在本研究中，采用一種TREC檢測試劑盒，評(píng)估了在基于實(shí)時(shí)熒光PCR平臺(tái)的TREC檢測中，兩種不同分析方案對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒以及TREC低值樣本檢驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，以期為TREC在新生兒SCID篩查的方法學(xué)構(gòu)建提供一定借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試劑采用TREC-KREC 聯(lián)合檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光定量PCR法）（上海晶準(zhǔn)生物醫(yī)藥有限公司），儀器選取實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ThermoFisher Scientific Inc.，型號(hào)Applied Biosystems^TM 7500）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備及檢測方案

該試劑盒包含一個(gè)內(nèi)參基因與TREC拷貝比為1∶1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。依據(jù)質(zhì)粒的質(zhì)量濃度和分子量，將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒稀釋至2×10⁷ copies/μL，并命名為S7。將S7和水按1∶10的比例進(jìn)行梯度稀釋，分別稀釋至2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴、2×10³和2×10² copies/μL，依次命名為S6、S5、S4、S3、S2，每個(gè)PCR反應(yīng)加入1 μL標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。各梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒均進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)，4個(gè)實(shí)驗(yàn)批次，6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒濃度梯度共計(jì)可測得72個(gè)檢測數(shù)據(jù)。

1.2.2 低值樣本制備及檢測方案

本研究所涉及的TREC低值樣本信息與檢測方案見表1。其中TL1人組織樣本DNA中不含TREC，而TL2成年志愿者外周血DNA中的TREC水平低于試劑盒標(biāo)示的最低檢出限，二者均與標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒稀釋液S2進(jìn)行混合，制備成終質(zhì)量濃度為100 ng/μL TREC低值樣本。剩余4例樣本所用的成年人志愿者外周血DNA均已進(jìn)行TREC定量檢測，根據(jù)TREC檢測值分別使用人組織樣本DNA進(jìn)行稀釋，制備成終質(zhì)量濃度為100 ng/μL的TREC中低值樣本。制備完成的6例樣本DNA質(zhì)量濃度均為100 ng/μL，以保證每例樣本檢測中，內(nèi)參基因定量結(jié)果基本一致。依據(jù)產(chǎn)品說明書，每個(gè)PCR反應(yīng)起始模板量為200 ng，按1 ng基因組DNA約150個(gè)細(xì)胞［12］，則每個(gè)PCR反應(yīng)中的內(nèi)參基因的理論值約為6×10⁴拷貝/反應(yīng)。每次測試都設(shè)置空白對(duì)照，空白對(duì)照每次上機(jī)做3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.3 獲得Ct值

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線法

以S2至S7共6個(gè)梯度的質(zhì)粒樣本作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用軟件Real-Time PCR Software v2.4構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。水平閾值線設(shè)定在標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)R²為1.000且空白對(duì)照（H₂O）的Ct值大于35或無信號(hào)，由此得到樣本TL1～TL6的Ct值，記作Ct-SC?；€的設(shè)置采用AUTO模式。

1.3.2 自動(dòng)閾值法

將S2至S7共6個(gè)梯度的質(zhì)粒樣本與樣本TL1～TL6均作為待測樣本，水平閾值線、基線范圍設(shè)置均采用熒光定量PCR儀的自動(dòng)分析模式，此時(shí)得到的各檢測樣本的Ct值記作Ct-AUTO。自動(dòng)分析模式下，NTC（H₂O）的Ct值均大于35或無信號(hào)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒檢測結(jié)果分析

分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在標(biāo)準(zhǔn)曲線法和自動(dòng)閾值法下獲得的Ct值的均值與標(biāo)準(zhǔn)差，采用GraphPad Prism（版本號(hào)8.0.2.263）對(duì)兩種分析方法得到的Ct值與各標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的標(biāo)稱濃度作線性相關(guān)分析，得到兩種分析方法下的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的擴(kuò)增效率。

1.4.2 TREC低值樣本檢測結(jié)果的穩(wěn)定性分析

分別計(jì)算每個(gè)TREC低值樣本在4個(gè)操作批次共20次測量中，兩種分析方法得到的內(nèi)參基因與TREC的Ct值的變異系數(shù)（CV），并計(jì)算各樣本根據(jù)兩種分析方法得到的4個(gè)操作批間Ct值的極差。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 兩種分析方法得到的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒樣本的檢測結(jié)果

各標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的Ct-SC與Ct-AUTO的均值（AVE）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）與變異系數(shù)（CV）見表2、表3。對(duì)于內(nèi)參基因IR，各標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的Ct-AUTO相較Ct-SC平均增加1.26；對(duì)于TREC，各標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的Ct-AUTO相較Ct-SC平均增加0.96。依據(jù)表2、表3，分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線法與自動(dòng)閾值法分析模式下的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。依據(jù)擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，計(jì)算內(nèi)參基因在標(biāo)準(zhǔn)曲線法和自動(dòng)分析模式下的擴(kuò)增效率分別為100.5%和100.1%，TREC的擴(kuò)增效率分別為100.1%和99.3%，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品S7起始模板量2×107 拷貝/反應(yīng)及低濃度標(biāo)準(zhǔn)品S2起始模板量2×10² 拷貝/反應(yīng)均在正常擴(kuò)增范圍內(nèi)。

2.2 不同分析方法對(duì)低值樣本Ct值CV影響

6例TREC低值樣本，每例樣本各20次測量，兩種靶標(biāo)測量結(jié)果（以Ct值表示）的CV見圖2。

兩種不同的分析方案，同一樣本、兩種靶標(biāo)、不同分析方法、操作批間的Ct值CV均＜5%，這一結(jié)果符合我國對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒穩(wěn)定性的基本要求［13-14］。標(biāo)準(zhǔn)曲線分析模式下內(nèi)參基因IR的Ct值的CV均小于1%，在AUTO模式下內(nèi)參基因IR的Ct值的CV均介于2%～3%之間，各樣本中，相同靶標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法獲得的Ct值CV均小于自動(dòng)閾值法獲得Ct值的CV。

2.3 不同分析方法對(duì)Ct值變化的影響

TL1～TL6樣本各20次測量，不同分析方法對(duì)兩種靶標(biāo)Ct值測量結(jié)果的影響見表4和圖3。對(duì)內(nèi)參基因IR，SC分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于0.33～0.46之間；AUTO分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于1.42～1.62之間。對(duì)于靶標(biāo)TREC，SC分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于0.44～1.18之間；AUTO分析模式下，各樣本不同操作批間均值的極差介于2.15～3.03之間。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)因其操作簡便、成本低廉，而被廣泛應(yīng)用于臨床診斷試劑盒的開發(fā)［15-17］，采用這一技術(shù)方案所開發(fā)的試劑盒，依據(jù)其檢測目的分為定量檢測和定性檢測兩大類［18］。以病毒核酸的檢測，如2019-nCoV的核酸定性檢測為例，由于病毒核酸相對(duì)于感染宿主為外源核酸［19］，在定性檢測時(shí)通常以Ct值小于35為陽性［11］；在定量檢測時(shí)則需要制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如HBV［20］、HCV［21］以及甲型與乙型流感病毒［12］的定量檢測，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)病毒核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量［18］。

研究表明，TREC作為一種游離于基因組DNA之外的內(nèi)源核酸靶標(biāo)，在SCID的篩查中具有重要的應(yīng)用價(jià)值［3，8，22-23］。但與病毒等外源核酸以檢出靶核酸信號(hào)作為陽性判斷結(jié)果不同，在新生兒樣本中，當(dāng)TREC含量極低或無TREC信號(hào)時(shí)，代表可能患有T細(xì)胞缺陷相關(guān)的SCID［3，5，24］。這對(duì)基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的TREC檢測的靈敏度與穩(wěn)定性提出了更高的要求，因?yàn)闊晒鈹U(kuò)增信號(hào)陰性既與反應(yīng)體系中是否加入足夠的待測模板有關(guān)，又與熒光擴(kuò)增信號(hào)的判斷，尤其是水平閾值線的確定方法密切相關(guān)，對(duì)于擴(kuò)增信號(hào)處于臨界水平的樣本更是如此。

本研究首先以梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒評(píng)價(jià)了一種TREC檢測試劑盒的線性范圍以及對(duì)內(nèi)參基因IR和TREC的擴(kuò)增效率。結(jié)果顯示這一實(shí)時(shí)熒光定量檢測系統(tǒng)，在標(biāo)準(zhǔn)曲線法以及自動(dòng)水平閾值分析模式下，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的內(nèi)參基因IR與靶基因TREC的擴(kuò)增效率無顯著差異。無論是對(duì)IR還是TREC，自動(dòng)閾值法得到的Ct均值大于標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到的Ct均值。Ct值的增加意味著對(duì)相應(yīng)靶標(biāo)定量結(jié)果的低估，對(duì)最終定性結(jié)果可能存在影響。

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)不同分析方法對(duì)實(shí)際樣本檢測結(jié)果的影響，采用成年志愿者外周血DNA以及人組織DNA與低值標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒稀釋液模擬了TREC的低值樣本，通過技術(shù)重復(fù)與操作批間重復(fù)，比較了標(biāo)準(zhǔn)曲線法與自動(dòng)閾值法兩種分析方案對(duì)檢測結(jié)果穩(wěn)定性的影響。兩種分析方案下，各樣本內(nèi)參基因IR與靶基因TREC的Ct值的CV均滿足我國對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒穩(wěn)定性的基本要求［13-14］。但I(xiàn)R靶標(biāo)和TREC靶標(biāo)的同一樣本由標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到結(jié)果的CV均小于由自動(dòng)閾值法得到結(jié)果的CV，且不同樣本初始模板量（均為200 ng/反應(yīng)）相同，不同樣本的內(nèi)參基因IR的檢測結(jié)果理論值應(yīng)相同，標(biāo)準(zhǔn)曲線分析模式下內(nèi)參基因IR的Ct值的CV均小于AUTO模式下的CV，這種分析結(jié)果的差異唯一影響因素是分析方法，反映出不同分析方法對(duì)檢測結(jié)果穩(wěn)定性的影響。

為進(jìn)一步研究分析方法對(duì)操作批間穩(wěn)定性的影響，比較了同一樣本不同操作批間不同分析方案得到的Ct值均值的極差的變化，不論是內(nèi)參基因IR還是靶基因TREC，SC分析模式下得到結(jié)果的極差均小于AUTO分析模式下結(jié)果的極差。對(duì)于內(nèi)參基因IR的Ct值，AUTO分析模式下的極差介于1.42～1.62之間，由于內(nèi)參基因IR是用于標(biāo)定加入反應(yīng)體系中的細(xì)胞數(shù)量，這一結(jié)果表明，即使是同一樣本，AUTO分析模式下不同的操作批間獲得的細(xì)胞數(shù)量的標(biāo)定結(jié)果也將相差2～3倍。而對(duì)于TREC的Ct值，AUTO分析模式下的極差介于2.15～3.03之間，每差一個(gè)Ct值代表PCR相差一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，基因拷貝數(shù)會(huì)呈倍數(shù)變化，這表明即使是對(duì)于同一樣本，AUTO分析模式下不同的操作批間靶基因的定量（拷貝數(shù)）也將相差4～8倍。更重要的是，對(duì)于TREC低值樣本，AUTO分析模式下的這樣的批間差，將可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明，對(duì)于類似TREC的內(nèi)源基因組以外的靶基因的檢測，以擴(kuò)增信號(hào)陰性作為陽性判斷結(jié)果時(shí)，配備標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定擴(kuò)增熒光信號(hào)的水平閾值線，對(duì)檢測結(jié)果的判斷是必要的，有利于降低假陽性結(jié)果的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：

［1］AL-HARTHI L， MARCHETTI G， STEFFENS C M， et al. Detection of T cell receptor circles （TRECs） as biomarkers for de novo T cell synthesis using a quantitative polymerase chain reaction-enzyme linked immunosorbent assay （PCR-ELISA）［J］. Journal of Immunological Methods， 2000， 237（1/2）： 187-197.

［2］MONGKONSRITRAGOON W， HUANG J， FREDRICKSON M， et al. Positive newborn screening for severe combined immunodeficiency： what should the pediatrician do？［J］. Clinical Medicine Insights： Pediatrics， 2023， 17： 11795565231162839.

［3］DASOUKI M， JABR A， ALDAKHEEL G， et al. TREC and KREC profiling as a representative of thymus and bone marrow output in patients with various inborn errors of immunity［J］. Clinical and Experimental Immunology， 2020， 202（1）： 60-71.

［4］PEREZ E. Future of therapy for inborn errors of immunity［J］. Clinical Reviews in Allergy amp; Immunology， 2022， 63（1）： 75-89.

［5］CHAN K E， PUCK J M. Development of population-based newborn screening for severe combined immunodeficiency［J］. Journal of Allergy and Clinical Immunology， 2005， 115（2）： 391-398.

［6］PerkinElmer Inc. Earlier detection with complete range of screening assays for NBS disorders[EB/OL]. （2011-12-13）[2023-09-13]. https：//perkinelmer.cl/wp-content/uploads/2018/05/bro_general_newborn_screening_complete_solutions_1244-1216-16_lores_spreads-1.pdf.

［7］Thermo Fisher Scientific Inc. User Guide： TaqMan SCID/SMA Plus Assay[EB/OL]. （2015-04-05）[2023-09-18]. https：//assets.thermofisher.com/TFS-Assets/GSD/manuals/MAN0019381_TaqMan_SCID_SMA_Plus_Assay_UG.pdf.

［8］KWOK J S Y， CHEUNG S K F， HO J C Y， et al. Establishing simultaneous T cell receptor excision circles （TREC） and K-deleting recombination excision circles （KREC） quantification assays and laboratory reference intervals in healthy individuals of different age groups in Hong Kong［J］. Frontiers in Immunology， 2020， 11： 1411.

［9］U.S. Food and Drug Administration. 510（k） Premarket Notification （Severe Combined Immunodeficiency Disorder （SCID） Newborn Screening Test System）[EB/OL]. （2022-11-09）[2024-04-30]. https：//www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfPMN/pmn.cfm？ID=K203035.

［10］Thermo Fisher Scientific Inc. TaqManTM SCID/SMA Plus Assay User Guide[EB/OL]. （2021-08-11） [2024-04-30]. https：//assets.thermofisher.com/TFS-Assets/GSD/manuals/MAN0019381_TaqMan_SCID_SMA_Plus_Assay_UG.pdf.

［11］國家衛(wèi)生健康委員會(huì)辦公廳， 國家中醫(yī)藥管理局辦公室. 關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒診療方案（試行第九版）的通知［EB/OL］. （2022-03-14）［2024-04-13］. https：//www.gov.cn/zhengce/zhengceku/2022-03/15/content_5679257.htm.

［12］BUTLER J M. 法醫(yī)DNA分型專論： 方法學(xué)（原書第三版）［M］. 侯一平， 李成濤， 譯. 北京： 科學(xué)出版社， 2013.

［13］國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)評(píng)審中心. 流行性感冒病毒核酸檢測試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2023年修訂版）（2024年第1號(hào)）［EB/OL］.（2024-01-03）［2024-05-12］. https：//www.cmde.org.cn//flfg/zdyz/zdyzwbk/20240109140745194.html.

［14］國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心. 新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2023年第2號(hào)）［EB/OL］. （2023-03-02）［2024-05-12］. https：//www.cmde.org.cn//flfg/zdyz/zdyzwbk/20230309105852142.html.

［15］EL-DALY M M. Advances and challenges in SARS-CoV-2 detection： a review of molecular and serological technologies［J］. Diagnostics， 2024， 14（5）： 519.

［16］BHANDARI V， TAKSANDE A B， SAPKALE B. Disease transmission and diagnosis of zika virus［J］. Cureus， 2023， 15（11）： e49263.

［17］SHI Y， ZHANG C X， PAN S， et al. The diagnosis of tuberculous meningitis： advancements in new technologies and machine learning algorithms［J］. Frontiers in Microbiology， 2023， 14： 1290746.

［18］李金明. 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)［M］. 2版. 北京： 科學(xué)出版社， 2016.

［19］ALMULLA N， SOLTANE R， ALASIRI A， et al. Advancements in SARS-CoV-2 detection： navigating the molecular landscape and diagnostic technologies［J］. Heliyon， 2024， 10（9）： e29909.

［20］國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)評(píng)審中心. 乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸檢測試劑注冊(cè)審查指導(dǎo)原則（2023 年修訂版）（2024年第1號(hào)）［EB/OL］.（2024-01-03）［2024-05-12］. https：//www.cmde.org.cn//flfg/zdyz/zdyzwbk/20240109140954185.html.

［21］國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)評(píng)審中心. 丙型肝炎病毒核糖核酸測定試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2015年第93號(hào)）［EB/OL］. （2015-04-05）［2024-05-12］. https：//www.cmde.org.cn//flfg/zdyz/zdyzwbk/20170405151100286.html.

［22］THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. A highly specific and sensitive Applied Biosystems？ TaqMan SCID/SMA multiplex assay optimized for dried blood spots ［EB/OL］.（2013-03-29）［2022-12-05］.https：//assets.thermofisher.com/TFS-Assets/GSD/posters/taqman-scid-sma-assay-blood-poster.pdf.

［23］DOUEK D C， VESCIO R A， BETTS M R， et al. Assessment of thymic output in adults after haematopoietic stem-cell transplantation and prediction of T-cell reconstitution［J］. The Lancet， 2000， 355（9218）： 1875-1881.

［24］PUCK J M， GENNERY A R. Establishing newborn screening for SCID in the USA; experience in California［J］. International Journal of Neonatal Screening， 2021， 7（4）： 72.