摘 要：【目的】研究不同綿羊品種產(chǎn)羔數(shù)候選基因的遺傳效應(yīng)。

【方法】以4個綿羊品種（多浪羊468只、德國美利奴羊152只、薩福克羊157只、湖羊600只）為樣本，利用擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)（ARMS-PCR）、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）等方法，檢測4個繁殖力候選基因COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB遺傳多態(tài)性，并分析其多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性。

【結(jié)果】COIL基因g.7 321 466Ggt;C位點(diǎn)在多浪、德國美利奴、薩福克、湖羊上突變純合GG基因型頻率在0.3左右，在多浪羊中CC基因型極顯著高于CG、GG，CG基因型極顯著高于GG；德國美利奴羊中GG基因型顯著高于CG、CC，CG基因型顯著高于GG；在薩?？?、湖羊中GG、CG基因型極顯著高于CC。BMPRIB基因在湖羊中BB、B+基因型產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于++，但其他品種效果不理想。FSHR基因g.75 320 741Cgt;T位點(diǎn)、CUCY基因g.43266624Ggt;A位點(diǎn)對綿羊產(chǎn)羔數(shù)影響較低。

【結(jié)論】COIL基因g.7321466Ggt;C位點(diǎn)有望替代BMPRIB基因成為新的產(chǎn)羔數(shù)性狀選育的分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：綿羊；COIL；FSHR；GUCY1A1；BMPRIB；產(chǎn)羔數(shù)

中圖分類號："" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"" 文章編號：1001-4330（2024）06-1544-09

0 引 言

【研究意義】產(chǎn)羔數(shù)性狀的遺傳力低，基因型選擇較傳統(tǒng)方法會獲得較大的遺傳進(jìn)展，因此，產(chǎn)羔數(shù)功能基因和分子標(biāo)記的研究成為熱點(diǎn)。繁殖力性狀如排卵率和產(chǎn)羔數(shù)可以由許多影響較小的基因進(jìn)行遺傳調(diào)節(jié)，有時也可以由單個影響較大的基因進(jìn)行遺傳調(diào)節(jié)［1］?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】BMPRIB基因（FecB）是影響B(tài)ooroola羊的繁殖力基因［2］，近年來，在中國的湖羊［3］、小尾寒羊［4］中發(fā)現(xiàn)了FecB基因?qū)Ξa(chǎn)羔數(shù)的影響，但對其他綿羊品種產(chǎn)羔數(shù)影響不大。例如，在一些綿羊品種如灘羊、杜泊、薩?？撕兔览校珺MPRIB基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)無顯著關(guān)聯(lián)［5］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】COIL影響卵母細(xì)胞的受精數(shù)量從而影響小鼠的繁殖力，敲除COIL導(dǎo)致每胎產(chǎn)仔數(shù)降低，影響小鼠整體生存力和繁殖力［6］?？扇苄曾B苷酸環(huán)化酶會影響卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂從而影響動物排卵［7］。促卵泡激素（FSH）由腦垂體前葉分泌，將影響卵泡的發(fā)育中卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂。在缺乏足夠FSH的情況下，卵泡不能在早期竇期之后生長和成熟，會導(dǎo)致排卵不發(fā)生［8］。COIL、GUCY1A1、FSHR對綿羊產(chǎn)羔數(shù)有影響，但未進(jìn)行不同品種的大群檢驗(yàn)。急需尋找一個更有效的候選基因或分子標(biāo)記位點(diǎn)。【擬解決的關(guān)鍵問題】以4種綿羊品種（多浪羊468只、德國美利奴羊152只、薩?？搜?57只、湖羊600只）為樣本，利用擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)（ARMS-PCR）、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）等方法，檢測4個繁殖力候選基因COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB遺傳多態(tài)性，并分析其多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材 料

采集麥蓋提刀郎陽光農(nóng)牧科技有限公司羊場468只多浪羊、庫爾勒羊場152只德國美利奴羊、哈密健坤牧業(yè)羊場600只湖羊、瑪納斯日發(fā)西域羊場157只薩?？私】到?jīng)產(chǎn)母羊（2～3胎次）血樣（均為雙羔的母羊），同時選取少量單羔的作為對照。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取

采用酚-氯仿抽提法，提取基因組DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的完整度與質(zhì)量。

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)

參照第三版《分子克隆試驗(yàn)指南》方法。

1.2.3 擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)（ARMS-PCR）

根據(jù)篩選到的FSHR基因g.75320741Cgt;T，序列號NC_019460.2；GUCY1A1基因g.43266624Ggt;A，序列號NC_019474.2；COIL基因g.7321466Ggt;C，序列號NC_019468.2在線NCBI網(wǎng)絡(luò)平臺設(shè)計(jì)引物，由上海生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司合成。表1

ARMS-PCR反應(yīng)體系為PCR Mix：COIL、GUCY1A1、FSHR分別為10、10、10 μL；ddH2O：COIL、GUCY1A1、FSHR分別為6.6、7、6 μL；內(nèi)引物上游F1：COIL、GUCY1A1、FSHR分別為0.9、0.8、1.2 μL；內(nèi)引物下游R1：COIL、GUCY1A1、FSHR分別為0.9、0.8、1.2 μL；外引物上游F2：COIL、GUCY1A1、FSHR分別為0.3、0.2、0.3 μL；外引物下游R2：COIL、GUCY1A1、FSHR分別為0.3、0.2、0.3 μL；DNA：COIL、GUCY1A1、FSHR分別為1、1、1 μL。

ARMS-PCR反應(yīng)程序：

94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，35個循環(huán)，（COIL、FSHR）62℃退火30 s/GUCY1A1 61℃退火30 s，35個循環(huán)，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel整理統(tǒng)計(jì)；群體遺傳規(guī)律的計(jì)算可使用POPGENE32、PIC-CALC能幫助快速計(jì)算基因型頻率、基因純合度（Ho）、基因頻率、基因雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）及多態(tài)信息含量（PIC）。利用SPSS 23.0中單因素方差分析對平均產(chǎn)羔數(shù)和突變位點(diǎn)基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，產(chǎn)羔數(shù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊基因組DNA檢測

研究表明，片段清晰，沒有拖尾，1、2號泳道是多浪羊基因組；3、4號泳道是德國美利奴羊基因組；5、6號泳道是薩?？搜蚧蚪M；7～9號泳道是湖羊基因組DNA。圖1

2.2 BMPRIB基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

研究表明，目標(biāo)片段擴(kuò)增特異性良好，得到140 bp大小目標(biāo)片段，無其他雜帶，可用作后續(xù)試驗(yàn)。1、2號泳道為多浪羊PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3、4號泳道為德國美利奴羊PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5、6號泳道為薩?？搜騊CR擴(kuò)增產(chǎn)物；7～9號泳道為湖羊PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2

2.3 BMPRIB基因的PCR-RFLP檢測

研究表明，1、3、4、6號泳道為野生型++基因型，2、5號泳道為B+基因型；德國美利奴羊PCR-RFLP檢測結(jié)果，1、2號泳道為B+基因型，3、4、5號泳道野生型++基因型；湖羊PCR-RFLP檢測結(jié)果，1、3、4、5、7號泳道為突變純合BB基因型，2號泳道野生型++基因型，6號泳道為B+基因型；薩福克羊PCR-RFLP檢測結(jié)果，1～5號泳道為野生型++基因型，未檢出突變。圖3

2.4 COIL、FSHR、GUCY1A1基因的ARMS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

2.4.1 COIL基因的ARMS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

研究表明，多浪羊1號泳道為突變純合GG基因型，2、3、4號泳道為CG基因型；5號泳道為野生型CC基因型；德國美利奴羊6號泳道為突變純合GG基因型，2、3、5號泳道為CG基因型；1、4號泳道為野生型CC基因型；湖羊2號泳道為突變純合GG基因型，3號泳道為CG基因型；1、4～7號泳道為野生型CC基因型；薩?？搜?號泳道為突變純合GG基因型，1、3、4號泳道為CG基因型；2號泳道為野生型CC基因型；條帶清晰、且片段大小正確、分型成功。圖4

2.4.2 FSHR基因的ARMS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

研究表明，多浪羊1、7號泳道為野生型CC基因型，2～6號泳道為CT基因型；德國美利奴羊1～3、5號泳道為野生型CC基因型，4號泳道為CT基因型；湖羊2、4號泳道為野生型CC基因型，1、3、5號泳道為CT基因型；薩?？搜?、2、5號泳道為野生型CC基因型，3、4號泳道為CT基因型；條帶清晰，且片段大小正確、分型成功。圖5

研究表明，多浪羊1、3～6、8號泳道為野生型CC基因型，2、7號泳道為CT基因型；德國美利奴羊1、2號泳道為野生型CC基因型，3～5號泳道為CT基因型；湖羊3號泳道為野生型CC基因型，1、2、4號泳道為CT基因型；薩?？搜?號泳道為野生型CC基因型，1、2、4號泳道為CT基因型；條帶清晰，且片段大小正確、分型成功。圖6

2.5 COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB基因的遺傳多樣性

2.5.1 COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB基因在4個綿羊品種中的基因型頻率、等位基因頻率

研究表明，在多浪羊、德國美利奴羊、湖羊3個品種中G等位基因是優(yōu)勢等位基因；在薩?？搜蛑蠧等位基因是優(yōu)勢等位基因。在4個綿羊群體中C等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。在4個綿羊品種中G等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。在湖羊中B等位基因是優(yōu)勢等位基因；在多浪、德國美利奴羊中+等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。表2

2.5.2 COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB基因在4個綿羊品種中的Ho、He、Ne和PIC

研究表明，COIL基因在湖羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，在4個綿羊品種中均為中度多態(tài)位點(diǎn)。FSHR基因在薩?？搜蛉后w中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，在多浪羊、德國美利奴羊中為中度多態(tài)位點(diǎn)，在薩?？搜?、湖羊上為低度多態(tài)位點(diǎn)。GUCY1A1在德國美利奴、薩?？恕⒑蛉后w中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。4個品種均為低度多態(tài)位點(diǎn)。BMPRIB基因在多浪羊、德國美利奴羊群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，在湖羊中為中度多態(tài)位點(diǎn)，多浪羊、德國美利奴羊中為低度多態(tài)位點(diǎn)。表3

2.6 COIL、FSHR、GUCY1A1、BMPRIB基因在4個綿羊品種中的基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性

研究表明，COIL基因在多浪羊中，CC基因型產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于（Plt;0.01）CG、GG基因型，CG基因型產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于（Plt;0.01）GG基因型；德國美利奴羊GG基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于（Plt;0.05）CG、CC基因型，CG基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于（Plt;0.05）CC基因型；薩?？搜?、湖羊GG、CG基因型產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于（Plt;0.01）CC基因型。FSHR基因在多浪羊、德國美利奴羊中，CT基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于（Plt;0.05）CC基因型，在薩福克羊、湖羊中，CT基因型產(chǎn)羔數(shù)及顯著高于（Plt;0.01）CC基因型。GUCY1A1基因在多浪羊群體中，GA基因型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于（Plt;0.05）GG基因型；在德國美利奴羊群體中，GG基因型產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于（Plt;0.01）GA基因型。BMPRIB基因在多浪羊群體中，B+型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于（Plt;0.05）++型；德國美利奴羊中B+、++ 2種基因型對應(yīng)產(chǎn)羔數(shù)之間不顯著（Pgt;0.05）；湖羊群體中，BB、B+ 2種基因型產(chǎn)羔數(shù)都極顯著高于（Plt;0.01）++型。表4

3 討 論

3.1 COIL基因?qū)Σ煌d羊品種產(chǎn)羔數(shù)的影響

敲除COIL對小鼠整體生存力和繁殖力有影響，缺少coil基因的小鼠出現(xiàn)明顯的生育力和繁殖力缺陷［6］。試驗(yàn)通過篩選也發(fā)現(xiàn)COIL基因與產(chǎn)羔數(shù)密切相關(guān)。馬海玉［9］發(fā)現(xiàn)COIL基因通過影響蛋白翻譯過程的運(yùn)輸和定位來調(diào)節(jié)繁殖機(jī)制，COIL基因可以顯著的提高綿羊纖維細(xì)胞的增殖和活性。在不同綿羊品種中均分型得到3種基因型；在與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)對產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響。

3.2 FSHR、GUCY1A1基因?qū)Σ煌d羊品種產(chǎn)羔數(shù)的影響

促卵泡激素受體（FSHR）在動物卵泡發(fā)育中起重要作用，F(xiàn)SHR在超排羔羊和正常羔羊卵巢主要表達(dá)于卵泡顆粒細(xì)胞［10］。馬海玉［9］發(fā)現(xiàn)FSHR與卵泡發(fā)育進(jìn)程有關(guān)。對于調(diào)節(jié)減數(shù)分裂恢復(fù)和卵母細(xì)胞成熟的完成也有作用，而且FSHR的純合突變是有害的，通過這些影響排卵導(dǎo)致其對繁殖性能的影響。小尾寒羊和湖羊具有與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的FSHR基因g.47Cgt;T多態(tài)性位點(diǎn)［11］。Pan等［12］將FSHR基因型與產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)分析表明，F(xiàn)SHR基因的同義突變g.-47Cgt;T與產(chǎn)仔數(shù)有明顯的相關(guān)；研究發(fā)現(xiàn)FSHR基因已經(jīng)與卵巢衰竭有關(guān)，純合子可能是一個有害的變異體的個體［13］。未在4個不同綿羊品種中發(fā)現(xiàn)突變純合，也可能是純合突變TT型有害致死，但還有待進(jìn)一步研究。

NO在排卵過程中的調(diào)節(jié)作用，GUCY1A1基因的突變會破壞一氧化氮的組成結(jié)構(gòu)，使卵母細(xì)胞停止減數(shù)分裂對排卵產(chǎn)生影響從而導(dǎo)致綿羊?qū)Ψ敝沉档停?4］。有研究表明NO對于卵泡發(fā)育是必需的，eNOS在選擇排卵的優(yōu)勢卵泡中的作用［15］。Guo等［16］發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充精氨酸可能會調(diào)節(jié)卵巢中關(guān)鍵的NO/PGC-1α信號通路基因的表達(dá)，從而加速排卵過程。馬海玉［9］在GUCY1A1基因g.43266624位點(diǎn)成功在和田羊和阿勒泰羊中分型，并且發(fā)現(xiàn)此位點(diǎn)的突變在一定程度上會降低和田羊和阿勒泰羊的產(chǎn)羔能力。在4種綿羊中發(fā)現(xiàn)2種基因型，無純合突變，GUCY1A1在4種綿羊群體中均屬于低度多態(tài)，這個位點(diǎn)的突變幾率小，選擇潛力較小。

3.3 BMPRIB基因?qū)Σ煌d羊品種產(chǎn)羔數(shù)的影響

FecB是首個在綿羊中鑒定出的具有高繁殖性能的關(guān)鍵基因，與提高綿羊的排卵量和產(chǎn)羔量密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在湖羊中BB、B+2種基因型產(chǎn)羔數(shù)都極顯著高于++型，BB型與B+型對應(yīng)產(chǎn)羔數(shù)之間不顯著結(jié)果和前人結(jié)果一致［17、18］。在多浪羊中發(fā)現(xiàn)2種基因型（B+、++），B+型產(chǎn)羔數(shù)顯著高于++型與柏雪梅等［19］研究結(jié)果一致。在德國美利奴羊中發(fā)現(xiàn)2種基因型（B+、++），B+、++2種基因型對應(yīng)產(chǎn)羔數(shù)之間不顯著，與王鈞［18］未在德國美利奴羊中發(fā)現(xiàn)BMPRIB基因的B等位基因突變個體相比，試驗(yàn)研究的樣本量較大，發(fā)現(xiàn)了少量的B等位基因突變個體；與劉學(xué)峰等［20］在純種德國肉用美利奴羊（德肉美）和東北細(xì)毛羊僅含有稀少的B+基因型個體結(jié)果一致。楊永林等［21］利用FecB基因標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，選育擴(kuò)繁多胎薩福克新品系。在薩福克羊中只有++基因型，BMPRIB基因不是影響薩?？搜蚨喔嵝誀畹幕颍枰M(jìn)一步發(fā)掘其他基因。

4 結(jié) 論

COIL基因?qū)?個綿羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著，可以作為篩選多浪羊、德國美利奴羊、薩?？搜?、湖羊高繁殖率的新候選基因。

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Analysis of genetic effects of candidate genes for lambing numbers in different sheep breeds

Abstract：【Objective】 To explore candidate genes affecting lambing number in different sheep breeds.

【Methods】" Four sheep breeds （468 multi-wave sheep， 152 German merino sheep， 157 Suffolk sheep and 600 lake sheep） were used as samples， and the genetic polymorphisms of four fecundity candidate genes COIL， FSHR， GUCY1A1 and BMPRIB were detected by amplification hindered mutation system PCR technology （ARMS-PCR） and restriction enzyme fragment length polymorphism （RFLP）， and the correlation between polymorphisms and lambing number was analyzed.

【Results】"" The frequency of homozygous GG genotype in C-site of coil gene g.7321466Ggt;C was about 0.3 in Duolang， German Merino， Suffolk and Hu sheep， CC genotype was significantly higher than that of CG and GG， and CG genotype was significantly higher than that of GG.The GG genotype in German merino sheep was significantly higher than that of CG and CC， and the CG genotype was significantly higher than that of GG.In Suffolk and Hu sheep， the GG and CG genotypes were significantly higher than those of CC.The association between BMPRIB gene genotype and lambing number in Hu sheep showed that the number of lambing of BB and B+ genotypes was significantly higher than that of ++， but the effect of other breeds was not satisfactory.The T locus of FSHR gene g.75320741Cgt; and the g.43266624Ggt;A locus of CUCY1A1 gene had low effects on lambing in sheep.

【Conclusion】" The g.7321466Ggt;C locus of COIL gene is expected to replace BMPRIB gene as a molecular marker for the breeding of lamb number traits.

Key words：sheep; COIL; FSHR; GUCY1A1; BMPRIB; number of lambs