摘要：目的 探究蛋白酶體20S亞基β8（PSMB8）對腎透明細胞癌（ccRCC）細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以及是否通過調控絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）/細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）信號通路發(fā)揮其作用。方法 采用癌癥基因組圖譜數據庫分析ccRCC與正常組織PSMB8 mRNA的表達水平，并通過實時熒光定量PCR、Western blot和免疫組織化學染色等方法進一步檢測PSMB8在ccRCC組織和細胞中的表達情況。構建穩(wěn)定過表達和敲減PSMB8的細胞株，分別采用CCK-8法和平板克隆實驗檢測細胞的增殖能力，劃痕愈合實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲的能力。對PSMB8共表達基因進行京都基因與基因組百科全書通路富集分析，Western blot檢測MEK/ERK通路相關蛋白的磷酸化水平，并加用ERK激動劑C16-PAF處理進行細胞功能學挽救實驗。結果 與正常組織比較，PSMB8 mRNA和蛋白在ccRCC組織中呈高表達（P均＜0.001），且與臨床患者的TNM分期顯著相關（P＜0.001）；與陰性對照組比較，過表達PSMB8可以促進786-O、ACHN細胞的增殖（P=0.02 P=0.039）、遷移和侵襲（P均＜0.001），敲減PSMB8可以抑制786-O、ACHN細胞的增殖（P=0.02 P=0.005）、遷移和侵襲（P均＜0.001）；PSMB8共表達基因通路富集分析提示其可能與絲裂原活化蛋白激酶通路相關（P＜0.001）；敲減PSMB8后786-O和ACHN細胞MEK1/2（P=0.017，P=0.016）、ERK1/2（P=0.010，P=0.040）蛋白磷酸化水平及ERK下游因子c-Myc（P=0.04 P=0.038）、c-Fos（P=0.025，P=0.008）和CyclinD1（P=0.006，P=0.047）轉錄水平均下調；與ERK激動劑C16-PAF處理組比較，敲減PSMB8 + C16-PAF組明顯抑制786-O、ACHN細胞的增殖（P=0.00 P=0.002）、遷移和侵襲能力（P均＜0.001）。結論 PSMB8通過激活MEK/ERK信號通路從而促進ccRCC細胞的增殖、遷移及侵襲。

關鍵詞：腎透明細胞癌；蛋白酶體20S亞基β8；絲裂原活化蛋白激酶激酶/細胞外信號調節(jié)激酶信號通路

中圖分類號： R737.11" 文獻標識碼： A" 文章編號：1000-503X（2024）05-0641-12

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.16003

Effects of Proteasome 20S Subunit Beta 8 on Proliferation，Migration，and Invasion of "Clear Cell Renal Cell Carcinoma Cells via Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase/Extracellular Signal-Regulated Kinase Signaling Pathway

HAO Yufei SHI Yu ZHENG Jinxiu ZHAO Xueting LIU Shenglu YANG Lijun

1Department of Pharmacology，2Key Laboratory of Tumor Immunology and Targeted Drug Development of Shanxi Province，3Department of Biochemistry and Molecular Biology，School of Basic Medical Sciences，Shanxi Medical University，Taiyuan 03000 China

Corresponding author：YANG Lijun Tel：0351-398533 E-mail：yanglijunmm@sxmu.edu.cn

ABSTRACT：Objective To explore the effects of proteasome 20S subunit beta 8 （PSMB8） on the proliferation，migration，and invasion of clear cell renal cell carcinoma （ccRCC） cells and whether PSMB8 promotes tumor progression by activating the mitogen-activated protein kinase kinase （MEK）/extracellular signal-regulated kinase （ERK） signaling pathway.Methods The Cancer Genome Atlas was employed to analyze the mRNA levels of PSMB8 in ccRCC and normal tissue，and the expression levels of PSMB8 in ccRCC tissue and cells were determined by real-time quantitative PCR，Western blotting，and immunohistochemistry.Furthermore，the cell lines with stable overexpression and knockdown of PSMB8 were constructed.The CCK-8 assay and colony formation assay were employed to examine the cell proliferation，and the wound healing assay and Transwell assay were employed to examine the invasion and migration of cells.Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment was performed to analyze the co-expressed genes of PSMB8.Western blotting was used to measure the phosphorylation levels of the proteins in the MEK/ERK signaling pathway.Finally，the rescue experiment was carried out with the ERK agonist C16-PAF.Results Compared with the normal tissue，the ccRCC tissue showed up-regulated mRNA and protein levels of PSMB8 （both Plt;0.001），which were associated with the TNM stage of patients with ccRCC （Plt;0.001）.Compared with the negative control group，overexpression of PSMB8 promoted the proliferation （P=0.02 P=0.039），migration and invasion （all Plt;0.001） of 786-O and ACHN cells，and the knockdown of PSMB8 inhibited the proliferation （P=0.02 P=0.005），migration and invasion （all Plt;0.001） of 786-O and ACHN cells.The pathway enrichment analysis of co-expressed genes of PSMB8 predicted the mitogen-activated protein kinase signaling pathway （Plt;0.001）.After the knockdown of PSMB8，786-O and ACHN cells showed lowered phosphorylation levels of MEK1/2 （P=0.017，P=0.016） and ERK1/2 （P=0.010，P=0.040） and down-regulated transcription levels of ERK downstream factors c-Myc （P=0.04 P=0.038），c-Fos （P=0.025，P=0.008），and CyclinD1 （P=0.006，P=0.047）.Compared with the ERK agonist C16-PAF group，the PSMB8 knockdown + C16-PAF group showed inhibited proliferation （P=0.00 P=0.002），migration and invasion （all Plt;0.001） of 786-O and ACHN cells.Conclusion PSMB8 may promote the proliferation，migration，and invasion of ccRCC cells by activating the MEK/ERK signaling pathway.

Key words：clear cell renal cell carcinoma；proteasome 20S subunit beta 8；mitogen-activated protein kinase kinase/extracellular signal-regulated kinase signaling pathway

Acta Acad Med Sin，2024，46（5）：641-652

腎細胞癌是最常見的泌尿系統惡性腫瘤之一，占所有原發(fā)性腎臟惡性腫瘤的90%以上［1］，其中腎透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）最為常見，約占腎細胞癌病例的80%［2］。近年來，ccRCC發(fā)病率呈上升趨勢，盡管大部分早期患者可通過手術切除使病情好轉，但由于其早期癥狀隱匿，發(fā)現時往往已出現轉移，導致預后效果較差，大大降低了患者的生存率［3］。因此，迫切需要尋找有助于ccRCC臨床診治的新型標志物，并揭示其在ccRCC中的潛在作用機制，這已成為當前重要的研究方向之一。蛋白酶體20S亞基β8（proteasome 20S subunit beta 8，PSMB8）是免疫蛋白酶體的一個重要亞基［4］，具有糜蛋白酶樣活性，在調控細胞周期、細胞內蛋白質穩(wěn)態(tài)、細胞信號傳導、抗原提呈、炎癥反應以及腫瘤進展中發(fā)揮著重要作用［5-6］。既往研究證實PSMB8參與調控膠質瘤細胞的增殖、遷移和凋亡［7］；在甲狀腺癌中PSMB8呈高表達，且與甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、凋亡密切相關［8］；PSMB8還可以促進非小細胞肺癌的侵襲和進展［9］；此外，抑制PSMB8可通過下調促炎性細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-17和IL-23的表達影響類風濕關節(jié)炎的進展［10］。然而，PSMB8在ccRCC中的作用目前尚不清楚。本研究通過細胞學功能實驗及機制分析探究PSMB8對ccRCC細胞增殖、遷移和侵襲的影響，為ccRCC靶向藥物的研發(fā)提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎細胞293T和ccRCC細胞系（786-O、ACHN、A498、OS-RC-2、769-P）購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。β-actin、GAPDH抗體購自北京全式金生物技術有限公司，細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2、磷酸化ERK（phosphorylated-ERK，p-ERK）1/2、絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）1/2、磷酸化MEK（phosphorylated-MEK，p-MEK）1/2、PSMB8抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

786-O、OS-RC-2和769-P細胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，ACHN和A498細胞采用MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，293T細胞采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基中均含100 mL/L胎牛血清和100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素。將細胞置于37 ℃、5% CO2的常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 組織芯片制備

收集2021年12月至2022年8月山西省腫瘤醫(yī)院手術后制備的ccRCC及癌旁正常組織的石蠟包埋樣本59對，并制備組織芯片。本研究通過山西醫(yī)科大學倫理委員會批準（倫理審批編號：2022007），所有患者均簽署知情同意書。

1.4 質粒構建及篩選

從美國國家生物技術信息中心下載人類PSMB8編碼序列，采用無縫克隆的方法構建PSMB8過表達質粒，質粒載體為pEGFP-C1-3×Flag載體。采用Invitrogen在線工具設計短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA），將其連接到慢病毒pLVX-Zsgreen載體中，構建PSMB8敲減質粒。采用Lipo8000脂質體轉染786-O和ACHN細胞株，同時以空白質粒作為陰性對照組，分別加入2 μg/mL G418處理細胞2周，以獲得穩(wěn)定的轉染細胞。采用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測PSMB8基因過表達和敲減的效率，并將細胞分為PSMB8過表達組（oePSMB8）和PSMB8敲減組（shPSMB8）。shRNA序列：5’-GTTGGGTGAAAGTAGAAAGTA-3’。

1.5 Western blot檢測蛋白表達水平

PBS清洗細胞后，收集細胞沉淀，RIPA緩沖液裂解細胞，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白的濃度。根據目標蛋白的分子量制備不同濃度的分離膠，每孔上樣30 μg總蛋白，經SDS-PAGE凝膠分離后，配制5%脫脂牛奶封閉液，室溫封閉1 h，加入ERK1/2（1∶1000）、MEK1/2（1∶1000）、p-ERK1/2（1∶1000）、p-MEK1/2（1∶1000）、PSMB8（1∶1000）、β-actin（1∶4000）、GAPDH（1∶1000）抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗稀釋液孵育1 h，采用蛋白凝膠成像系統進行顯影。

1.6 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達水平

采用TRIzol法提取細胞總RNA，并逆轉錄為cDNA，根據QuantiNova SYBR Green PCR Kit試劑盒說明書配置反應體系。反應總體系為20 μL/管，反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，重復40個循環(huán)。每個反應設置3個復孔，以GAPDH為內參，采用2-△△Ct法計算相對表達量。PCR引物序列見表1。

1.7 CCK-8法檢測細胞增殖

采用CCK-8法檢測PSMB8對ccRCC細胞增殖能力的影響。將處理后的細胞以每孔1000～3000個細胞密度接種于96孔板中，分別在0、24、48、72 h向每孔加入10 μL CCK-8試劑反應1 h，采用酶標儀在450 nm處測定吸光度值。

1.8 平板克隆實驗檢測細胞增殖

將穩(wěn)定過表達或敲減PSMB8的786-O和ACHN細胞按5000個/孔的密度接種于6孔板中，每3 d更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周。甲醇固定細胞15 min，0.1%結晶紫染色30 min，倒扣靜置晾干水分，對細胞克隆進行拍照并計數。

1.9 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移

將各組細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞完全融合，用200 μL無菌槍頭尖端在孔內做“井”字劃痕，并用PBS將脫落細胞清洗干凈，每孔加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、12 h拍照記錄。采用Image J軟件分析計算細胞劃痕面積。

1.10 Transwell遷移和侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲

將各組細胞按2×104個/孔的密度分別接種于無基質膠和涂有Matrigel基質膠的上室，另將含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下室，37 ℃培養(yǎng)24 h后取出上室，用棉簽輕輕擦去上層未穿透膜的細胞，PBS清洗后，甲醇固定細胞15 min，0.1%結晶紫染色30 min，隨機選取3個視野，使用顯微鏡拍照并計數。

1.11 免疫組織化學染色檢測PSMB8的表達

將組織芯片經常規(guī)脫蠟水化、檸檬酸鈉抗原修復后，冷卻至室溫。加入300 mL/L過氧化氫溶液阻斷內源性過氧化物酶，5%的牛血清白蛋白進行封閉，滴加PSMB8單克隆抗體4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，每次2 min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗溶液，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，中性樹膠封片。按照染色陽性率評分（1分0～25%、2分26%～50%、3分gt;50%）與染色強度評分（0分陰性著色、1分淡黃色、2分淺褐色、3分深褐色）的乘積作為總評分進行分組。根據患者所得評分中位值分為低表達組與高表達組。所有染色結果均由兩名病理科醫(yī)生經雙盲法獨立評分。

1.12 生物信息學分析PSMB8的表達

利用腫瘤免疫浸潤評估（Tumor Immune Estimation Resource，TIMER）數據庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）分析PSMB8在泛癌中的轉錄組水平。從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載ccRCC患者mRNA表達譜數據及相關臨床數據，篩選出533例腫瘤樣本及72例正常樣本，繪制PSMB8在ccRCC中表達情況的箱線圖，并分析PSMB8與臨床TNM分期的關系。

1.13 統計學處理

采用SPSS 22.0軟件，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ccRCC中PSMB8的表達水平

通過TIMER數據庫分析PSMB8在不同類型惡性腫瘤組織和正常對照組織中的表達情況，發(fā)現PSMB8在包括ccRCC（Plt;0.001）在內的多種腫瘤組織中呈高表達（圖1A）。TCGA數據庫分析顯示ccRCC組織中PSMB8 mRNA和蛋白表達均顯著高于正常組織（P均lt;0.001）（圖1B、1C）；ccRCC組織芯片顯示PSMB8表達上調（Plt;0.001）（圖1D）；PSMB8表達水平越高ccRCC患者的分期、分級越高，且更易發(fā)生遠處轉移（P均＜0.001）（圖1E）。與人胚腎細胞239T比較，786-O、ACHN、A498、OS-RC-2、769-P細胞PSMB8 mRNA（P=0.00 P＜0.00 P＜0.00 P＜0.00 P＜0.001）和蛋白表達（P=0.00 P＜0.00 P＜0.00 P=0.018，P=0.003）均顯著增加（圖1F、1G）。

2.2 過表達PSMB8對ccRCC細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

與陰性對照組比較，oePSMB8組786-O和ACHN細胞PSMB8 mRNA（1.56±0.36比0.99±0.0 P=0.020；2.82±1.11比0.97±0.06，P=0.045）和蛋白表達（2.12±0.48比1.01±0.0 P=0.006；1.40±0.13比1.00±0.0 P=0.015）顯著增加。CCK-8和平板克隆實驗檢測結果顯示，過表達PSMB8促進786-O和ACHN細胞的增殖能力（P=0.02 P=0.039）（圖2A、2B）；劃痕愈合實驗結果顯示，與陰性對照組比較，oePSMB8組786-O［（0.89±0.01）%比（0.76±0.07）%，P=0.029］和ACHN細胞［（0.83±0.06）%比（0.74±0.06）%，P=0.049］傷口愈合速率明顯加快（圖2C、2D）；Transwell遷移和侵襲實驗檢測結果顯示，過表達PSMB8后，穿過小室的786-O［（442.70±11.93）個比（369.30±10.97）個，P＜0.001］和ACHN細胞［（143.90±12.32）個比（38.20±10.81）個，P＜0.001］數量顯著增加（圖2E、2F），786-O［（347.70±50.5）個比（208.70±19.86）個，P＜0.001］和ACHN細胞［（74.05±21.08）個比（30.12±16.88）個，P＜0.001］的侵襲能力也顯著增強（圖2G、2H）。

2.3 敲減PSMB8對ccRCC細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

與陰性對照組比較，shPSMB8組786-O和ACHN細胞PSMB8 mRNA（0.42±0.08比1.01±0.0 P＜0.001；0.45±0.15比1.02±0.0 P＜0.001）和蛋白表達（0.59±0.11比1.01±0.0 P=0.003；0.64±1.14比1.00±0.0 P=0.012）顯著減少。CCK-8和平板克隆實驗檢測結果顯示，敲減PSMB8抑制786-O和ACHN細胞的增殖能力（P=0.02 P=0.005）（圖3A、3B）；劃痕愈合實驗結果顯示，與陰性對照組比較，shPSMB8組786-O［（0.45±0.12）%比（0.68±0.01）%，P=0.029］和ACHN細胞［（0.40±0.07）%比（0.70±0.07）%，P=0.006］傷口愈合速率明顯減慢（圖3C、3D）；Transwell遷移和侵襲實驗檢測結果顯示，敲減PSMB8后，穿過小室的786-O［（341.70±57.01）個比（441.30±5.69）個，P＜0.001］和ACHN細胞［（164.60±63.44）個比（262.6±76.97）個，P＜0.001］數量顯著減少（圖3E、3F），786-O［（235.00±15.52）個比（381.30±6.66）個，P＜0.001］和ACHN細胞［（76.18±25.53）個比（217.30±82.63）個，P＜0.001］的侵襲能力也顯著減弱（圖3G、3H）。

2.4 PSMB8基因功能富集分析結果

京都基因與基因組百科全書富集分析結果顯示，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的基因富集率最高（圖4A）。敲減PSMB8后，786-O和ACHN細胞MEK1/2（P=0.017，P=0.016）、ERK1/2（P=0.010，P=0.040）磷酸化水平顯著降低（圖4B、4C），且ERK下游調控關鍵因子c-Myc（P=0.04 P=0.038）、c-Fos（P=0.025，P=0.008）和CyclinD1 mRNA（P=0.006，P=0.047）表達量均顯著降低（圖4D）。

2.5 敲減PSMB8抑制MEK/ERK通路對ccRCC細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

ERK激動劑C16-PAF處理敲減PSMB8的786-O和ACHN細胞3 h后，MEK1/2和ERK1/2磷酸化水平在一定程度上得到恢復（P均lt;0.001）（圖5A）。與陰性對照組比較，C16-PAF組786-O和ACHN細胞吸光度值顯著增加（P=0.00 P=0.003），與shPSMB8組比較，shPSMB8+C16-PAF組吸光度值顯著增加（P=0.00 P=0.002）（圖5B）。與陰性對照組比較，C16-PAF組786-O和ACHN細胞遷移［（166.90±23.68）個比（126.30±34.21）個，P=0.024；（131.00±4.85）個比（84.00±2.74）個，Plt;0.001］和侵襲［（112.80±12.84）個比（101.30±12.37）個，Plt;0.001；（58.42±7.18）個比（37.22±5.24）］個，Plt;0.001）數量顯著增加；與shPSMB8組比較，shPSMB8+C16-PAF組786-O和ACHN細胞遷移（（49.71±11.73）個比（59.00±10.37）個，P=0.026；（59.6±3.78）個比（105.8±12.79）個，Plt;0.001）和侵襲［（40.53±8.07）個比（57.00±8.93）個，Plt;0.001；（16.75±4.79）個比（28.63±5.39）個，Plt;0.001］數量顯著增加（圖5C、5D）。

3 討論

ccRCC是腎細胞癌的主要類型，具有高度侵襲性和異質性［11］，極易發(fā)生轉移［12］，術后復發(fā)率高，高?；颊呷孕枰邮荛L期全身治療［13-14］，但僅少數患者獲益［15-16］。因此，探索新的治療靶點或許能改善ccRCC患者的預后。PSMB8作為免疫蛋白酶體中最重要的活性亞基，其編碼基因位于主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）基因區(qū)域，在MHCⅠ類分子抗原提呈過程中發(fā)揮著重要作用，可以促進T細胞成熟分化，促進炎癥反應。有研究發(fā)現PSMB8的下調可抑制血管內皮生長因子A的表達，繼而減少膠質母細胞瘤的血管生成［17］。PSMB8抑制劑ONX-0914同樣可以通過p53通路來誘導膠質母細胞瘤的凋亡和自噬［18］，然而，目前關于PSMB8的相關機制研究報道較少，且PSMB8在ccRCC腫瘤進展中的作用尚不明確。本研究通過生物信息學分析和細胞學功能實驗發(fā)現，PSMB8在ccRCC中異常高表達，并顯著促進了ccRCC細胞的增殖、遷移和侵襲過程。這與Zhong等［19］報道PSMB8對甲狀腺未分化癌的促癌作用是相似的。但課題組前期研究發(fā)現，PSMB8的表達與CD8+ T細胞的浸潤水平呈正相關，提示PSMB8可能增強抗腫瘤免疫，與本研究的促癌結論相悖，這可能是由于PSMB8不同亞型在蛋白酶體20S形成過程中的作用不同，非功能性E1亞型的表達上調及E2亞型表達下調，可導致蛋白酶體20S形成障礙，腫瘤特異性抗原難以有效產生［20-22］，從而使得PSMB8協助ccRCC細胞逃避免疫監(jiān)視，促進癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

MAPK是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘炔康闹匾獋鬟f者［23］，幾乎所有真核生物都能表達MAPK，MAPK通路的基本組成是一種保守的三級激酶級聯模式，共同調控細胞的生長、分化、對環(huán)境的應激適應、炎癥反應等多種重要生物學過程［24-26］。經典的MAPK通路主要包括ERK、p38和c-Jun氨基末端激酶、ERK5等信號轉導途徑［27］。其中，ERK1和ERK2可被MEK1和MEK2雙特異性激酶磷酸化激活，從而調控細胞周期，促進細胞增殖、分化及凋亡。一旦ERK1/2發(fā)生異常激活，可導致ERK1/2各個級聯反應的下游底物持續(xù)激活，破壞細胞的正常調節(jié)機制，促進細胞的異常增殖和惡性轉化，繼而引起與基因表達異常有關的疾病發(fā)生［28-29］。本研究顯示PSMB8共表達基因富集到MAPK信號通路。Yang等［7］研究表明PSMB8可通過上調ERK1/2的磷酸化水平，促進腦膠質瘤細胞的遷移、增殖和凋亡，但其在ccRCC中是否也通過參與ERK1/2的級聯反應來發(fā)揮作用還有待進一步驗證。本研究發(fā)現敲減PSMB8后，MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平下調，加入ERK1/2激動劑C16-PAF后，敲低PSMB8對ccRCC細胞的抑制作用明顯被逆轉，因此，PSMB8通過調控MEK/ERK信號通路促進ccRCC細胞的增殖、遷移和侵襲過程。

綜上，本研究結果表明，PSMB8在ccRCC中呈高表達，其可能通過調控MEK/ERK信號通路促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，這有望為ccRCC的臨床治療提供新的線索，并為腫瘤診斷和預后預測提供潛在的生物標志物和治療靶點。但本研究僅通過體外實驗初步驗證了PSMB8的作用機制，考慮到PSMB8生物學功能的多樣性以及分子調控機制的復雜性，不排除其他信號通路共同參與調節(jié)的可能性，后期將利用動物模型和原代ccRCC細胞深入探討PSMB8的作用機制。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 郝宇菲：研究設計及論文撰寫；石宇、鄭錦秀：資料搜集整理；趙雪婷、劉盛露：數據整理與統計分析；楊利軍：論文修改與審核

參 考 文 獻

［1］Oto J，Plana E，Sánchez-González JV，et al.Urinary microRNAs：looking for a new tool in diagnosis，prognosis，and monitoring of renal cancer[J].Curr Urol Rep，2020，21（2）：11.DOI：10.1007/s11934-020-0962-9.

［2］Zhu S，Wu T，Ji Z，et al.Construction of an epithelial-mesenchymal transition-related model for clear cell renal cell carcinoma prognosis prediction[J].Dis Markers，202 2022：3780391.DOI：10.1155/2022/3780391.

［3］Cai Q，Christie A，Rajaram S，et al.Ontological analyses reveal clinically-significant clear cell renal cell carcinoma subtypes with convergent evolutionary trajectories into an aggressive type[J].EBioMedicine，2020，51：102526.DOI：10.1016/j.ebiom.2019.10.052.

［4］Rivett AJ，Hearn AR.Proteasome function in antigen presentation：immunoproteasome complexes，peptide production，and interactions with viral proteins[J].Curr Protein Pept Sci，2004，5（3）：153-161.DOI：10.2174/1389203043379774.

［5］Li N，Zhan X.Integrated genomic analysis of proteasome alterations across 11 057 patients with 33 cancer types：clinically relevant outcomes in framework of 3P medicine[J].Epma J，202 12（4）：605-627.DOI：10.1007/s13167-021-00256-z.

［6］Jiao QH，Wang Y，Zhang AN，et al.PSMA7 promotes the malignant proliferation of esophageal cancer[J].Heliyon，2024，10（1）：e23173.DOI：10.1016/j.heliyon.2023.e23173.

［7］Yang BY，Song JW，Sun HZ，et al.PSMB8 regulates glioma cell migration，proliferation，and apoptosis through modulating ERK1/2 and PI3K/AKT signaling pathways[J].Biomed Pharmacother，2018，100：205-212.DOI：10.1016/j.biopha.2018.01.170.

［8］Fan X，Zhao Y.miR-451a inhibits cancer growth，epithelial-mesenchymal transition andinduces apoptosis in papillary thyroid cancer by targeting PSMB8[J].J Cell Mol Med，2019，23（12）：8067-8075.DOI：10.1111/jcmm.14673.

［9］Liu R，Liu R，Guo Z，et al.shRNA-mediated knockdown of KNTC1 inhibits non-small-cell lung cancer through regulating PSMB8[J].Cell Death Dis，202 13（8）：685.DOI：10.1038/s41419-022-05140-w.

［10］Muchamuel T，Basler M，Aujay MA，et al.A selective inhibitor of the immunoproteasome subunit LMP7 blocks cytokine production and attenuates progression of experimental arthritis[J].Nat Med，2009，15（7）：781-787.DOI：10.1038/nm.1978.

［11］Powles T，ESMO Guidelines Committee.Recent eUpdate to the ESMO Clinical Practice Guidelines on renal cell carcinoma on cabozantinib and nivolumab for first-line clear cell renal cancer：renal cell carcinoma：ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis，treatment and follow-up[J].Ann Oncol，202 32（3）：422-423.DOI：10.1016/j.annonc.2020.11.016.

［12］Yang J，Luo L，Zhao C，et al.A positive feedback loop between inactive VHL-Triggered histone lactylation and PDGFRβ signaling drives clear cell renal cell carcinoma progression[J].Int J Biol Sci，202 18（8）：3470-3483.DOI：10.7150/ijbs.73398.

［13］Larroquette M，Peyraud F，Domblides C，et al.Adjuvant therapy in renal cell carcinoma：current knowledges and future perspectives[J].Cancer Treat Rev，202 97：102207.DOI：10.1016/j.ctrv.2021.102207.

［14］Ingels A，Campi R，Capitanio U，et al.Complementary roles of surgery and systemic treatment in clear cell renal cell carcinoma[J].Nat Rev Urol，202 19（7）：391-418.DOI：10.1038/s41585-022-00592-3.

［15］Rosellini M，Marchetti A，Mollica V，et al.Prognostic and predictive biomarkers for immunotherapy in advanced renal cell carcinoma[J].Nat Rev Urol，202 20（3）：133-157.DOI：10.1038/s41585-022-00676-0.

［16］Deleuze A，Saout J，Dugay F，et al.Immunotherapy in renal cell carcinoma：the future is now[J].Int J Mol Sci，2020，21（7）：2532.DOI：10.3390/ijms21072532.

［17］Chang HH，Cheng YC，Tsai WC，et al.PSMB8 inhibition decreases tumor angiogenesis in glioblastoma through vascular endothelial growth factor A reduction[J].Cancer Sci，2020，111（11）：4142-4153.DOI：10.1111/cas.14625.

［18］Chang HH，Lin YH，Chen TM，et al.ONX-0914 Induces apoptosis and autophagy with p53 regulation in human glioblastoma cells[J].Cancers （Basel），202 14（22）：5712.DOI：10.3390/cancers14225712.

［19］Zhong Y，Yu F，Yang L，et al.HOXD9/miR-451a/PSMB8 axis is implicated in the regulation of cell proliferation and metastasis via PI3K/AKT signaling pathway in human anaplastic thyroid carcinoma[J].J Transl Med，202 21（1）：817.DOI：10.1186/s12967-023-04538-0.

［20］Heink S，Fricke B，Ludwig D，et al.Tumor cell lines expressing the proteasome subunit isoform LMP7E1 exhibit immunoproteasome deficiency[J].Cancer Res，2006，66（2）：649-652.DOI：10.1158/0008-5472.Can-05-2872.

［21］Fehling HJ，Swat W，Laplace C，et al.MHC class Ⅰ expression in mice lacking the proteasome subunit LMP-7[J].Science，1994，265（5176）：1234-1237.DOI：10.1126/science.8066463.

［22］De M，Jayarapu K，Elenich L，et al.Beta 2 subunit propeptides influence cooperative proteasome assembly[J].J Biol Chem，200 278（8）：6153-6159.DOI：10.1074/jbc.M209292200.

［23］Guo YJ，Pan WW，Liu SB，et al.ERK/MAPK signalling pathway and tumorigenesis[J].Exp Ther Med，2020，19（3）：1997-2007.DOI：10.3892/etm.2020.8454.

［24］Moon H，Ro SW.MAPK/ERK signaling pathway in hepatocellular carcinoma[J].Cancers （Basel），202 13（12）：3026.DOI：10.3390/cancers13123026.

［25］Barbosa R，Acevedo LA，Marmorstein R.The MEK/ERK network as a therapeutic target in human cancer[J].Mol Cancer Res，202 19（3）：361-374.DOI：10.1158/1541-7786.Mcr-20-0687.

［26］Anjum J，Mitra S，Das R，et al.A renewed concept on the MAPK signaling pathway in cancers：polyphenols as a choice of therapeutics[J].Pharmacol Res，202 184：106398.DOI：10.1016/j.phrs.2022.106398.

［27］Kciuk M，Gielecińska A，Budzinska A，et al.Metastasis and MAPK pathways[J].Int J Mol Sci，202 23（7）：3847.DOI：10.3390/ijms23073847.

［28］Lake D，Corrêa SA，Müller J.Negative feedback regulation of the ERK1/2 MAPK pathway[J].Cell Mol Life Sci，2016，73（23）：4397-4413.DOI：10.1007/s00018-016-2297-8.

［29］Chang L，Karin M.Mammalian MAP kinase signalling cascades[J].Nature，200 410（6824）：37-40.DOI：10.1038/35065000.

（收稿日期：2024-01-15）