摘要：對于膜翅目毒素過敏人群，膜翅目昆蟲蜇刺是其不可忽視的危險因素。我國現(xiàn)有的診斷工具無法提供準確的信息來明確致敏昆蟲，從而影響臨床的診斷和治療。蜜蜂為常見的膜翅目昆蟲，分布地域廣、數(shù)量多，且其毒素成分復雜，因此國內(nèi)外研究者已針對蜜蜂毒素主要變應原開展了相關重組變應原方案工作，這為變應原檢測提供了一定的理論基礎。變應原組分診斷技術的發(fā)展可實現(xiàn)準確檢測蜂毒變應原，這將為蜜蜂蜂毒過敏患者提供一套全新的臨床診斷和治療方案。

關鍵詞：膜翅目昆蟲蜇刺；蜜蜂毒素；重組變應原；變應原檢測；變應原組分診斷技術

中圖分類號： R593.1；Q819" 文獻標識碼： A" 文章編號：1000-503X（2024）04-0565-10

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15770

Research Progress in Detection of Bee Venom Allergens

ZHAO Huimin，LI Junda，CUI Le，GUAN Kai

Department of Allergy，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

Corresponding author：GUAN Kai Tel：13611113032，E-mail：dr_guankai@126.com

ABSTRACT：Hymenopteran insect stings are a risk factor that cannot be ignored for the people allergic to hymenopteran venoms.In China，the current diagnostic tools cannot provide accurate information to identify sensitized insects，thus affecting clinical diagnosis and treatment.Honeybee is a common hymenopteran insect.Due to its wide distribution，large number，and complex venom composition，researchers have carried out recombination schemes for the main allergens of honeybee venom，laying a theoretical foundation for the detection of allergens.The development of diagnostic technologies for allergen components can accurately detect bee venom allergens，providing a new set of clinical diagnosis and treatment schemes for the population allergic to bee venom.

Key words：hymenopteran insect sting；honeybee venom；allergen recombination；allergen detection；diagnosis technology of allergen components

Acta Acad Med Sin，2024，46（4）：565-574

每年全球約1億人被膜翅目昆蟲蜇傷，其中約7.5%的患者會發(fā)生嚴重過敏反應，蜇刺的膜翅目昆蟲已成為膜翅目毒素過敏人群不可忽視的危險因素［1-2］。據(jù)媒體報道，我國擁有多達2000余家蜜蜂養(yǎng)殖相關企業(yè)，養(yǎng)殖蜂群數(shù)量更超過820萬群，為世界第一大蜜蜂養(yǎng)殖蜂群擁有國，由此推測國內(nèi)養(yǎng)蜂從業(yè)人員多達萬計。另外，隨著人們生活水平的提高，戶外旅游者不計其數(shù)，這部分人群與專業(yè)養(yǎng)蜂人群同為蜜蜂蜂毒暴露高危人群。

膜翅目毒素過敏的臨床診斷是基于被昆蟲蜇刺的病史、皮試陽性反應和/或血清蜂毒特異性免疫球蛋白（specific immunoglobulin E，sIgE）的檢測［3］。目前蜂毒過敏診斷方法有很大的局限性，由于部分患者無法準確識別蜇刺的膜翅目昆蟲，這時無法結合臨床病史時，臨床檢測診斷只能給出一個相對客觀的結果。在臨床檢測診斷中，天然蜂毒毒素提取物的sIgE檢測也很難給出正確的診斷結果，這是因為膜翅目毒素過敏的交叉反應性和同源反應性，可能會使檢測結果產(chǎn)生假陽性，而且部分致敏變應原在蜂毒毒素中的低豐度也會產(chǎn)生一些假陰性結果。隨著變應原組分診斷技術（component-resolved diagnosis，CRD）的發(fā)展，對某一或某些致敏蛋白的變態(tài)反應進行準確定位成為可能，因此有必要獲得具有中國典型蜂毒變應原的相關資料和總結國內(nèi)外現(xiàn)有蜂毒檢測方案，以期為臨床診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 蜇刺的膜翅目昆蟲及蜜蜂簡介

1.1 膜翅目簡介

膜翅目是昆蟲綱中第三大的目，僅次于鞘翅目和鱗翅目，全世界已知約有15萬種膜翅目昆蟲，中國已知有2300余種［4］。膜翅目昆蟲廣泛分布于世界各地，以熱帶和亞熱帶地區(qū)種類最多，因其雌蟲產(chǎn)卵器發(fā)達，一般呈鋸狀、刺狀或針狀，在高等類群中特化為螫針，可作為攻擊的武器。膜翅目按照經(jīng)典分類方法分為細腰亞目和廣腰亞目，蜜蜂科、胡蜂科和蟻科是細腰亞目中常見的蜇刺昆蟲，蜇刺的膜翅目昆蟲使用螯針主要有以下3個目的：（1）對巢資源的種內(nèi)競爭；（2）對捕食者的防御；（3）獵物捕獲。

大多數(shù)昆蟲如蜜蜂和胡蜂都是獨居的，在一般情況下，這些昆蟲不會為了保護他們的巢穴而進行蜇刺，同樣也不會對人類構成威脅，但有一部分蜜蜂和胡蜂物種是群居的，與獨居蜜蜂和胡蜂不同，群居蜜蜂和胡蜂在他們的巢穴遭遇危險時會因為自衛(wèi)而發(fā)生蜇刺，所以人類所面臨的主要蜇刺昆蟲是群居蜜蜂和胡蜂［5-6］。

膜翅目毒素過敏是所有蜇刺昆蟲過敏的患者產(chǎn)生嚴重過敏反應的直接原因，大多數(shù)人只會在被昆蟲蜇刺后出現(xiàn)常見的局部反應（如疼痛和瘙癢），但膜翅目毒素過敏的患者則會產(chǎn)生過敏反應，有可能危及生命。有研究估計，由膜翅目昆蟲蜇刺引起的局部過敏反應發(fā)生率為2.4%～26.4%，全身過敏反應發(fā)生率為0.6%～8.9%［7-12］。有研究顯示在高頻暴露的人群中如養(yǎng)蜂人和林業(yè)工人，分別有10%和21%的人報告曾經(jīng)歷過蜜蜂和胡蜂蜇刺后引起的全身過敏反應［13-14］。另有研究顯示在土耳其養(yǎng)蜂人被蜇刺后引起的全身過敏反應發(fā)生率為6.5%，在中國養(yǎng)蜂人被蜇刺后引起的全身過敏反應發(fā)生率為28%［15-16］。

1.2 蜜蜂簡介

蜜蜂屬膜翅目、蜜蜂科，體長為8～20 mm，黃褐色或黑褐色，生有密毛；頭與胸幾乎同樣寬，觸角膝狀，復眼為橢圓形，有毛，口器嚼吸式，后足為攜粉足；兩對膜質翅：前翅大，后翅小，前后翅以翅鉤列連鎖；腹部近橢圓形，體毛較胸部為少，腹末有螯針；一生要經(jīng)過卵、幼蟲、蛹和成蟲4個蟲態(tài)。中華蜜蜂是東亞的本土蜜蜂之一，在日本、中國、印度、菲律賓群島和馬來地區(qū)都有發(fā)現(xiàn)。直到近代大量引入了意大利蜜蜂，因其產(chǎn)蜜量高，繁殖快，很快在數(shù)量上超過了中華蜜蜂［17］。不同地理位置的中華蜜蜂之間存在著相當明顯的遺傳差異，根據(jù)mtDNA編碼序列分析，可將中華蜜蜂分為日韓型、中國大陸型、中國臺灣型、馬來西亞沙巴-印度黑型、中國海南型、印度黃型、泰國南部型和印度黑型8種類型［18］。在中國，自1896年從意大利等國傳入大量的意大利蜜蜂，中華蜜蜂的數(shù)量占比逐漸下降。在意大利蜜蜂的競爭下，中國蜜蜂的分布面積減少了75%以上，種群數(shù)量減少了80%以上。東亞其他國家的中華蜜蜂數(shù)量也有所下降［19］。

蜜蜂毒腺產(chǎn)生的蜜蜂毒素（honeybee venom，HBV）是一種復雜的混合物，包括蛋白質、多肽、氨基酸、磷脂、糖、生物胺、揮發(fā)性化合物等多種物質和接近80%的水分［20-22］。HBV中的蛋白質組成也非常復雜，目前HBV中已鑒定的蛋白質和多肽就有113種，而且N-糖基化位點和蛋白質的異質性又進一步增加了蛋白質和多肽的種類和數(shù)量［23］。HBV的致敏成分主要是酶和糖蛋白，相對分子量為（3～200）×103之間。根據(jù)生物學作用，HBV中確定的變應原分為主要變應原和次要變應原，主要變應原指超過50%的過敏者都具有sIgE的HBV特定成分，次要變應原為低于50%的過敏者都具有sIgE的HBV特定成分［24］。

2 蜂蜇傷后的生理反應和過敏反應

蜂蜇傷后會引起臨床生理反應和過敏反應，這些反應均可引起患者的死亡，對于蜂毒過敏人群，蜂蜇傷后的生理反應和過敏反應的雙重作用可能使病情更為嚴重，且不容忽視。

2.1 蜂蜇傷后的生理反應

生理反應一方面表現(xiàn)為局部炎性反應，以局部紅腫、疼痛和瘙癢等為主，隨著時間的推移癥狀會逐漸消失；另一方面為毒性反應，有肝毒性、腎毒性、溶血、肌肉毒性及神經(jīng)毒性等［25-27］。蜂蜇傷后導致患者的生理反應常表現(xiàn)為器官功能不全，尤其以腎臟最為常見，其次為心血管系統(tǒng)及血液系統(tǒng)，嚴重者會有多器官功能障礙綜合征［27］。有研究數(shù)據(jù)顯示1091例蜂蜇傷患者病死率為5.1%，其中50% 死于多器官功能障礙綜合征，多器官功能障礙綜合征是蜂蜇傷致死的首要原因［10］。

2.2 蜂蜇傷后的過敏反應

蜂蜇傷后的過敏反應是僅次于食物抗原導致的過敏反應（33%～34%），占所有過敏反應的比例為14%［28-29］。雖然蜂毒過敏有多種機制，但常見的機制是由蜂毒激活的變應原sIgE 與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的高親和力Fc受體結合介導的Ⅰ型超敏反應，這些高親和力Fc受體與變應原sIgE交聯(lián)可活化肥大細胞，釋放介質（如組胺），使血管滲透性增加及血管擴張，引起相應部位的過敏癥狀，常見的有蕁麻疹、血管性水腫、呼吸道癥狀（呼吸困難或哮喘）和心血管癥狀（低血壓和過敏性休克） 等［30-31］。有研究表明，sIgE不僅會使機體產(chǎn)生過敏反應，還會使機體產(chǎn)生獲得性免疫力，其原理為sIgE相關免疫反應可導致肥大細胞和嗜堿性粒細胞激活，肥大細胞產(chǎn)生肥大細胞蛋白酶，可降解毒素中所存在的部分毒素，從而增強機體對毒素的先天和后天抵抗力［32-33］。肥大細胞除了釋放蛋白酶外，還可通過其他機制在先天或后天免疫反應中幫助增強對毒素的抵抗力［34］。體外研究證明肥大細胞生成高價陰離子的肝素可與羅素蛇毒中陽離子毒素所結合，從而使蛇毒毒性降低［35］。在理想狀況下，研究者應將考慮如何能使sIgE介導的免疫調節(jié)維持在一個幫助機體增強對毒素的先天和后天抵抗力水平，且并不會引起嚴重的過敏反應。

除常見的Ig E介導的Ⅰ型超敏反應，蜂毒過敏還有其他可能的相關機制，如免疫復合物反應和延遲型反應等超敏反應［36］。免疫復合物型反應可導致各種綜合征，這具體取決于相關機制所產(chǎn)生的抗體，會引起不同類型的病癥，如蜂毒抗原產(chǎn)生的sIgG抗體與毒素抗原結合形成免疫復合物，這些免疫復合物沉積可能會導致血清病樣綜合征和腎小球腎炎［37］。

蜂毒過敏反應分為以下3個類別：（1）局部反應：風團和紅暈等。（2）大局部反應指蜂蜇局部腫脹直徑超過10 cm，且持續(xù)時間大于 1 d［38-39］。（3）全身性嚴重過敏反應指蜂蜇部位以外的組織和/或器官出現(xiàn)臨床癥狀和體征。根據(jù)世界過敏組織2020年過敏反應指南全身過敏反應嚴重程度分級，其中第5級最為嚴重［40］（表1）。

3 蜂毒檢測時的影響因素

面對蜂蜇傷后的患者，準確診斷其過敏因素，有利于臨床醫(yī)師制訂合適恰當?shù)脑\療方案。皮試和sIgE檢測是蜂毒過敏的主要檢測手段，但以下因素會影響目前對膜翅目毒素檢測。

3.1 蜂毒過敏原的交叉反應性和同源反應性

多糖結構對蜂毒蛋白的特性有重要影響，并構成了交叉反應性碳水化合物決定因子（cross-reactive carbohydrate determinants，CCD），這是膜翅目和植物變應原的特性，會干擾治療策略的診斷和設計［41-43］。

Müller等［44］發(fā)現(xiàn)，使用slgE對HBV活性蛋白組分Api m 1和胡蜂蜂毒（yellow jacket venom，YJV）活性蛋白組分Ves v 5進行檢測，有59%的過敏患者雙陽性。97%的HBV過敏患者和17%的YJV過敏患者檢測到Api m 1的slgE，87%的YJV過敏患者和17%的HBV過敏患者檢測到Ves v 5的slgE。在雙陽性患者中，有37%的YJV過敏患者和56%的HBV過敏患者是由于CCD引起的假陽性，這在HBV患者中更常見。同時關凱等［45］報道8例HBV和YJV雙陽性患者中，7例對Ves v 5 sIgE陰性，僅有1例對HBV和YJV雙過敏患者對Ves v 5 sIgE為8.03 kUA/L。以上表明，常規(guī)蜂毒提取物在皮膚和血清學測試中的陽性結果并不總是反映真正的致敏作用，而是由抗體與CCD或者與蛋白質變應原中的同源肽序列交叉反應產(chǎn)生的陽性結果（如透明質酸酶和二肽基肽酶IV）［46-50］。

蜂毒提取物雙陽性可能與sIgE對CCD的交叉反應有關［34，51-52］。Koroec等［53］報道了91%的HBV過敏患者對具有CCD的天然Api m 1的sIgE反應陽性（≥0.35 kUA/L），而對缺乏CCD的重組Api m 1的sIgE反應僅為57%。在缺乏CCD反應組中，天然Api m 1和重組Api m 1有相同的sIgE水平，這表明在缺乏CCD的HBV過敏患者中，天然Api m 1和重組Api m 1與sIgE的結合情況相似［54］。在經(jīng)歷嚴重過敏反應的受試者中，天然Api m 1中sIgE陽性多于重組Api m 1陽性的情況更為明顯［38］。同樣，另一項研究顯示，約80.5%的雙陽性患者存在對CCD有反應的sIgE，這可能是雙陽性的潛在原因［34］。使用能區(qū)分種屬的重組主要變應原重組Api m 1和重組Ves v 5使診斷得到了改善，他們沒有CCD的反應，這有助于區(qū)分真正的雙重致敏性和交叉反應性。少數(shù)（8/33，24%）對蜂毒提取液雙陽性的缺乏CCD反應的患者對重組Api m 1和重組Ves v 5均有真正的致敏作用，而大多數(shù)（22/33，66%）僅對這兩種中的任何一種有致敏作用［55］。在單致敏組，用一種主要致敏昆蟲毒素進行免疫治療足以達到良好效果，反之，使用多種類蜂毒的免疫治療可能會適得其反。

天然變應原的碳水化合物表位不能完全解釋雙陽性。Ellis等［38］發(fā)現(xiàn)只有9%（16/174）的受試者對CCD表現(xiàn)出sIgE反應性。迄今為止，除CCD外，蜂毒過敏患者的雙陽性主要歸因于sIgE靶向的透明質酸酶（Api m 2和Ves v 2）或二肽基肽酶（Api m 5和Ves v 3）等具有同源肽序列［31-33，56］。Api m 12和Ves v 6在蛋白水平上具有大約40%的序列同源性，可能存在共同反應的表位，從而在蛋白水平上具有交叉反應性。Blank等［46］從對HBV或YJV皮內(nèi)皮膚試驗陰性的患者血清中檢測了sIgE對Api m 12和Ves v 6的反應性，三種血清對Api m 12和Ves v 6均顯示sIgE陽性，這表明在蛋白質水平上存在分子交叉反應，或至少證明在CCD之外還存在共敏作用［57］。

3.2 全毒素提取物的局限性

蜂毒過敏患者使用全毒素提取物制劑進行檢測，其結果有很大的局限性。蜂毒全毒素中包含許多致敏成分，大量試驗表明，全蜂毒制劑中特定變應原的低豐度可能會使檢測人員錯過真正的致敏因素，檢測結果呈現(xiàn)假陰性，使用主要變應原成分對患者進行檢測，就會得到真實的結果［58-60］。因此，使用全毒素制劑對毒素免疫治療方案的制訂可能會形成阻礙，而且在制作全毒素蜂毒制劑時，由于處理方式的差異，部分不穩(wěn)定變應原可能會降解，這也會對檢測結果造成影響。

4 現(xiàn)有蜂毒過敏的臨床診斷方法及原理

4.1 現(xiàn)有蜂毒過敏的臨床診斷方法

蜂毒過敏的常規(guī)診斷是基于過敏性蜇刺反應（由患者確定），陽性的皮膚試驗和/或sIgE的檢測。由于國內(nèi)尚無蜂毒相關體內(nèi)診斷試劑，故相關研究多采用sIgE檢測的方法評估蜜蜂蜂毒致敏狀況。隨著分子生物學和重組變應原技術的發(fā)展，CRD有助于蜂毒過敏的診斷，提高了真正區(qū)分多重致敏性和交叉反應性的能力。針對蜂毒的sIgE檢測常用試劑為重組的主要致敏蛋白，且這些致敏蛋白大多由桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)表達生成的，相較于原來的全毒素提取物制劑，重組試劑大大提高了診斷的準確性和直觀性。

當常規(guī)診斷方法都不能檢測出對蜂毒的過敏時，且患者有確切過敏反應史，臨床醫(yī)師可建議進行嗜堿性粒細胞激活試驗［61］。Peternelj等［62］發(fā)現(xiàn)，在蜂毒過敏的診斷中，嗜堿性粒細胞激活試驗的臨床敏感性高于皮膚點刺試驗和sIgE的檢測。有報道稱，在某些患者中，嗜堿性粒細胞激活試驗也可出現(xiàn)由CCD引起的假陽性結果，且嗜堿性粒細胞激活試驗是昂貴的、耗時的，因此很少用于臨床常規(guī)檢測［63］。

4.2 重組方法制備檢測試劑的必要性

重組主要變應原方法可用于評估蜂毒化合物的致敏性和臨床相關性，且由于重組蛋白適當折疊和正確翻譯后修飾是建立構象表位的基礎，因此，重組致敏蛋白不僅可用來建立安全、有效的診斷方式，而且可制備準確安全的脫敏原（治療方案所需的）［64］。昆蟲細胞表達系統(tǒng)的產(chǎn)物因沒有CCD的存在，可提供更為準確的診斷依據(jù)，因此也常用來檢測變應原的sIgE反應性。

相較于傳統(tǒng)的大腸桿菌表達系統(tǒng)，昆蟲表達系統(tǒng)用于制備重組蜜蜂蜂毒的主要變應原更具優(yōu)勢，表現(xiàn)為以下兩方面：（1）表達量高，昆蟲細胞表達系統(tǒng)的晚期基因表達是在病毒粒子形成之后，有利于細胞毒性蛋白的表達。（2）大腸桿菌表達系統(tǒng)的產(chǎn)物表達形式為包涵體，需復性處理才能有活性，且表達產(chǎn)物活性較低，因此用大腸桿菌有很大的局限性；而昆蟲細胞表達系統(tǒng)具有識別信號肽，可對表達產(chǎn)物進行正確切割，而桿狀病毒在真核細胞內(nèi)進行復制，保證產(chǎn)物具有后加工作用，有利于蛋白具有活性，避免形成包涵體。

重組不同蜂毒制劑大大提高了診斷的可用性，如Api m 3和Api m 10雖然存在于天然HBV中，但因其低豐度，在用于HBV免疫治療的制劑中缺失或代表性不足。使用重組蜂毒組分試劑對蜂毒過敏的診斷和治療都會提供更準確的方向。

隨著CRD的發(fā)展，重組蜂毒變應原后所獲得的主要致敏蛋白組分，將會為臨床準確的sIgE免疫測定和安全有效的免疫治療提供物質基礎［66］。但值得注意的是，目前只有有限數(shù)量的蜂毒變應原可作為重組致敏蛋白［66-67］。

HBV過敏是膜翅目毒素過敏的第二種最常見形式，特別是在兒童、養(yǎng)蜂人及其親屬以及其他被蜇傷風險較高的個體中觀察到［68］。HBV過敏是由毒素中存在的蛋白質變應原成分sIgE抗體介導的。HBV的蛋白質組成非常復雜，至少有113種鑒定的蛋白質和肽［69］。目前，12種不同的HBV蛋白已被確認為變應原，但我國這方面研究還很少，因此針對我國HBV過敏人群應確立符合我國人群的HBV主要致敏蛋白，并制備出重組致敏蛋白和研發(fā)出相應的診斷工具，以便后續(xù)輔助臨床診斷和HBV免疫治療。

4.3 國內(nèi)外現(xiàn)有針對蜜蜂蜂毒過敏主要致敏蛋白的重組方案

桿狀病毒-昆蟲表達系統(tǒng)是目前蜜蜂蜂毒主要致敏蛋白制備應用最為廣泛的重組系統(tǒng)。其制備方案流程普遍為重組桿狀病毒質粒的構建、重組桿狀病毒的獲得、脂質體轉染昆蟲細胞及鑒定和蛋白的純化與收集。對所獲病毒鑒定常用PCR產(chǎn)物進行電泳檢查，對所獲目的蛋白常用SDS-PAGE和Western blot對其進行鑒定。重組系統(tǒng)獲得蜂毒蛋白流程相對于蜂毒中天然提取變應原更為簡單，且更具經(jīng)濟效益。以下介紹國內(nèi)外幾種蜂毒致敏蛋白的重組方案：

磷脂酶A 2（含Api m 1）：Api m 1是HBV中的主要變應原成分，占HBV干重的12%～15%［70］。沈立榮［71］分別用大腸桿菌表達系統(tǒng)和桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)制備Api m 1，結果顯示桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)出的Api m 1具有更高的表達量和活性，該研究所選用的昆蟲細胞系為Tn-5B1-4（即High Five細胞），與草地貪夜蛾細胞Sf21等相比，具有細胞體積大、感染能力高、表達量高等優(yōu)點，更具生產(chǎn)意義和研究價值。

酸性磷酸酶（含Api m 3）：Api m 3也是HBV過敏的標志變應原，Grunwald等［72］報道了意蜂毒腺Api m3蛋白cDNA的克隆構建及其在真核昆蟲細胞中的全長表達。為了構建具有更高表達率的昆蟲表達載體，在載體加入分泌重組蛋白的蜂毒蛋白信號序列，并優(yōu)化Kozak序列，所用的細胞系同為High Five細胞。有研究采用酶聯(lián)免疫分析法測定蜜蜂蜂毒致敏患者血清sIgE抗體與重組Api m3的免疫反應性，并用天然的Api m 1 作為對照，研究者發(fā)現(xiàn)有1例患者在蜂毒血清學檢測結果顯示陰性，但在用重組Api m 3酶聯(lián)免疫分析法測定結果明顯陽性，這也證實了Api m 3在蜂毒中的低豐度可能是造成漏診真正的原因［72］。

二肽基肽酶（含HBV中的Api m 5和YJV中的Ves v 3）：Api m 5是HBV的主要過敏原成分，Ves v 3是YJV的變應原成分。Blank等［46］研究顯示Api m 5和Ves v 3為同源物，是蜂毒過敏的主要變應原。Spodoptera frugiperda（以下簡稱Sf9）昆蟲細胞與High Five細胞表達系統(tǒng)相比，表現(xiàn)出顯著降低的a-1，3核心巖藻糖基轉移酶活性，Sf9昆蟲細胞產(chǎn)物沒有被免疫檢測出CCD［73-75］。

Icarapin variant 2（含Api m 10）：Api m 10也是HBV過敏的主要變應原，在大約50%的HBV過敏患者中可以表現(xiàn)出sIgE反應性，且不存在CCD，因此Api m 10可能成為膜翅目蜂毒過敏的CRD和改進免疫治療方法的關鍵元素［76-77］。HBV過敏的成分解析致敏特征表明，在HBV免疫治療中，Api m 10對sIgE致敏是治療失敗的危險因素。在對Api m 1、Api m 2、Api m 3和Api m 5的過敏有應答者和無應答者之間，sIgE水平?jīng)]有觀察到差異。相反，在無反應者中，Api m 10的sIgE中度但顯著升高。Api m 10是HBV致敏的最佳鑒別變應原（特異性95%，敏感性25%），并且脫敏治療失敗的優(yōu)勢比為8.444（P=0.0013）。一些（但不是所有）脫敏治療HBV制劑顯示有Api m 10缺失［78］。VIT誘導結果顯示，只有在接受HBV治療和可檢測到Api m 10的過敏有應答的患者中，才觀察到顯著的sIgG4［78］。

Blank等［79］比較分析了不同糖基化Api m 10蛋白的sIgE反應性和嗜堿性粒細胞活化數(shù)據(jù)，確定了糖基化Api m 10蛋白在HBV中主要變應原的地位。Seismann等［80］設計了3種重組體系（大腸桿菌表達系統(tǒng)、Sf9昆蟲細胞表達系統(tǒng)和High Five昆蟲細胞表達系統(tǒng)）制備Api m 10，研究者檢測3種Api m 10產(chǎn)物的反應性，結果表明，僅有High Five細胞的Api m 10產(chǎn)物在自體真核表達下產(chǎn)生明顯CCD的交叉反應性，這些數(shù)據(jù)表明，重組的宿主決定了糖基化狀態(tài)，從而影響了變應原的特征。與之前采用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備重組蛋白報道不同的是，有研究對大腸桿菌表達系統(tǒng)進行了優(yōu)化，利用真核桿狀病毒表達系統(tǒng)或幾丁質結合結構域融合的策略，在大腸桿菌中進行自催化蛋白介導的裂解，獲得了可溶性重組Api m10［77］。同時，也有研究使用Sf9昆蟲細胞系構建重組系統(tǒng)，以避免在自體真核表達下產(chǎn)生CCD從而影響結果［60］。

5 蜂毒過敏臨床診斷

毒素過敏診斷是臨床醫(yī)師通過檢測sIgE抗體發(fā)現(xiàn)單個或多種致敏毒素成分后做出綜合分析結論?，F(xiàn)已鑒定的蜂類變應原也可作為重組抗原用于CRD，識別CRD對特定分子靶點的sIgE反應有助于通過區(qū)分物種、鑒定多重陽性或同源交叉反應來微調診斷，最終進行準確的診斷，這樣有利于臨床醫(yī)師制訂包括毒素免疫療法在內(nèi)的有效治療方案［81］。

對蜂毒過敏患者進行檢測時，sIgE檢測有助于醫(yī)生準確地對引起過敏的毒素成分進行診斷，并提高治療決策。CRD一方面提高了sIgE檢測的敏感性，增強了其區(qū)分致敏和交叉反應的能力，準確識別患者的致敏變應原，有助于避免不必要或無效的治療，還可以避免新的致敏變應原，最大限度地減少不良反應，并降低治療成本［82］。

6 HBV變應原

最常見的HBV變應原是Api m 1，Api m 2和Api m 4，在蜜蜂全毒素中的含量高。不常見的變應原有Api m 3、Api m 5、Api m 10和Api m 11［83］。蜂毒制劑如花粉或螨蟲提取物等變應原提取物一樣，由于處理方式的差異，部分不穩(wěn)定變應原會降解，且某些具有代表性的特定變應原含量較低，影響了診斷準確性和一致性。

除去傳統(tǒng)常見的HBV變應原，目前國外常用主要變應原組分還有很多，但由于地域不同和樣本的差異，在國內(nèi)可能會得到不同的數(shù)據(jù)。針對中國蜂毒過敏人群典型的變應原，進行變態(tài)反應成分分辨診斷技術方面的研究，設計出一款全新準確且便捷的診斷工具，將可能成為針對中國蜂毒過敏人群診斷領域的一個全新突破。

7 總結和展望

由于我國是世界第一蜜蜂養(yǎng)殖群擁有國，國內(nèi)養(yǎng)蜂從業(yè)人員基數(shù)巨大，因此，蜜蜂蜂毒過敏不容忽視，但是我國現(xiàn)有的HBV診斷方式單一，僅使用血清體外診斷技術。由于天然蜂毒試劑中蜂毒組分的缺失或者低豐度的影響，可能會造成檢測結果的假陰性；天然蜂毒試劑中蜂毒組分之間的同源性和CCD的存在，亦可以造成檢測結果的假陽性，但蜂毒重組試劑規(guī)避了天然蜂毒的局限性，往往能為醫(yī)師提供更為準確的診斷結果。因此，本文總結了目前國內(nèi)外現(xiàn)有的幾種典型蜜蜂蜂毒重組變應原的制備方案，可為重組試劑制備提供理論基礎，有利于研究者開發(fā)全新準確便捷的檢測手段和安全可靠的診斷方案。隨著CRD的發(fā)展，sIgE檢測有助于醫(yī)生準確地對引起過敏的毒素成分進行診斷，并提高治療決策，還可以使患者避免新的致敏，最大限度地減少不良反應，并降低治療成本。因此，可通過大規(guī)模收集臨床病例，確定中國人群中意大利HBV中常見的過敏原組分，構建并制備HBV變應原組分重組蛋白，為將來的HBV過敏患者提供全新的檢測方案，也將為未來我國蜂毒毒素免疫療法奠定基礎。在將來，我們預期將防治關口提前，由治已病到治未病，盡可能避免HBV過敏人群的嚴重過敏反應的發(fā)生，保障廣大人民群眾生命安全。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 趙慧敏：研究思路的提出，文獻檢索和文章撰寫；李俊達、崔樂：文獻篩選，資料的提取和整理；關凱：論文的修訂、質量控制和審查，并同意対研究工作誠信負責

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（收稿日期：2023-07-20）