摘要：目的 探討紫檀芪對人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo的作用，并研究核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）在紫檀芪作用LoVo細(xì)胞過程中的調(diào)控機(jī)制。方法 應(yīng)用不同濃度的紫檀芪（5、10、20、40、60、80、100 μmol/L）處理LoVo細(xì)胞。CCK-8檢測細(xì)胞活力，劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移，Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲，TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡，JC-1檢測線粒體膜電位水平，2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯檢測活性氧水平，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)Nrf2、磷酸化的Nrf2、血紅素加氧酶-1及凋亡蛋白（Bcl2、Bax）的蛋白表達(dá)。此外，聯(lián)合應(yīng)用Nrf2特異性激動劑蘿卜硫素后，重復(fù)檢測細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率及Nrf2的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對照組相比，40、60、80、100 μmol/L紫檀芪均可顯著降低細(xì)胞活性（P=0.014，Plt;0.001，Plt;0.001，Plt;0.001）。5、10、20 μmol/L紫檀芪對LoVo細(xì)胞活性無影響，但可顯著抑制細(xì)胞遷移（P=0.008，Plt;0.001，Plt;0.001）和侵襲（P均lt;0.001）。TUNEL染色、JC-1、2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯染色結(jié)果顯示40、60、80 μmol/L紫檀芪增加LoVo細(xì)胞凋亡（P=0.014，Plt;0.001，Plt;0.001），使線粒體膜電位去極化（P=0.026，Plt;0.001，Plt;0.001）并增加細(xì)胞內(nèi)活性氧聚積（P均lt;0.001）。40、60、80 μmol/L紫檀芪下調(diào)了LoVo細(xì)胞中磷酸化的Nrf2（P=0.030，Plt;0.001，Plt;0.001）、血紅素加氧酶-1（P=0.015，Plt;0.001，Plt;0.001）、Bcl2（P=0.039，Plt;0.001，Plt;0.001）的蛋白表達(dá)；60、80 μmol/L紫檀芪降低了Nrf2的蛋白表達(dá)（P=0.001，Plt;0.001），增加了Bax的蛋白表達(dá)（P均lt;0.001）。應(yīng)用蘿卜硫素聯(lián)合處理后，紫檀芪抑制細(xì)胞活性（Plt;0.001）、增加細(xì)胞凋亡（Plt;0.001）及下調(diào)Nrf2表達(dá)（P=0.022）的作用明顯減弱。結(jié)論 紫檀芪是一種有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的化合物，其抗癌機(jī)制與抑制Nrf2通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：紫檀芪；核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2；結(jié)腸癌；細(xì)胞凋亡；活性氧

中圖分類號： R574.6" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A" 文章編號：1000-503X（2024）04-0482-08

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15988

Effect of Pterostilbene Regulating Nuclear Factor E2-Related Factor 2 on Apoptosis of Colon Cancer Cells in Vitro

SHI Xuehui1，2，F(xiàn)AN Chongxi2，YANG Quanlong1，2，WANG Xiaoying2，3，ZHAO Donglin1，2，LI Manhua2，WU Xueliang4，F(xiàn)AN Jianchun1，NING Shoubin2

1Postgraduate School，Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China

2Department of Gastroenterology，Air Force Medical Center of People’s Liberation Army，Beijing 100142，China

3The College of Life Sciences，Northwest University，Xi’an 710000，China

4Department of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou，Hebei 075000，China

Corresponding author：NING Shoubin Tel：010-66928232，E-mail：ning-shoubin@163.com

ABSTRACT：Objective To investigate the effects of pterostilbene on human colon cancer LoVo cells and study the regulatory mechanism of nuclear factor E2-related factor 2 （Nrf2） in the process of pterostilbene acting on LoVo cells.Methods LoVo cells were treated with different concentrations （5，10，20，40，60，80，100 μmol/L） of pterostilbene.Cell viability，migration，invasion，and apoptosis were examined by CCK-8，scratch，Transwell，and TUNEL assays，respectively.The mitochondrial membrane potential was measured by the mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1.The reactive oxygen species level was measured by 2’，7’-dichlorofluorescein diacetate.The protein levels of Nrf2，phosphorylated Nrf2，heme oxygenase 1，and apoptotic proteins （Bcl2 and Bax） were determined by Western blotting.In addition，cell viability，Nrf2 expression，and apoptosis rate were determined after co-application of the Nrf2-specific agonist sulforaphane.Results Compared with the control group，40，60，80，100 μmol/L pterostilbene reduced the viability of LoVo cells （P=0.014，Plt;0.001，Plt;0.001，Plt;0.001）.Pterostilbene at 5，10，20 μmol/L did not show effects on cell viability but inhibited cell migration （P=0.008，Plt;0.001，Plt;0.001） and invasion （all Plt;0.001）.Pterostilbene at 40，60，80 μmol/L increased apoptosis （P=0.014，Plt;0.001，Plt;0.001），promoted mitochondrial membrane potential depolarization （P=0.026，Plt;0.001，Plt;0.001） and reactive oxygen species accumulation （all Plt;0.001），and down-regulated the expression of phosphorylated Nrf2 （P=0.030，Plt;0.001，Plt;0.001），heme oxygenase 1 （P=0.015，Plt;0.001，Plt;0.001），and Bcl2 （P=0.039，Plt;0.001，Plt;0.001） in LoVo cells.Pterostilbene at 60，80 μmol/L down-regulated Nrf2 expression （P=0.001，Plt;0.001） and up-regulated Bax expression （both Plt;0.001）.The application of sulforaphane reversed the effects of pterostilbene on cell viability （Plt;0.001），apoptosis （Plt;0.001），and Nrf2 expression （P=0.022）.Conclusion Pterostilbene is a compound that can effectively inhibit colon cancer cells by inhibiting the Nrf2 pathway.

Key words：pterostilbene；nuclear factor E2-related factor 2；colon cancer；apoptosis；reactive oxygen species

Acta Acad Med Sin，2024，46（4）：482-489

結(jié)腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率高且手術(shù)和放化療預(yù)后不佳，極易出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和耐藥，據(jù)統(tǒng)計，2020年結(jié)腸癌發(fā)病率為10%，死亡率為9.4%［1］。氧化應(yīng)激損傷是指當(dāng)細(xì)胞受到持續(xù)刺激時，線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），致使其功能異常，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡［2］。核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）是機(jī)體強(qiáng)大的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激蛋白，在氧化應(yīng)激損傷狀態(tài)下，Nrf2發(fā)生磷酸化，激活血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表達(dá)，發(fā)揮調(diào)節(jié)ROS、緩解炎性反應(yīng)以及介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展的作用［3-4］。紫檀芪主要存在于葡萄、藍(lán)莓等漿果中，具有抗氧化、抑制癌細(xì)胞增殖的功效［5］。有研究表明，紫檀芪能夠抑制Nrf2依賴的抗氧化防御系統(tǒng)，降低黑色素瘤和胰腺癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)［6］；但Nrf2在紫檀芪調(diào)控結(jié)腸癌生物學(xué)活性中的具體機(jī)制尚未完全闡明。本研究旨在探討紫檀芪對結(jié)腸癌的作用，并分析紫檀芪調(diào)控Nrf2發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用的潛在機(jī)制，為揭示紫檀芪抗結(jié)腸癌提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo（CL-0144）和DMEM高糖培養(yǎng)基（PM150210B）（武漢普諾賽生命科技有限公司），紫檀芪（T2888）和蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）（TQ0207）（美國TargetMol公司），CCK-8試劑盒（AQ308）、二甲基亞砜（AQ62650）和蛋白裂解液（AQ521）（北京翱擎生物科技有限公司），Transwell小室（CLS3422）和基質(zhì)膠（356234）（美國Corning公司），結(jié)晶紫染色液（G1062）（北京索萊寶科技有限公司），JC-1線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）熒光探針檢測試劑盒（40706ES60）（上海翊圣生物科技有限公司），細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒（11684795910）、蛋白酶抑制劑（04693132001）和磷酸酶抑制劑（049-06845001）（德國Roche公司），DAPI染色液（C02-04002）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），ROS檢測試劑盒（S0033S）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Nrf2（16396-1-AP）、HO-1（10701-1-AP）、Bcl2（12789-1-AP）和Bax（50599-2-Ig）抗體（美國Proteintech公司），磷酸化的Nrf2（phosphorylated Nrf2，p-Nrf2）（ab76026）抗體（美國Abcam公司），β-actin（T0022）抗體（美國Affinity公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（H+L）（ZB-2305）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）（ZB-2301）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

細(xì)胞生長于DMEM高糖完全培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清）中，培養(yǎng)環(huán)境37 ℃、5% CO2，隔天換液；細(xì)胞密度達(dá)90%以上時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.3 CCK-8試劑盒評估細(xì)胞活力

細(xì)胞接種于96孔板中（1×104個/孔），對照組為無血清培養(yǎng)基，紫檀芪（20、40、60、80、100 μmol/L）處理細(xì)胞24 h。結(jié)束后，每孔加入100 μL DMEM和10 μL CCK-8試劑，避光孵育2 h，使用多功能酶標(biāo)儀（SynergyH1，美國伯騰儀器有限公司）對細(xì)胞進(jìn)行450 nm的吸光度值檢測。

1.4 細(xì)胞劃痕和Transwell實驗

1.4.1 劃痕實驗

細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)（1×106個/孔）。當(dāng)細(xì)胞生長到匯合時，使用200 μL微量移液器槍頭在每孔中間劃成線形傷口。PBS洗滌3次，加入紫檀芪（0、5、10、20 μmol/L）處理24 h，使用倒置顯微鏡（Primovert iLED，德國蔡司公司）拍攝劃痕圖像，并測量分析劃痕之間的距離。

1.4.2 Transwell實驗

基質(zhì)膠稀釋液覆蓋在Transwell小室的上室（60 μL/孔），孵育3 h，水化后于上室接種細(xì)胞（8×104個/室）。上室細(xì)胞經(jīng)紫檀芪（0、5、10、20 μmol/L）干預(yù)后，下室加入DMEM高糖完全培養(yǎng)基（600 μL/孔）于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入0.1%結(jié)晶紫染色液染色10 min，棉簽擦拭未穿過聚碳酸酯膜上的細(xì)胞，倒置顯微鏡（Primovert iLED、德國卡爾蔡司公司）下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.5 TUNEL染色細(xì)胞凋亡檢測

紫檀芪（0、40、60、80 μmol/L）作用細(xì)胞24 h，多聚甲醛固定細(xì)胞，并用0.5% Triton X-100處理20 min，加入預(yù)制TUNEL工作溶液，37 ℃避光 1 h，用DAPI染色液顯色細(xì)胞核10 min。使用倒置熒光顯微鏡（Axio Scope A1，德國卡爾蔡司公司）拍攝圖像，并對凋亡細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

1.6 MMP檢測

紫檀芪（0、40、60、80 μmol/L）干預(yù)細(xì)胞24 h，加入JC-1工作液并在避光條件下培養(yǎng)20 min，棄去舊培養(yǎng)基，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌兩次，每孔加入500 μL無血清培養(yǎng)基，倒置熒光顯微鏡下（Axio Scope A1，德國卡爾蔡司公司）拍攝圖像，計算綠色熒光強(qiáng)度與紅色熒光強(qiáng)度比值，分析MMP去極化水平。

1.7 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測

紫檀芪（0、40、60、80 μmol/L）干預(yù)細(xì)胞24 h，無血清培養(yǎng)基將2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯稀釋為10 μmol/L，避光培養(yǎng)細(xì)胞20 min。倒置熒光顯微鏡下（Axio Scope A1，德國卡爾蔡司公司）拍攝圖像。

1.8 Western blot檢測

紫檀芪（0、40、60、80 μmol/L）作用細(xì)胞24 h，蛋白裂解液于冰上裂解細(xì)胞15 min，4 ℃環(huán)境下×12 000 g離心20 min，混合上樣緩沖液高溫變性。將蛋白樣品凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用含5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入相應(yīng)一抗（β-actin：1∶5000、Nrf2：1∶2000、p-Nrf2：1∶1000、HO-1：1∶3000、Bcl-2：1∶1000、Bax：1∶1000），4 ℃孵育過夜。次日將條帶孵育相應(yīng)二抗（1∶5000）中，室溫1.5 h，化學(xué)發(fā)光顯影，使用Bio-Rad成像系統(tǒng)（ChemiDoc MP，美國伯樂公司）采集數(shù)據(jù)。選取β-actin作為內(nèi)參。

1.9 應(yīng)用Nrf2激動劑重復(fù)實驗

為了驗證Nrf2在紫檀芪誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中的作用，篩選合適的Nrf2特異性激動劑SFN的應(yīng)用濃度（1、2、5、10 μmol/L），然后給予一定量SFN聯(lián)合紫檀芪（80 μmol/L）處理細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率及Nrf2蛋白檢測。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計軟件GraphPad prism 9進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間采用單因素方差分析評價均值差異，組間差異進(jìn)一步分析采用Dunnett-t檢驗。每組實驗均重復(fù)3次。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫檀芪對細(xì)胞形態(tài)和活力的影響

紫檀芪作用細(xì)胞24 h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，與對照組相比，隨著紫檀芪濃度增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸皺縮，且細(xì)胞附著數(shù)量逐漸下降（圖1）。CCK-8結(jié)果顯示，與對照組（100.00±1.41）%相比，20 μmol/L紫檀芪干預(yù)后細(xì)胞活力為（99.50±4.73）%（q=0.182，P=1.000），對細(xì)胞活力無影響。40、60、80、100 μmol/L紫檀芪干預(yù)后，細(xì)胞活力分別為（90.75±1.26）% （q=3.370，P=0.014）、（78.75±6.40）% （q=7.742，Plt;0.001）、（44.00±4.55）% （q=20.400，Plt;0.001）、（24.75±1.71）% （q=27.410，Plt;0.001），細(xì)胞活力均顯著下降。

2.2 紫檀芪對細(xì)胞遷移、侵襲的影響

5、10、20 μmol/L紫檀芪處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組（101.70±2.89）%相比，隨著濃度的增加，劃痕間距的增寬率分別增加至（122.00±10.58）% （q=4.165，P=0.008）、（138.70±2.31）% （q=7.579，Plt;0.001）、（154.70±4.16）% （q=10.860，Plt;0.001）（圖2A）。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，與對照組（103.20±2.48）%相比，5、10、20 μmol/L紫檀芪作用細(xì)胞24 h后，穿過Transwell小室基底膜的細(xì)胞侵襲率分別減少至（77.50±5.01）% （q=12.460，Plt;0.001）、（49.50±2.81）% （q=26.050，Plt;0.001）、（31.83±3.43）% （q=34.620，Plt;0.001）（圖2B）。

2.3 紫檀芪對細(xì)胞凋亡和MMP的影響

40、60、80 μmol/L紫檀芪處理24 h，與對照組相比，綠色熒光數(shù)量與藍(lán)色熒光數(shù)量比值均顯著增加（圖3A），對照組凋亡率為（1.33±0.58）%，40、60、80 μmol/L紫檀芪處理24 h后，細(xì)胞凋亡率分別增加至（11.00±1.73）% （q=3.760，P=0.014）、（25.00±4.00）% （q=9.204，Plt;0.001）、（50.67±4.51）% （q=19.190，Plt;0.001）。通過MMP檢測進(jìn)一步證實，40、60、80 μmol/L紫檀芪處理24 h，與對照組相比，隨著紫檀芪濃度的增加，綠色熒光強(qiáng)度與紅色熒光強(qiáng)度比值均顯著增加（圖3B），對照組去極化水平為（1.33±0.58）%，40、60、80 μmol/L紫檀芪處理24 h后，MMP去極化水平分別增加至（11.00±2.65）% （q=3.327，P=0.026）、（24.67±5.51）% （q=8.030，Plt;0.001）、（48.00±3.61）% （q=16.060，Plt;0.001）。

2.4 紫檀芪對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

與對照組（105.20±4.57）%相比，40、60、80 μmol/L紫檀芪處理24 h后，綠色熒光強(qiáng)度均顯著增加（圖4），ROS水平分別增加至（167.80±6.41）% （q=7.213，Plt;0.001）、（254.50±17.12）% （q=17.220，Plt;0.001）、（424.50±9.79）% （q=36.840，Plt;0.001）。

2.5 紫檀芪對Nrf2、HO-1以及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組（84.78±4.02）%相比，40、60、80 μmol/L紫檀芪處理細(xì)胞后下調(diào)了p-Nrf2的蛋白表達(dá)，p-Nrf2的蛋白表達(dá)分別為（75.97±3.31）% （q=3.220，P=0.030）、（63.89±3.32）% （q=7.635，Plt;0.001）、（50.91±2.60）% （q=12.380，Plt;0.001）；與對照組（73.66±3.47）%相比，60、80 μmol/L紫檀芪處理細(xì)胞后降低了Nrf2的蛋白表達(dá)，Nrf2的蛋白表達(dá)分別為（59.31±3.25）% （q=6.130，P=0.001）、（49.19±2.97）% （q=10.450，Plt;0.001），40 μmol/L紫檀芪［（68.79±1.23）%］與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=2.081，P=0.163）；與對照組（99.12±10.74）%相比，40、60、80 μmol/L紫檀芪處理細(xì)胞后下調(diào)了HO-1的蛋白表達(dá)，HO-1的蛋白表達(dá)分別為（77.83±6.41）%（q=3.730， P=0.015）、（58.83±3.11）% （q=7.059，Plt;0.001）、（40.16±5.41）% （q=10.330，Plt;0.001）；與對照組（98.08±1.33）%相比，40、60、80 μmol/L紫檀芪處理細(xì)胞后降低了Bcl2的蛋白表達(dá)，Bcl2的蛋白表達(dá)分別為（92.07±3.04）% （q=3.044，P=0.039）、（70.54±2.37）% （q=13.950，Plt;0.001）、（55.62±2.60）% （q=21.510，Plt;0.001）；與對照組（37.01±2.97）%相比，60、80 μmol/L紫檀芪處理細(xì)胞后上調(diào)了Bax的蛋白表達(dá)，Bax的蛋白表達(dá)分別為（87.08±5.18）% （q=12.490，Plt;0.001）、（101.90±7.15）% （q=16.180，Plt;0.001），40 μmol/L紫檀芪［（41.99±3.10）%］與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=1.241，P=0.498）（圖5）。

2.6 聯(lián)合應(yīng)用SFN后紫檀芪對細(xì)胞活性、凋亡和Nrf2蛋白的影響

為了證實Nrf2在紫檀芪誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的具體作用，將Nrf2激動劑SFN聯(lián)合應(yīng)用于實驗。1、2、5、10 μmol/L SFN處理細(xì)胞24 h后，CCK-8檢測顯示，與對照組（100.00±6.69）%相比，細(xì)胞活力分別為（100.70±5.89）% （q=0.146，P=1.000）、（98.75±8.48）% （q=0.270，P=0.996）、（98.30±6.53）% （q=0.367，P=0.988）、（86.05±4.51%）（q=3.014，P=0.029），提示SFN在濃度為10 μmol/L時，對細(xì)胞產(chǎn)生了毒性作用，因此，選用5 μmol/L用于后續(xù)實驗。CCK-8檢測顯示，與80 μmol/L紫檀芪（56.11±2.36）%相比，SFN聯(lián)合80 μmol/L紫檀芪細(xì)胞活力增加至（73.01±3.21）%（q=9.453，Plt;0.001）。細(xì)胞凋亡率檢測顯示，與80 μmol/L紫檀芪（48.00±2.65）%相比，SFN聯(lián)合80 μmol/L紫檀芪細(xì)胞凋亡率減少至（25.33±2.08）% （q=14.080，Plt;0.001）（圖6A）。Western blot結(jié)果顯示，與80 μmol/L紫檀芪（48.53±1.94）%相比，SFN聯(lián)合80 μmol/L紫檀芪上調(diào)了Nrf2蛋白的表達(dá)［（61.94±6.28）%；q=3.509，P=0.022］（圖6B）。

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，手術(shù)和放化療預(yù)后不佳，是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一［1］。Nrf2是結(jié)腸癌患者預(yù)后情況判定的指標(biāo)之一，其變化與結(jié)腸黏膜細(xì)胞病變密切相關(guān)；通常Nrf2發(fā)生磷酸化，激活下游蛋白HO-1的表達(dá)，發(fā)揮抑制結(jié)腸癌的作用［7］。紫檀芪是白藜蘆醇的甲基化衍生物，具有與白藜蘆醇類似的抗氧化、抗真菌、抑制癌細(xì)胞增殖的作用，且穩(wěn)定性和生物利用度更高［5］。紫檀芪作為一種有效的抗癌化合物，可通過激活多條分子通路發(fā)揮作用［8-13］。然而，紫檀芪對結(jié)腸癌的作用及潛在機(jī)制尚未完全闡明。

紫檀芪作為一種新興抗腫瘤的活性單體，具有抑制多種癌細(xì)胞增殖的功效。Feng等［10］研究顯示紫檀芪干預(yù)人食管癌細(xì)胞后細(xì)胞的活力顯著降低。本研究顯示PTE抑制了LoVo細(xì)胞的遷移和侵襲，隨著濃度的增加，紫檀芪降低了細(xì)胞活性。

紫檀芪通過誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Ning等［14］研究顯示，p53通過靶向Bcl2、Bax抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，Bcl2和Bax通過線粒體凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bcl2的表達(dá)水平降低或Bax表達(dá)水平升高時，可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。有研究顯示，紫檀芪干預(yù)口腔癌細(xì)胞后誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡，通過下調(diào)Bcl2以及增加Bax蛋白表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［15］。本研究顯示，給予LoVo細(xì)胞紫檀芪處理，Bax/Bcl2蛋白表達(dá)比值增加，表明紫檀芪誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡機(jī)制與Bcl2、Bax的蛋白表達(dá)有關(guān)。

ROS在細(xì)胞分裂、衰老和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，線粒體是氧氣消耗的主要場所，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時，線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，使其功能異常，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡［2］。因此，激活ROS堆積是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的重要途徑。有研究顯示多種中藥單體通過過度激活ROS的產(chǎn)生發(fā)揮抗癌作用［4，16］。另有研究表明紫檀芪增加了乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，證實紫檀芪誘導(dǎo)了ROS的堆積，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，發(fā)揮促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用［17］。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時，MMP的去極化使線粒體膜通透性增加，激活線粒體蛋白（如凋亡誘導(dǎo)因子等）從線粒體基質(zhì)釋放至胞質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究應(yīng)用2’，7’-二氯熒光素二乙酸酯檢測ROS水平顯示，綠色熒光強(qiáng)度明顯增加；進(jìn)一步通過JC-1檢測MMP顯示，綠色熒光強(qiáng)度與紅色熒光強(qiáng)度比值顯著增加；TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡顯示，綠/藍(lán)熒光數(shù)量比例增大。ROS的聚積、MMP去極化水平和細(xì)胞凋亡率增加，表明紫檀芪致使線粒體功能失衡，誘導(dǎo)細(xì)胞最終發(fā)生凋亡反應(yīng)。紫檀芪誘導(dǎo)了ROS的積聚，促進(jìn)MMP去極化水平進(jìn)一步加劇，升高了結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率，表明紫檀芪誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)是發(fā)揮促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。

Nrf2是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子，其在機(jī)體抗癌中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，在穩(wěn)定的生理狀態(tài)下，Nrf2主要與其抑制劑Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1結(jié)合，以非活性的狀態(tài)存在于胞質(zhì)中；在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2發(fā)生磷酸化，Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1與Nrf2解離，導(dǎo)致Nrf2從胞質(zhì)移位至胞核，并與抗氧化反應(yīng)元件位點(diǎn)結(jié)合，激活下游蛋白HO-1的表達(dá)發(fā)揮抗癌作用［18-21］。研究表明在結(jié)腸癌細(xì)胞中Nrf2被過度激活，通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞自我更新能力，誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和放化療的耐受等［7］。由于Nrf2的過度表達(dá)發(fā)揮促癌作用，應(yīng)用Nrf2抑制劑可能成為治療癌癥的新手段。研究者給予患者二甲雙胍治療后，結(jié)腸癌患者組織中Nrf2 mRNA表達(dá)水平顯著降低，改善了患者的預(yù)后［22］。另有研究顯示，漢黃芩素通過誘發(fā)ROS的積聚，抑制Nrf2的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡［23］。本研究紫檀芪誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)的同時，伴隨著Nrf2、p-Nrf2以及Nrf2的下游調(diào)控蛋白HO-1表達(dá)下調(diào)。SFN可以阻止Nrf2的泛素化進(jìn)而減少Nrf2的降解，聯(lián)合應(yīng)用SFN后明顯減弱了紫檀芪對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用，表明紫檀芪通過抑制Nrf2誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。

綜上，紫檀芪通過顯著增加ROS堆積，抑制Nrf2/HO-1表達(dá)，從而有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。因此，紫檀芪有望成為有效的抗結(jié)腸癌備選化合物，但其抗癌機(jī)制還需進(jìn)行更全面的研究。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 石學(xué)匯：研究設(shè)計與實施、撰寫論文；范崇煕：論文修改；楊全龍、王曉瑩、趙東林、李曼華、武雪亮、樊建春：數(shù)據(jù)搜集、整理及統(tǒng)計學(xué)分析；寧守斌：研究指導(dǎo)、設(shè)計、論文修改、審閱和定稿

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2024-01-02）