摘" 要：為避免宿主細(xì)胞殘留DNA可能帶來(lái)的致癌性、感染性與免疫原性等危害，有必要在生物制品生產(chǎn)過程中對(duì)DNA進(jìn)行純化去除與含量測(cè)定，保障生物制品的安全性和有效性。該文從殘留DNA的危害性分析出發(fā)，介紹5種DNA含量測(cè)定方法在生物制品安全控制中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：DNA含量測(cè)定；生物制品；安全控制；宿主細(xì)胞；殘留DNA

中圖分類號(hào)：R392-33" " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " 文章編號(hào)：2095-2945（2023）14-0144-04

Abstract： In order to avoid carcinogenicity， infectivity and immunogenicity caused by residual DNA in host cells， it is necessary to purify and remove DNA and determine its content in the production process of biological products to ensure the safety and effectiveness of biological products. Based on the harmfulness analysis of residual DNA， this paper introduces the application of five determination methods of DNA content in the safety control of biological products.

Keywords： determination of DNA content; biological product; safety control; host cell; residual DNA

生物制品是利用基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程等現(xiàn)代生物技術(shù)，以微生物、細(xì)胞、動(dòng)物源生物組織等作為基礎(chǔ)原料制成的生物活性制劑，一般常用于人類疾病預(yù)防、治療和診斷，常見的生物制品包括疫苗、診斷抗原、類毒素、干擾素和診斷蛋白等。2019年12月至今，新型冠狀病毒感染（COVID-19）已經(jīng)剝奪了全球數(shù)百萬(wàn)人的生命，針對(duì)這種新冠感染研發(fā)的疫苗就屬于一種特殊的生物制品，其可以幫助絕大部分人獲得免疫力，有效降低發(fā)病、重癥和死亡的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而幫助社會(huì)逐步建立起免疫屏障，阻礙其流行傳播。

現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的突飛猛進(jìn)，使得越來(lái)越多的生物制品應(yīng)用到人類疾病預(yù)防、治療和診斷領(lǐng)域中來(lái)。為滿足社會(huì)對(duì)生物制品安全性、有效性與可及性的需求，進(jìn)一步推動(dòng)現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的健康發(fā)展與應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)不斷出臺(tái)相關(guān)法定技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)加強(qiáng)對(duì)生物制品質(zhì)量的控制力度，我國(guó)“四個(gè)最嚴(yán)”和飛行檢查的常態(tài)化也有力推動(dòng)了現(xiàn)代先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用。如今，越來(lái)越多標(biāo)準(zhǔn)化、便捷化、科學(xué)化的針對(duì)生物制品中宿主細(xì)胞殘留DNA含量的測(cè)定方法得到應(yīng)用，以滿足對(duì)生物制品安全控制的要求，減少安全隱患。

1" 宿主細(xì)胞殘留DNA的危害性

隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展和生物信息的全球化，大量的生物制品已采用細(xì)胞生產(chǎn)，我國(guó)疫苗的生產(chǎn)就常使用非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞[1]作為宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞也叫作受體細(xì)胞，是指在轉(zhuǎn)化或感染過程中接受外源基因的細(xì)胞，常用作受體細(xì)胞的有原核受體細(xì)胞（大腸桿菌等）、真核受體細(xì)胞（酵母菌等）和動(dòng)物細(xì)胞等。

生物制品中的殘留DNA片段或更長(zhǎng)的分子主要來(lái)源于作為基礎(chǔ)原料的宿主組織細(xì)胞[2]，因其來(lái)源的廣泛性，隨之而來(lái)的潛在風(fēng)險(xiǎn)也是多樣的，主要風(fēng)險(xiǎn)可概括為致癌性、感染性、免疫原性等[3]。

1.1" 致癌性

宿主細(xì)胞殘留DNA可攜帶顯性致癌基因，像癌基因MYC或RAS等，這些顯性致癌基因可能會(huì)導(dǎo)致生物制品具有致癌風(fēng)險(xiǎn)。宿主細(xì)胞殘留DNA常見的致癌機(jī)制是顯性致癌基因可直接把正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為瘤性細(xì)胞，如含有Ｈ-ras基因和C-myc基因的12.5 ug質(zhì)?？稍诔赡旰托律资笾幸l(fā)腫瘤[4]。宿主細(xì)胞殘留DNA的另外一種致癌機(jī)制可能是宿主細(xì)胞殘留DNA的插入引發(fā)突變導(dǎo)致原癌基因被異常激活、抑癌基因則失去活性，2類基因在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖調(diào)控中的平衡被異常打破，兩者不再相互制約，正負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)失穩(wěn)，最終引發(fā)正常細(xì)胞不斷癌變、侵襲及轉(zhuǎn)移形成癌癥[5]。

1.2" 感染性

宿主細(xì)胞殘留DNA的感染性歸因于其可能攜帶傳染性病毒基因組，如HIV病毒，這些病毒基因組無(wú)論是作為染色體外組分還是整合入人體基因組，或是逆轉(zhuǎn)錄病毒的前病毒[6]，都可能會(huì)擴(kuò)增并催生傳染性病毒粒子，增加宿主細(xì)胞殘留DNA的感染性風(fēng)險(xiǎn)。因此，宿主細(xì)胞殘留DNA的感染性風(fēng)險(xiǎn)可能比致癌性風(fēng)險(xiǎn)更高。Li等[7]通過體外定量測(cè)定逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的傳染性研究得到：微量的逆轉(zhuǎn)錄病毒的前病毒DNA在體外就具有感染性；線狀DNA具有很強(qiáng)的感染力，其感染力約為環(huán)狀DNA的30至100倍。

1.3" 免疫原性

宿主細(xì)胞殘留DNA也可能會(huì)引起免疫原性，這類殘留在生物制品上的雜質(zhì)能夠激活模式識(shí)別受體，加速促炎性細(xì)胞因子的生成，使得抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原的處理和遞呈動(dòng)作更加劇烈，最終可能引起非特異性免疫反應(yīng)：皮膚反應(yīng)、過敏反應(yīng)及血清學(xué)疾病等。人類機(jī)體對(duì)生物制品中宿主細(xì)胞殘留DNA的免疫應(yīng)答不可預(yù)知，由此產(chǎn)生的嚴(yán)重免疫反應(yīng)甚至?xí)＜吧?。單克隆抗體TNG1412的第一階段臨床試驗(yàn)期間出現(xiàn)的臨床前安全性測(cè)試未預(yù)測(cè)到的危及生命的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”表明某些生物制品（如某些特殊生物治療劑）可能會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物產(chǎn)生不可預(yù)料的嚴(yán)重傷害[8]。除此之外，人們還常見到一些高劑量的核酸樣品（DNA疫苗或CpG寡脫氧核苷酸）誘發(fā)產(chǎn)生不良免疫反應(yīng)或產(chǎn)生DNA抗體的臨床研究報(bào)道[9]。

2" DNA含量測(cè)定方法在生物制品安全控制中的應(yīng)用

DNA殘留量是生物制品常規(guī)的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)，2020版《《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）》規(guī)定DNA殘留量不得超過每劑10 ng[10]，進(jìn)行DNA含量的檢測(cè)是十分必要的。DNA含量的測(cè)定方法多種多樣，并不存在普遍適用性的最佳方法，2020版《中國(guó)藥典》收錄的3種DNA含量檢測(cè)方法為我國(guó)生物制品的安全控制提供了應(yīng)用指導(dǎo)。

2.1" 熒光染色法

熒光染色法的原理就是高靈敏度的雙鏈DNA熒光染料（通常為PicoGreen）可與雙鏈DNA特異結(jié)合形成可在波長(zhǎng)480 nm激發(fā)下產(chǎn)生熒光信號(hào)的復(fù)合物，在DNA含量處于一定的范圍內(nèi)且熒光染料過量的情況下，熒光信號(hào)的強(qiáng)度與DNA的濃度成正比，進(jìn)而可以利用熒光酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)520 nm處進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)出來(lái)的熒光信號(hào)強(qiáng)度數(shù)值，可計(jì)算得出樣品中的DNA含量[11-12]。

熒光染色法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性高且成本低的優(yōu)點(diǎn)，但該方法的特異性不強(qiáng)，靈敏度也不高。除此之外，鹽類物質(zhì)（氯化鈉、醋酸鈉等）或蛋白類物質(zhì)（白蛋白等）都會(huì)對(duì)熒光染色法的測(cè)定準(zhǔn)確性造成干擾，該方法不適用于大劑量蛋白樣品（如單克隆抗體）的檢測(cè)，多用于含小劑量蛋白（如疫苗、γ-環(huán)糊精）的生物制品中DNA含量的測(cè)定[13-14]。

2.2" 定量PCR法

定量PCR法是在PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入熒光基團(tuán)，參照已知濃度的核酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過監(jiān)測(cè)分析反應(yīng)過程中的熒光信號(hào)做到對(duì)核酸的定量測(cè)定[15]。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)利用熒光染料或探針保證了PCR擴(kuò)增的特異性，熒光信號(hào)數(shù)值的大小與特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的量成正比，得以真正做到定量檢測(cè)[16]。常用的熒光基團(tuán)有TapMan熒光探針和熒光染料SYBR Green，兩者的主要區(qū)別見表1。

綜合來(lái)看，定量PCR法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，而且所受的人為干擾因素較少，是一種在生物制品安全控制中極具可靠性的檢測(cè)手段。例如，生物制藥行業(yè)常利用定量PCR法測(cè)定門冬氨酸鳥氨酸（一種抗炎保肝藥物）中畢赤酵母菌殘留DNA的含量，以此來(lái)把控畢赤酵母菌潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。

2.3" DNA探針雜交法

DNA探針雜交法的原理是樣品中的外源性DNA經(jīng)變性為單鏈后吸附于固相膜上（一般為硝酸纖維素膜或NC膜），并在嚴(yán)格條件下與特異性標(biāo)記的單鏈DNA復(fù)性雜交形成雙鏈DNA，且在固相膜上呈現(xiàn)為可測(cè)斑點(diǎn)，通過顯示系統(tǒng)檢測(cè)與計(jì)算得到樣品中DNA的殘留量[17]。

DNA探針雜交法的特異性與靈敏度都比較好，常常被用于人用狂犬病疫苗（Vero細(xì)胞）原液樣品中宿主細(xì)胞殘留DNA的檢測(cè)。但該方法的實(shí)驗(yàn)周期偏長(zhǎng)且操作程序煩瑣，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的錯(cuò)誤結(jié)果，故所需檢測(cè)樣本量較大，且只能實(shí)現(xiàn)半定量[18]。同時(shí)，該測(cè)定方法容易受多種因素干擾，對(duì)基因組DNA的提取、純化及探針等均有較高要求。

2.4" 紫外分光光度法

紫外分光光度法是基于朗伯-比爾定律，利用吸光物質(zhì)對(duì)某一波長(zhǎng)光的吸收強(qiáng)度與該物質(zhì)的濃度成正比進(jìn)而對(duì)DNA含量進(jìn)行定量分析[19]。利用DNA分子中存在的共軛雙鍵在波長(zhǎng)260 nm處具有最大紫外吸收的特性，可通過測(cè)定樣品DNA在此波長(zhǎng)處的吸光度值進(jìn)行核酸定量分析[20]。隨著微量分光光度計(jì)的廣泛推廣和應(yīng)用，利用微量樣本對(duì)DNA含量進(jìn)行定量成為了生物分子、生命科學(xué)和臨床檢驗(yàn)等核酸相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)室最常使用的方法[21]。

紫外分光光度法簡(jiǎn)便快捷，在藥物分析、食品安全等領(lǐng)域起著重要作用。對(duì)于高純度的樣品，紫外分光光度法可以準(zhǔn)確地測(cè)定其DNA含量。但是此法測(cè)定核酸濃度易受到其他具有紫外吸收特性物質(zhì)的干擾，如蛋白質(zhì)、多糖，提取試劑中苯酚、丙酮等物質(zhì)，因此樣品基質(zhì)中存在這些物質(zhì)將會(huì)影響紫外分光光度法的準(zhǔn)確度。

2.5" 定磷法

利用電感耦合等離子體技術(shù)（一種元素分析方法）對(duì)質(zhì)荷比不同的元素進(jìn)行分離，可依據(jù)元素的含量與質(zhì)譜峰的面積成正比這一特性對(duì)磷含量進(jìn)行定量分析。測(cè)定核酸含磷量需要采用酸消解、微波消解等方法對(duì)核酸樣品進(jìn)行處理。利用已知濃度的磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而對(duì)磷進(jìn)行定量，依據(jù)磷含量來(lái)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度[22]。

基于磷元素分析的核酸定量方法已被用于多種有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值，其相對(duì)不確定度均低于10%。但是，此法對(duì)試劑純度要求較高 （分析純以上），樣品消解處理是定量的關(guān)鍵，前處理較為復(fù)雜，樣品消解程度將對(duì)定量結(jié)果直接產(chǎn)生影響。

3" 結(jié)束語(yǔ)

近些年，新冠疫苗、新冠口服藥等生物醫(yī)學(xué)制品作為抗擊疫情的急先鋒走進(jìn)大眾視野，讓人們切身體會(huì)到生物制品是與人類生命健康息息相關(guān)的，其可以在多個(gè)領(lǐng)域讓人類社會(huì)享受到生物科技發(fā)展帶來(lái)的紅利。

“是藥三分毒”，生物制品中宿主細(xì)胞殘留DNA存在致癌性、感染性與免疫原性等風(fēng)險(xiǎn)，需要國(guó)家相關(guān)部門與生產(chǎn)廠家共同努力，嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)。合理利用科學(xué)、精確的方法對(duì)宿主細(xì)胞殘留DNA含量進(jìn)行測(cè)定，高標(biāo)準(zhǔn)全流程做好生物制品的研發(fā)生產(chǎn)與安全控制工作，才能滿足社會(huì)對(duì)生物制品安全性、有效性的需求，進(jìn)一步推動(dòng)現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。

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