摘" 要：濾泡輔助性T細胞（Follicular helper CD4 T cells， Tfh）是重要的CD4+T淋巴細胞亞群之一，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關，其參與疾病發(fā)生的機制尚有待深入研究。該研究將分離小鼠脾臟細胞，應用貝克曼Moflo分選系統(tǒng)分選出CD4+T淋巴細胞。使用細胞因子刺激Tfh細胞分化并檢測其分化比例，同時采用流式細胞術檢測和分析肉桂活性成分對濾泡輔助性T細胞分化的影響。結果表明，貝克曼Moflo XDP分選系統(tǒng)可以顯著提高CD4+T淋巴細胞的純度，且肉桂活性成分可以顯著抑制Tfh細胞分化。為新藥在Tfh細胞的開發(fā)提供一定實驗基礎，并且為研發(fā)肉桂作為新的增強免疫療效藥物提供可靠的實驗依據。

關鍵詞：流式細胞分選儀；肉桂活性成分；流式細胞術；CD4+T淋巴細胞；濾泡輔助性T細胞（Tfh）分化

中圖分類號：Q-331" " " 文獻標識碼：A" " " " "文章編號：2095-2945（2023）14-0058-07

Abstract： Follicular helper CD4 T cells （Tfh） are one of the important CD4+T lymphocyte subsets and are closely related to the occurrence and development of various diseases. The mechanism of their involvement in the occurrence of diseases remains to be further studied. In this study， mouse spleen cells will be isolated and CD4+T lymphocytes will be sorted using the Beckman Moflo XDP sorting system. Cytokines were used to stimulate the differentiation of Tfh cells and the differentiation ratio was detected. Flow cytometry was used to detect and analyze the effect of cinnamon bark extract on the differentiation of follicular helper T cells. The results show that the Beckman Moflo sorting system can significantly improve the purity of CD4+T lymphocytes， and the compounds derived from cinnamon can significantly inhibit the differentiation of Tfh cells， which provides a certain experimental basis for the development of new drugs in Tfh cells， and also provides a reliable experimental basis for the development of cinnamon as a new immune-enhancing drug.

Keywords： flow cytometry; cinnamon bark extract; flow cytometry; CD4+T lymphocyte; follicular helper T cell （Tfh） differentiation

MoFlo XDP超速流式細胞分選儀可以根據細胞內蛋白、DNA、RNA 及細胞表面標志物的不同[1]，以每秒10萬個細胞[2]的速度對直線或流動狀態(tài)中的單細胞或微粒進行高效定性定量分析，同時精確識別并分離特定群體，具有高通量、高純度、高活性和無菌等技術優(yōu)勢[3]，為后續(xù)實驗提供條件。

Tfh細胞 （Follicular helper CD4 T cells）自激活的T細胞分化而來，最初被定義為一類存在于人二級淋巴組織B細胞區(qū)生發(fā)中心（GC）中的CD4+T細胞亞群[4-5]。Tfh細胞以CXCR5、PD-1、SH2D1A、IL-21和ICOS等分子的表達以及Blimp-1（prdm1）的缺失為顯著特征，并且特異性轉錄BCL-6[6]。Tfh細胞通過幫助B細胞在抗原特異性抗體反應的產生中發(fā)揮重要作用。Tfh細胞通過高表達趨化因子受體CXCR5而得以進入表達其配體CXCL13的淋巴濾泡，參與生發(fā)反應中心反應。Tfh細胞對生發(fā)中心的形成至關重要。生發(fā)中心一旦形成，就需要Tfh細胞來維持生發(fā)中心，并調節(jié)生發(fā)中心B細胞向漿細胞和記憶B細胞的分化[7]。在生發(fā)中心，高親和力的B細胞被選擇并分化為記憶B細胞和漿細胞[8]。Tfh細胞功能行使中的關鍵因素是其分泌的IL-21。Tfh細胞通過分泌白介素21（IL-21）和TNF家族受體超家族分子（TNF family receptor superfamily molecule） CD40提供信號，促進GC B細胞生長發(fā)育并使其分化為記憶細胞和漿細胞，成為生發(fā)反應的主要介導成分[9]。Tfh細胞是重要的CD4+T淋巴細胞亞群之一，在免疫反應中扮演中間過程的角色。Tfh細胞的正常表達有助于維持機體正常的免疫應答和內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，而其表達和功能的異常則會導致機體免疫功能紊亂，引發(fā)多種自身免疫性疾病[10]。對Tfh細胞在自身免疫性疾病中功能及調節(jié)機制進行深入研究，將有助于更深刻地認識這類疾病，為開發(fā)Tfh細胞疾病治療提供新策略。

肉桂為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassisPresl） 的干燥樹皮，常分布于我國廣東、廣西、福建、浙江、云南和四川等地， 在印度、老撾、越南、斯里蘭卡及印度尼西亞等國家也有栽培，其小枝（桂枝）、果實（桂子）也常作藥食兩用之物[11]。其性大熱，味辛、甘，具有補火助陽、引火歸元、散寒止痛、溫通經脈等功效。2015年版《中國藥典》一部中收載的成方制劑和單味制劑中有68種含有肉桂，如十全大補丸、人參再造丸、右歸丸、女金丸和桂附理中丸等[12]。而現(xiàn)代藥理研究則表明桂枝具有緩和腸胃刺激、強心、改善微循環(huán)、抗炎及抗血小板凝集等多種生理活性[13]，然而，其對Tfh細胞調節(jié)功能的研究尚未闡明。

本研究將分離小鼠脾臟細胞，應用貝克曼Moflo分選系統(tǒng)分選出CD4+T淋巴細胞。使用細胞因子刺激分化96 h后，用貝克曼Cytoflex流式細胞儀檢測Tfh細胞的分化，同時采用流式細胞術檢測和分析肉桂活性成分對Tfh細胞分化的影響，為新藥在Tfh細胞的開發(fā)提供一定實驗基礎，并且為研發(fā)肉桂作為新的增強免疫療效藥物提供可靠的實驗依據。

1" 材料與方法

1.1" 材料

1.1.1" 主要儀器

貝克曼Moflo流式分選系統(tǒng) （美國Becman公司，MoFlo XDP）；貝克曼CytoFlex流式分析系統(tǒng)（美國Becman公司，CytoFlex S）；血細胞計數(shù)器（上海求精公司，XB-K-25）；離心機（美國Becman公司，A34704-AC）。

1.1.2" 主要試劑

PBS緩沖液（上海沃凱公司）；RPMI-1640基礎培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗（美國Gibco公司）；0.05%次氯酸鈉（生工生物（上海））；Flowcheck微球、Coulter Clenz（美國Becman公司）；紅細胞裂解液（美國Sigma公司）。

1.1.3" 流式細胞熒光標記抗體及細胞因子

CD4-FITC抗體（美國Invitrogen公司）；APC rat anti-mouse CXCR5、PE hamster anti-mouse CD279 （美國BD公司）；anti-CD3、anti-CD28、anti-IFN-γ、anti-IL-4（美國eBioscience公司）；IL-21、TGF-β（美國Peprotech公司）。

1.2" 方法

1.2.1" Moflo XDP開機前準備

配置6L PBS，121 °C濕熱滅菌。待液體冷卻至室溫后對鞘液桶及PBS進行30 min紫外滅菌。于生物安全柜內將PBS倒入鞘液桶。將鞘液桶正確安裝于Moflo流式分選系統(tǒng)，松開壓力閥，調節(jié)室溫為18～25 ℃，靜置過夜。

1.2.2" 小鼠脾臟細胞提取

犧牲小鼠，無菌取出脾臟，用玻片研磨后將脾臟細胞經300目細胞濾網過濾至15 mL離心管中，1 200 rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；彈勻細胞后加入600 μL紅細胞裂解液，40～50 s后加入PBS終止裂解；1 200 rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；用PBS混懸細胞后再次過濾，1 200 rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；加入1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗）混懸細胞并計數(shù)。

1.2.3" 脾臟細胞染色

取流式管，將細胞以1×107 cells每管分裝，1 200" rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；加入PBS混懸細胞，1 200 rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；加入2 mL staining buffer（含2%胎牛血清的PBS）混懸細胞，1 200 rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；加入CD4-FITC熒光素偶聯(lián)抗體避光冰浴染色20 min。染色終止后加入2 mL staining buffer，1 200 rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；最后加入1 mL PBS混懸細胞準備進行流式分選。

1.2.4" Moflo XDP開機

擰緊鞘液桶的壓力閥，順時針安裝100 μm噴嘴，打開服務器總開關，開啟空壓機，加壓并檢查數(shù)值，正壓為30 PSI，負壓絕對值不小于15 inHg。開啟激光電源預熱30 min，將工作功率設置為20 mW。開啟電腦、服務器電源及屏幕，最后啟動Summit軟件。

1.2.5" 液流調節(jié)

打開液流，過濾器上下各排5次氣泡，流動池排5 min氣泡。首先調節(jié)噴嘴傾角，使液流對準廢液收集孔。接著在pine hole相機界面對噴嘴高度進行精確調節(jié)。當噴嘴降至最低點時，千分尺刻度應不低于5；當噴嘴升至最高點時，要求千分尺刻度不超過15。最后對噴嘴傾角進行精確調節(jié)。當噴嘴位于最低點時，調節(jié)pine hole至液流正中間；若噴嘴位于最高點時液流與pine hole出現(xiàn)明顯偏差，則應將液流調至相反方向，使液流盡可能靠近pine hole。對液流的調整要求在10 min內完成，以盡量避免對噴嘴固定器螺紋及流動室組件的磨損[14]。

1.2.6" 光路校準

在1 mL無菌PBS緩沖液中加入6滴熒光微球，將微球上樣。調節(jié)樣品壓力差為0.3 PSI，調整每秒細胞數(shù)穩(wěn)定為100個（events per second，EPS）。使用激光檢測時，首先輪流調節(jié)液流組微調千分尺的左右及聚焦按鈕，待出現(xiàn)明亮且聚集的光斑后調節(jié)激光組微調千分尺的上下及前后按鈕[15]，最終應使激光通道的變異系數(shù)（coefficient of variance，CV）小于3。

1.2.7" 分選調試

使用75%乙醇擦拭收集艙和進樣艙，用0.1%次氯酸鈉清洗30 min，實驗室紫外滅菌20 min。用無菌蒸餾水清洗管路，小心棄細胞上清，加入1 mL staining buffer混懸細胞，經300目細胞濾網過濾至新流式管中，無菌加入1 mL RPMI-1640完全培養(yǎng)基，放入收集艙。打開液流振蕩開關，選擇噴嘴型號為100 μm，計算機自動調整振蕩頻率（Frequency）。打開經典偏轉板電源并升壓 （壓力最大不超過2 700 V）[16]，找到液流偏轉最差的一段角度，手動調節(jié)Charge Phase至該區(qū)間中間值加減180°，Defanning約為10～15。計算機自動檢測液滴斷點并計算液滴延遲時間（Drop Delay），點擊Maintain按鈕維持Drop Delay不變[17]。通過調節(jié)Drop Position可同時對4種細胞亞群進行分選。上樣并選擇合適的電壓，調節(jié)FCS和SSC，設門圈出黏連細胞，選擇FITC陽性細胞群，點擊F4進行分選并觀察細胞的數(shù)量及純度。最后對分選獲得的CD4+T淋巴細胞使用貝克曼CytoFlex流式分析系統(tǒng)（CytoFlex S）進行純度回測。

1.2.8" Moflo XDP關機

分選結束后用0.05%次氯酸鈉及無菌蒸餾水清洗進樣艙。依次關閉液流、閥門、激光、Summit軟件、服務器和空壓機。使用75%乙醇擦拭進樣艙、收集艙及臺面。逆時針方向卸下100 μm噴嘴，放入裝有純水的15 mL離心管中。降低鞘液桶壓強與大氣壓持平，回收廢液。

1.2.9" 誘導分化Tfh細胞

將CD4+T淋巴細胞以2×106 cells每孔接種于24孔板中，每孔加入 anti-CD3（5 μg/mL）、anti-CD28（2 μg/mL）、anti-IFN-γ（10 μg/mL）、anti-IL-4（10 μg/mL）、IL-21（5 ng/mL）及TGF-β（40 ng/mL）；37 °C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h。

1.2.10" Tfh細胞染色

收集細胞，1 200 rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；加入PBS混懸細胞，1 200 rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；加入staining buffer混懸細胞，1 200 rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；加入CD4-FITC熒光素偶聯(lián)抗體、APC rat anti-mouse CXCR5抗體、PE hamster anti-mouse CD279 抗體后避光冰浴染色20 min。加入PBS終止染色，1 200 rpm，5 min，4 °C離心，棄上清；最終加入1 mL PBS混懸細胞后經300目細胞濾網過濾，用貝克曼CytoFlex流式分析系統(tǒng)（CytoFlex S）分析。

1.2.11" Tfh細胞檢測

檢查鞘液及廢液，啟動流式細胞儀及電腦，打開CytExpert軟件并運行開機流程，根據提示放入蒸餾水清洗并初始化。使用陰性對照管調節(jié)合適的電壓，調整FCS和SSC，設門圈出黏連細胞，分析FITC陽性細胞群中PE和APC的表達量。雙陽即表示Tfh細胞的含量。分析結束后根據提示用Coulter Clenz及蒸餾水各清洗5 min。依次關閉CytExpert軟件、流式細胞儀及電腦，回收廢液。

2" 結果

2.1" 微球校準光路標準

如圖1所示，使用熒光微球對488 nm激光光路進行光路校正，最終應保持CV小于3。

2.2" FSC及SSC的選擇

FSC即前向角散射，細胞體積越大，其FSC值就越大。SSC即側向角散射，代表細胞的顆粒度。細胞越不規(guī)則，細胞表面的突起越多，細胞內能夠引起激光散射的細胞器或顆粒性物質越多，其SSC值就越大。因此可以利用細胞的大小和顆粒度對目標細胞進行分群和分類[18]。如圖2所示。

2.3" CD4+T淋巴細胞純度檢測

如圖3所示，應用貝克曼Moflo XDP分選系統(tǒng)分選前CD4+T淋巴細胞純度為26.20%；分選后CD4+T淋巴細胞純度為99.45%；對比分選前后細胞純度，應用貝克曼Moflo XDP 分選系統(tǒng)顯著提高CD4+T淋巴細胞的純度。

2.4" 誘導分化前后Tfh細胞比例檢測

流式細胞術檢測誘導分化前后Tfh細胞含量，結果如圖4所示，誘導分化前Tfh細胞含量為3.04%，而加入anti-CD3、anti-CD28、anti-IFN-γ、anti-IL-4、IL-21及TGF-β細胞因子誘導分化后Tfh細胞含量達到30.13%，提示此方法可以成功誘導Tfh細胞。

2.5" 肉桂活性成分可以降低Tfh分化比例

目前已有研究證明肉桂具有良好的抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗腫瘤和降糖等多種藥理活性，而本課題組的前期研究也表明肉桂來源的原花青素三聚體（Cinnamtannin D1，CTD-1）可以通過調節(jié)T細胞平衡改善關節(jié)炎[19]。然而，關于此類成分對Tfh細胞調節(jié)功能的研究尚未充足。因此在成功誘導分化Tfh細胞的基礎上，選用水溶性肉桂提取物包括A型低聚原花青素（A-type oligomericproanthocyanidins，OPC-A）、B型低聚原花青素（B-type oligomericproanthocyanidin，OPC-B）、松柏醛（Coniferyl Aldehyde，CA）、原花青素C1（procyanidin C1，PC-1）、桂皮鞣質B1（Cinnamtannin B1，CB）及原花青素三聚體（Cinnamtannin D1，CTD-1）來探索其對Tfh細胞分化的作用。如圖5所示，對比正常分化的Tfh細胞 （18.39%），這些活性成分處理后Tfh細胞分化比例均降低，分別為OPC-A（13.46%），OPC-B（2.72%），CA（9.48%），PC-1（6.31%），CB（11.05%），CTD-1（8.02%），其中OPC-B對Tfh細胞分化的抑制作用最顯著。進一步證明基于貝克曼Moflo分選系統(tǒng)分選CD4+T淋巴細胞，進而誘導分化Tfh的實驗方法具有一定的可行性，為中藥對免疫細胞的篩選提供了參考。

3" 結論

本研究通過應用Moflo分選系統(tǒng)建立小鼠脾臟來源的Tfh細胞分化的方法。筆者首先用紅細胞裂解液裂解小鼠脾臟細胞中的紅細胞。紅細胞裂解液[20]是一種較溫和的去除紅細胞方法，可以有效避免損傷淋巴細胞大小、形態(tài)及細胞比例。然而裂解紅細胞后的小鼠脾臟細胞仍含有大量淋巴細胞和巨噬細胞，分離得到的CD4+T淋巴細胞僅占26.2%。接著使用細胞因子刺激CD4+T淋巴細胞分化，用貝克曼Cytoflex流式細胞儀檢測Tfh細胞的分化，同時以肉桂活性成分為例采用流式細胞術探究其對Tfh細胞分化的影響。

結果表明，應用貝克曼Moflo XDP分選系統(tǒng)可以顯著提高CD4+T淋巴細胞的純度。對比正常分化的Tfh細胞，經肉桂活性成分對Tfh細胞分化比例均降低，說明肉桂可能通過調節(jié)Tfh功能改善炎癥。綜上所述，研究證明基于貝克曼Moflo分選系統(tǒng)提升CD4+T淋巴細胞分選效率，進而誘導分化Tfh的實驗方法具有一定的可行性。此外，通過水溶性肉桂提取物對Tfh細胞分化影響的實驗也為天然藥物在Tfh細胞的開發(fā)提供一定實驗基礎，并且為研發(fā)肉桂作為新的增強免疫療效藥物提供可靠的實驗依據。

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