【摘要】 背景 近年來，樞經(jīng)推拿在治療神經(jīng)病理性疼痛方面展現(xiàn)出較好的療效，但其具體作用機制尚未充分闡明。目的 以L5脊神經(jīng)結(jié)扎而成的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型為觀察對象，根據(jù)各項研究指標觀察樞經(jīng)推拿對大鼠的鎮(zhèn)痛作用，探討其是否通過影響長鏈非編碼RNA-生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5（LncRNA-GAS5）進而調(diào)控脊髓背角神經(jīng)元凋亡達到鎮(zhèn)痛效果。方法 實驗于2021年1—6月在廣西中醫(yī)藥大學、廣西大學動物醫(yī)學實驗中心完成。選取健康雌性SD大鼠120只，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、假手術(shù)組、假推拿組和樞經(jīng)推拿組，每組24只；模型組、假手術(shù)組、假推拿組和樞經(jīng)推拿組通過結(jié)扎L5脊神經(jīng)來制備神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型。造模24 h后，假手術(shù)組暴露L5脊神經(jīng)幾分鐘，不予結(jié)扎，逐層縫合關(guān)閉傷口；假推拿組輕撫大鼠雙后肢18 min；樞經(jīng)推拿組用自備按摩儀循序刺激兩側(cè)足少陽膽經(jīng)上的環(huán)跳、陽陵泉、懸鐘三穴，刺激力量為5 N，頻率2 Hz，每穴、每法干預1 min，雙側(cè)6個穴位，3種手法，共計18 min；正常組、模型組正常喂養(yǎng)及觀察，不施加任何干預。于造模前及造模后1、3、7、14 d分別進行行為學檢測（機械縮足反射閾值、熱縮足反射潛伏期）；分別于干預7、14 d，隨機抽取12只進行取材檢測脊髓組織中介導TLR8/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達情況〔脊髓組織B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、Caspase-3、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、Toll樣受體8（TLR8）蛋白表達水平，LncRNA-GAS5、miR-21基因表達水平）〕。結(jié)果 （1）行為學方面，模型組、假推拿組、樞經(jīng)推拿組大鼠造模后1、3、7、14 d機械縮足反射閾值均低于正常組（Plt;0.05）；假手術(shù)組、假推拿組、樞經(jīng)推拿組的機械縮足反射閾值在造模后14 d均高于模型組（Plt;0.05）；假手術(shù)組、樞經(jīng)推拿組造模后7、14 d機械縮足反射閾值高于假推拿組（Plt;0.05）。假手術(shù)組、樞經(jīng)推拿組在造模后1、3、7 d熱縮足反射潛伏期均低于正常組（Plt;0.05）；假手術(shù)組、假推拿組、樞經(jīng)推拿組在造模后7、14 d熱縮足反射潛伏期均長于模型組（Plt;0.05）；假手術(shù)組、樞經(jīng)推拿組在造模后14 d熱縮足反射潛伏期長于假推拿組（Plt;0.05）。（2）信號通路相關(guān)蛋白以及基因表達水平方面，造模后7 d，正常組Bcl-2蛋白表達水平低于其余各組（Plt;0.05）；樞經(jīng)推拿組的Bcl-2蛋白表達水平高于模型組，Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表達水平均低于模型組（Plt;0.05）；樞經(jīng)推拿組的Bcl-2、Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表達水平低于假手術(shù)組、假推拿組（Plt;0.05）；造模后14 d，樞經(jīng)推拿組的Bcl-2蛋白表達水平仍高于模型組，Caspase-3、TLR8蛋白表達水平仍低于模型組，而ERK蛋白表達水平高于模型組（Plt;0.05）。造模后7d，假推拿組和樞經(jīng)推拿組LncRNA-GAS5基因表達水平均高于模型組，miR-21基因表達水平均低于模型組（Plt;0.05）；樞經(jīng)推拿組LncRNA-GAS5基因表達水平高于假推拿組，miR-21基因表達水平低于假推拿組（Plt;0.05）；造模后14 d，模型組LncRNA-GAS5基因表達水平低于正常組，樞經(jīng)推拿組與假推拿組lncRNA-GAS5基因表達水平高于模型組（Plt;0.05）；樞經(jīng)推拿組與假推拿組miR-21基因表達水平高于模型組（Plt;0.05）。結(jié)論 樞經(jīng)推拿手法對神經(jīng)病理性疼痛大鼠起到一定的鎮(zhèn)痛效果，初步推測鎮(zhèn)痛作用機制可能是通過升高LncRNA-GAS5的表達來吸附miR-21介導TLR8/ERK通路相關(guān)蛋白抑制神經(jīng)元凋亡，雖然其具體機制未明確證實，但LncRNA-GAS5有望成為以后治療神經(jīng)病理性疼痛的新靶點。

【關(guān)鍵詞】 疼痛；神經(jīng)病理性疼痛；推拿療法；樞經(jīng)推拿；長鏈非編碼RNA-生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5；鎮(zhèn)痛；大鼠

【中圖分類號】 R 441.1 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0145

【引用本文】 韋宗波，龍炳材，王雄將，等.樞經(jīng)推拿對神經(jīng)病理性疼痛大鼠TLR8/ERK信號通路及LncRNA-GAS5的影響及作用機制研究［J］. 中國全科醫(yī)學，2023，26（36）：4565-4574，4580. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0145.［www.chinagp.net］

WEI Z B，LONG B C，WANG X J，et al. Effect and mechanism of pivot meridian massage on TLR8/ERK signaling pathway and LncRNA-GAS5 in rats with neuropathic pain［J］. Chinese General Practice，2023，26（36）：4565-4574，4580.

Effect and Mechanism of Pivot Meridian Massage on TLR8/ERK Signaling Pathway and LncRNA-GAS5 in Rats with Neuropathic Pain WEI Zongbo1，LONG Bingcai1，WANG Xiongjiang1*，LIANG Yingye2，TANG Hongliang3，XIA Tian1，LU Dongming2

1. Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530041，China

2. The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530023，China

3. Fangchenggang Hospital Affiliated to Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)angchenggang 538000，China

*Corresponding author：WANG Xiongjiang，Attending physician；E-mail：958207546@qq.com

【Abstract】 Background Pivotal meridian massage for neuropathic pain obtained favorable results in recent years，however，its specific mechanism of action has not been fully elucidated. Objective To observe the analgesic effect of pivotal meridian massage on rats according to the research indexes taking rat model of neuropathic pain induced by L5 spinal nerve ligation as the object of observation，to further investigate whether the analgesic effect is achieved by affecting LncRNA-GAS5 and then regulating the apoptosis of neurons in the dorsal horn of the spinal cord. Methods The experiment was conducted from January to June 2021 at the Experimental Center for Animal Medicine of Guangxi University of Chinese Medicine and Guangxi University. A total of 120 healthy female SD rats were randomly divided into the normal group，model group，sham-operated group，sham-manipulation group，and meridian manipulation group，with 24 rats in each group. Rat model of neuropathic pain was prepared by ligating the L5 spinal nerve in the model，sham-operated，sham-manipulation and meridian manipulation groups. After modeling for 24 hours，the L5 spinal nerve was exposed for a few minutes without ligation，and the wound was closed layer by layer in the sham-operated group；hind limbs of the rats in the sham-manipulation group were gently stroked for 18 minutes；a self-made massager was used to sequentially stimulate the three acupoints on the bilateral Foot Shaoyang Gallbladder Meridian of Huan Tiao，Yang Ling Quan，and Xuan Zhong，with a stimulation force of 5 N，frequency of 2 Hz，intervention of 1 minute for each acupoint and technique，totaling 18 minutes in the meridian manipulation group. The normal group and model group were fed and observed normally without any intervention. Behavioral tests（mechanical withdrawal threshold and thermal withdrawal latency） were performed before modeling and on days 1，3，7，and 14 after modeling. On days 7 and 14 of the intervention，12 rats were randomly selected for tissue sampling to detect the expression of TLR8/ERK signaling pathway-related proteins（Bcl-2，Caspase-3，ERK，TLR8 protein levels） and the expression levels of LncRNA-GAS5 and miR-21 genes in the spinal cord tissue. Results （1）In terms of behavioral observations，the mechanical withdrawal threshold of the model group，sham-manipulation group，and meridian manipulation group was lower than the normal group on days 1，3，7，and 14 after modeling（Plt;0.05）. The mechanical withdrawal threshold of the sham-operated group，sham-manipulation group and meridian manipulation group was higher than the model group on day 14 after modeling（Plt;0.05）. The mechanical withdrawal threshold of the sham-operated group，meridian manipulation group was higher than the sham-manipulation group on days 7 and 14 after modeling（Plt;0.05）. The thermal withdrawal latency in the sham-manipulation group and meridian manipulation group was shorter than the normal group on days 1，3，and 7 after modeling（Plt;0.05）. The thermal withdrawal latency in the sham-operated group，sham-manipulation group and meridian manipulation group was longer than the model group on days 7 and 14 after modeling（Plt;0.05）. The sham-operated group，meridian manipulation group had longer thermal withdrawal latency than the sham-manipulation group on day 14 after modeling（Plt;0.05）. （2）In terms of protein and gene expression levels related to the signaling pathway，on day 7 after modeling，the Bcl-2 protein expression level in the normal group was lower than the other groups（Plt;0.05）. The Bcl-2 protein expression level in the meridian manipulation group was higher than the model group，while the Caspase-3，ERK，and TLR8 protein expression levels were lower than the model group（Plt;0.05）. The Bcl-2，Caspase-3，ERK，and TLR8 protein expression levels in the meridian manipulation group were lower than the sham-operated group，sham-manipulation group（Plt;0.05）. On day 14 after modeling，the Bcl-2 protein expression level in the meridian manipulation group remained higher than the model group，while the Caspase-3 and TLR8 protein expression levels remained lower than the model group，and the ERK protein expression level was higher than the model group（Plt;0.05）. After 7 days of modeling，the expression level of LncRNA-GAS5 gene in the sham-manipulation group and meridian manipulation group was higher than the model group，while the expression level of miR-21 gene was lower than the model group（Plt;0.05）. The expression level of LncRNA-GAS5 gene in the meridian manipulation group was higher than the sham-manipulation group，while the expression level of miR-21 gene was lower than the sham-manipulation group（Plt;0.05）. After 14 days of modeling，the expression level of LncRNA-GAS5 gene in the model group was lower than the normal group，while the expression level of LncRNA-GAS5 gene in the meridian manipulation group and sham-manipulation group was higher than the model group（Plt;0.05）. The expression level of miR-21 gene in the meridian manipulation group and sham-manipulation group was higher than the model group（Plt;0.05）. Conclusion The meridian manipulation technique has a certain analgesic effect on rats with neuropathic pain. It is initially hypothesized that the analgesic mechanism may be achieved by upregulating the expression level of LncRNA-GAS5 to inhibit neuronal apoptosis by adsorbing miR-21 to mediate TLR8/ERK pathway-related proteins. Although the specific mechanism has not been conclusively confirmed，LncRNA-GAS5 is expected to be a new target for future treatment of neuropathic pain in the future.

【Key words】 Pain；Neuropathic pain；Tuina therapy；Pivot meridian massage；LncRNA-GAS5；Analgesia；Rats

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NPP）是指由中樞支配的軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)受損而導致的疼痛，屬于難治性慢性疼痛綜合征，通常表現(xiàn)為自發(fā)痛、觸誘發(fā)痛、痛覺過敏以及感覺異常等臨床癥狀，其持續(xù)時間一般超過3個月，影響患者睡眠質(zhì)量，進一步引起患者焦慮、抑郁等情緒障礙，嚴重危害了患者的生活質(zhì)量［1-2］。NPP仍是當前醫(yī)學界亟待攻克的難題之一，其發(fā)病機制尚無完善理論解釋，也無特效治療方案，因此尋找一種安全高效的治療方法迫在眉睫。古往至今，祖國醫(yī)學對各種疼痛的病因、病機已形成較為系統(tǒng)的認識，在長期臨床工作中中醫(yī)藥鎮(zhèn)痛治療NPP取得了不錯的療效，特別是近年來針灸、推拿等中醫(yī)外治的鎮(zhèn)痛效果也取得了一定進展［3-4］，相比于藥物、外科治療等鎮(zhèn)痛方法，其經(jīng)濟安全、效果優(yōu)良、不良反應少等優(yōu)勢受到廣大醫(yī)生和患者的青睞，成為臨床關(guān)注的熱點。然而，中醫(yī)藥在治療NPP方面缺乏明確的鎮(zhèn)痛機制且臨床研究質(zhì)量良莠不齊，使其無法在疼痛治療中獲得更高證據(jù)級別推薦，這有礙于中醫(yī)藥在臨床上的進一步應用和推廣。

樞經(jīng)推拿是基于樞經(jīng)學說，強調(diào)以“樞”為主、“轉(zhuǎn)”為精髓來總樞全身之氣機，調(diào)轉(zhuǎn)氣血精液之運行為作用的中醫(yī)推拿療法。樞經(jīng)是氣機交接轉(zhuǎn)樞之地，體現(xiàn)在轉(zhuǎn)樞表里陰陽之氣和通調(diào)臟腑之氣，起到行氣活血、疏通經(jīng)絡的功效［5］，因此體表少陽、少陰兩樞的經(jīng)絡穴位在推拿手法的作用加持下，能更有效地緩解、消除疼痛，且NPP部位與受損區(qū)域有直接聯(lián)系，故可嘗試通過樞經(jīng)推拿作用于受損區(qū)域來緩解疼痛。神經(jīng)損傷會改變miRNA的表達，而miR-21作為其中的一員，已有研究證實其在神經(jīng)保護和修復過程中發(fā)揮了重要作用［6-7］。作為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族重要成員之一的細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK），經(jīng)活化作用后進入細胞核，通過激活核糖體S6激酶使環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白（CREB）磷酸化，從而調(diào)節(jié)其下游相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄，參與突觸可塑性，抑制神經(jīng)元凋亡，介導神經(jīng)元修復與再生等活動［8］。Toll樣受體8（TLR8）是軸突生長的負調(diào)控因子及神經(jīng)元凋亡的誘導因子［9］，最新研究表明，TLR8在NPP大鼠的脊髓背角中表達顯著增加，miR-21是其內(nèi)源性配體，TLR8通過miR-21的活化導致ERK磷酸化介導炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生以及神經(jīng)元的過度興奮來參與NPP［10］，因此通過抑制miR-21介導的TLR8/ERK通路可能影響脊髓背角神經(jīng)元的凋亡從而阻隔疼痛傳遞。長鏈非編碼RNA-生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5（LncRNA-GAS5）已證明與神經(jīng)元的凋亡發(fā)生密切相關(guān)［11］，在前期的預實驗中發(fā)現(xiàn)，LncRNA-GAS5在NPP大鼠脊髓背角中低表達，樞經(jīng)推拿干預后表達升高，因此本課題組推斷樞經(jīng)推拿可能通過影響LncRNA-GAS5表達進而參與調(diào)控NPP的發(fā)生、發(fā)展和維持?；诖耍狙芯繕?gòu)建L5脊神經(jīng)結(jié)扎（spinal nerve ligation，SNL）疼痛模型大鼠，觀察樞經(jīng)推拿對SNL大鼠脊髓背角組織中LncRNA-GAS5、miR-21基因、ERK、TLR8蛋白及其他涉及此通路的因子表達水平的變化影響，旨在深入探討基于LncRNA-GAS5下樞經(jīng)推拿對SNL大鼠的鎮(zhèn)痛作用及機制，以期為臨床樞經(jīng)推拿治療NPP提供有力的科學研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 時間及地點 實驗于2021年1—6月在廣西中醫(yī)藥大學、廣西大學動物醫(yī)學實驗中心完成。

1.2 材料

1.2.1 實驗動物 選取120只健康、雌性SD大鼠，體質(zhì)量140～160 g〔購于湖南斯萊克公司，使用許可證：SYXK（桂）2019-0004〕，在廣西大學動物醫(yī)學實驗中心分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：室溫20～25 ℃，濕度35%～45%，12 h自然光照，自由飲水進食。實驗研究通過廣西中醫(yī)藥大學動物實驗倫理審查（No.DW20220621-129）。

1.2.2 主要實驗試劑 注射用青霉素鈉（齊齊哈爾市雙富獸藥有限公司，中國），水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，中國），焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水（上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司，中國），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，中國），兔抗鼠TLR8（Abcam，英國），兔抗鼠ERK（Abcam，英國）。

1.2.3 主要實驗儀器 大鼠腦立體定位儀（Narishiga，日本），光學顯微鏡（奧林巴斯CX23，中國青島），共聚焦顯微鏡（奧林巴斯BX43，中國青島），酶標儀（OLYMPUS，日本），低溫高速離心機（EPPENDORF，德國），Von Frey纖維絲測痛儀（Stoelng，美國），熱板痛覺測試儀（IITC，美國），按摩推拿手法模擬儀（中華人民共和國發(fā)明專利號：ZL200710187403.1）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組 大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、假手術(shù)組、假推拿組和樞經(jīng)推拿組，每組24只。模型組、假手術(shù)組、假推拿組和樞經(jīng)推拿組進行造模。

1.3.2 實驗動物模型制備 參照KIM等［12］的方法制備SNL大鼠模型，具體如下：（1）大鼠腹腔注射7%水合氯醛（按體質(zhì)量4 mL/kg）深度麻醉。（2）清潔備皮，75%乙醇消毒后鋪巾，將定位好的兩側(cè)髂后上棘最高點水平連線，與后正中線交點處沿左側(cè)棘旁肌縱軸方向做一長約1.8 cm的切口。（3）鈍性分離皮膚、筋膜淺組織及肌肉深組織，暴露L5椎體橫突，隨后用咬骨鉗咬斷L5橫突和L4、L6錐體之間的骨性連接，充分暴露L5脊神經(jīng)。（4）將暴露的L5脊神經(jīng)用無創(chuàng)尼龍線雙層緊密結(jié)扎，整個操作過程禁止過度牽拉脊神經(jīng)。（5）最后予0.9%氯化鈉溶液沖洗、徹底止血后逐層縫閉傷口。

造模成功標準：休息狀態(tài)下可見大鼠出現(xiàn)經(jīng)常性舔舐、術(shù)側(cè)下肢后足懸空，活動狀態(tài)下可見大鼠出現(xiàn)保護性懸起術(shù)側(cè)下肢行為，無患肢癱瘓、拖步等運動障礙即可判定造模成功。

1.3.3 分組及治療方法 造模成功后，正常組、模型組正常喂養(yǎng)、觀察，不施加任何干預；假手術(shù)組切開組織暴露L5脊神經(jīng)幾分鐘，不予結(jié)扎，并未造成神經(jīng)實質(zhì)性損傷；假推拿組在布袋的約束下輕撫大鼠雙后肢

18 min；樞經(jīng)推拿組用自備按摩儀模擬點法、揉法、撥法，分別循序刺激兩側(cè)足少陽膽經(jīng)上的環(huán)跳、陽陵泉、懸鐘三穴，刺激力量為5 N，頻率為2 Hz，每穴每法干預1 min，雙側(cè)6個穴位，3種手法，共計18 min。

1.4 主要觀察指標 于造模前及造模后1、3、7、14 d

分別進行行為學檢測（機械縮足閾值、熱縮足潛伏期），分別于干預7、14 d，隨機抽取12只進行取材檢測脊髓組織中介導TLR8/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達情況〔脊髓組織脊髓組織B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表達水平，LncRNA-GAS5、miR-21基因表達水平〕。

1.4.1 機械縮足閾值測定 將大鼠放入底部鐵絲網(wǎng)孔徑為0.5 cm×0.5 cm的透明鐵籠中，待大鼠適應周圍環(huán)境后，分別用代表不同刺激強度的von-Frey纖維絲從底部鐵絲網(wǎng)穿過，直接刺激大鼠左足底中心部位，刺激力度由小到大，觀察大鼠出現(xiàn)縮足或抖足等陽性行為后停止刺激，并記錄數(shù)據(jù)。連續(xù)測量3次，取平均值作為機械縮足閾值。

1.4.2 熱縮足潛伏期測定 室內(nèi)恒溫25 ℃，熱板痛覺測試儀置于有機透明玻璃動物籠內(nèi)，將測試儀溫度調(diào)至55 ℃后放入大鼠，并封閉蓋子按下計時器。當觀察到大鼠開始出現(xiàn)頻繁抬足、舔爪等陽性行為后停止計時并記錄時間。連續(xù)測量3次，每次間隔20 min，取平均值作為大鼠熱痛縮足潛伏期。

1.4.3 取材 對大鼠禁食12 h后取脊髓背角組織并稱重記錄，取材使用的手術(shù)器械前一晚用0.1% DEPC處理水浸泡，以防止酶污染；按體質(zhì)量4 mL/kg標準腹腔注射10%水合氯醛麻醉，回抽無血液回流方可注射，大鼠四肢無伸縮等動作即為麻醉成功；斷頭處死麻醉的大鼠后，迅速分離大鼠脊柱旁肌肉及組織，取出腰膨大段（L2～5）脊髓背角組織；隨后使用液氮冷凍組織，置于-80 ℃冰箱凍存，標本使用期限應在3個月內(nèi)。

1.4.4 大鼠脊髓組織Bcl-2、Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表達水平檢測 取1.4.3中部分脊髓組織，采用Western Blot檢測組織內(nèi)蛋白水平：測定目的蛋白含量，制備蛋白上樣樣本，采用10%分離膠，根據(jù)目的蛋白、內(nèi)參的分子量進行切膠后轉(zhuǎn)膜，再行免疫反應化學發(fā)光處理進行凝膠成像分析，最后使用Bio-Rad自帶軟件對各條帶密度進行測定。

1.4.5 大鼠脊髓組織LncRNA-GAS5、miR-21基因表達水平檢測 取1.4.3中部分脊髓組織，采用Trizol試劑提取相應組織和細胞中總RNA，采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT Master Mix（DRR036A）說明書，將RNA樣本逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再根據(jù)2×Taq PCR MasterMix 試劑說明書進行實時熒光PCR擴增反應。

1.4.6 免疫熒光 所有切片需經(jīng)過梯度二甲苯脫蠟（100%、90%、80%）及梯度乙醇水化處理（100%、90%、80%、70%）以備染色處理。各組切片浸泡PBS

5 min后滴加3% H2O2，在室溫下孵育15 min；再用PBS充分洗滌后滴加山羊血清，室溫孵育1 h。一抗NeuN（1∶400）在4 ℃冰箱留夜，次日PBS沖洗3次；二抗（FITC）避光常溫孵育1 h，PBS沖洗3次；DAPI孵育25 min復染核，于熒光共聚焦顯微鏡下觀察，使用ImageJ軟件攝取各組熒光強度圖片。

1.4.7 細胞凋亡檢測 所有切片需經(jīng)過梯度二甲苯脫蠟（100%、90%、80%）及梯度乙醇水化處理（100%、90%、80%、70%）以備染色處理；濾紙吸干切片組織周圍的水分，滴加100 μL 1×蛋白酶K至各個樣本上，置于37 ℃恒溫下反應20 min；樣本通透完畢后，PBS漂洗3次；其次，往各個樣本中滴加100 μL TdT Equilibration Buffer，置于37 ℃恒溫下反應10～30 min后利用吸水紙吸除樣本中的TdT Equilibration Buffer；每個樣本再滴加50 μL標記工作液，放入濕盒中避光反應

1 h；將各個樣本再次浸入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗3次；同前吸干水分后，往各個樣本滴加DAPI對細胞核進行復染；最后將各個樣本浸入PBS漂洗4次；晾干后用含抗熒光淬滅劑（自備）的封片劑封片；使用ImageJ軟件攝取各組熒光強度圖片。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以（x-±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學表現(xiàn)

2.1.1 機械縮足反射閾值比較 造模前，各組大鼠機械縮足反射閾值比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。模型組、假推拿組、樞經(jīng)推拿組造模后1、3、7、14 d機械縮足反射閾值均低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；假手術(shù)組在造模后7、14 d機械縮足反射閾值與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；假推拿組、樞經(jīng)推拿組的機械縮足反射閾值在造模后14 d均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；假手術(shù)組、樞經(jīng)推拿組造模后7、14 d機械縮足反射閾值高于假推拿組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表1。

2.1.2 熱縮足反射潛伏期比較 造模前，各組大鼠熱縮足反射潛伏期比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。假手術(shù)組、樞經(jīng)推拿組在造模后1、3、7 d熱縮足反射潛伏期均低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；造模后14 d假手術(shù)組、樞經(jīng)推拿組熱縮足反射潛伏期與正常組比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；假手術(shù)組、假推拿組、樞經(jīng)推拿組在造模后7、14 d熱縮足反射潛伏期均長于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；假手術(shù)組、樞經(jīng)推拿組在造模后14 d熱縮足反射潛伏期長于假推拿組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表2。

2.2 脊髓組織中介導TLR8/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達情況

2.2.1 脊髓組織中Bcl-2、Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表達水平比較 造模后7 d，正常組Bcl-2蛋白表達水平低于其余各組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；假推拿組、假手術(shù)組與模型組的Caspase-3、ERK蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。樞經(jīng)推拿組的Bcl-2蛋白表達水平高于模型組，Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表達水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；樞經(jīng)推拿組的Bcl-2、Caspase-3、ERK、TLR8蛋白表達水平均低于假手術(shù)組、假推拿組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表3及圖1。

造模后14 d，樞經(jīng)推拿組的Bcl-2蛋白表達水平仍高于模型組，Caspase-3、TLR8蛋白表達水平仍低于模型組，而ERK蛋白表達水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表4及圖2。

2.2.2 脊髓組織中LncRNA-GAS5、miR-21基因表達水平比較 造模后7 d，假推拿組和樞經(jīng)推拿組LncRNA-GAS5基因表達水平均高于模型組，miR-21基因表達水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；樞經(jīng)推拿組與假推拿組的miR-21、LncRNA-GAS5基因表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；樞經(jīng)推拿組LncRNA-GAS5基因表達水平高于假推拿組，miR-21基因表達水平低于假推拿組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表5。

造模后14 d，模型組lncRNA-GAS5基因表達水平低于正常組，樞經(jīng)推拿組與假推拿組lncRNA-GAS5基因表達水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；樞經(jīng)推拿組與假推拿組miR-21基因表達水平高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見表6。

2.3 免疫熒光檢測各組大鼠脊髓組織內(nèi)神經(jīng)元凋亡情況 用TUNEL/DAPI和NeuN/DAPI熒光染色定位觀察神經(jīng)元凋亡，結(jié)果顯示，造模后7 d與正常組比較，模型組、假推拿組、假手術(shù)組、樞經(jīng)推拿組中細胞凋亡（TUNEL陽性細胞）增多，神經(jīng)元（NeuN陽性細胞）顯著減少；而樞經(jīng)推拿組與模型組、假推拿組比較，細胞凋亡減少，神經(jīng)元數(shù)量較多，且神經(jīng)元凋亡減少，見圖3及圖4。

3 討論

對NPP的溯源發(fā)現(xiàn)，古代醫(yī)學根據(jù)其臨床表現(xiàn)將其歸屬“痹癥”范疇。本次研究中的NPP大鼠模型背部肌肉疼痛、神經(jīng)損傷，再結(jié)合其術(shù)后跛行、抬足等外觀表現(xiàn)，無異于“痹癥”臨床癥狀，通過辨證分析其核心病機為氣血痹阻筋脈。樞經(jīng)推拿是基于樞經(jīng)學說理論進行的推拿治療，樞經(jīng)學說理論源自《黃帝內(nèi)經(jīng)》，如《素問·陰陽離合論》曰：“太陽為開，陽明為闔，少陽為樞……”“太陰為開，厥陰為闔，少陰為樞……”；縱觀歷史各代醫(yī)家對三種經(jīng)脈作用如星羅棋布般的論述，其中較有代表的論述為“開闔統(tǒng)百病，樞統(tǒng)開闔”［13］?！皹薪?jīng)”是調(diào)節(jié)人體氣血運行、臟腑功能平衡的中樞，因此氣血津液的運行輸布及臟腑生理功能的發(fā)揮在“樞經(jīng)”調(diào)控下得以護衛(wèi)，從而起到扶正祛邪、防病養(yǎng)生的關(guān)鍵作用［14］。足少陽膽經(jīng)作為樞經(jīng)之一，其位于人體之側(cè)，循行周身眾多筋肉骨節(jié)，而骨骼筋肉功能依靠著機體各功能的正常運作，其中氣血的調(diào)和尤為重要；經(jīng)絡是氣血運行的通道，推拿通過作用于樞經(jīng)上的腧穴能夠秉承調(diào)運全身氣血運行之樞紐，尤以疏利膽經(jīng)之氣血，筋痹疼痛得以緩解。由此可見，干預NPP的關(guān)鍵經(jīng)絡是足少陽膽經(jīng)，此次研究中使用的樞經(jīng)推拿方式即選取足少陽膽經(jīng)循行上的穴位進行點、撥、揉等推拿手法干預［15-17］。本研究結(jié)果顯示，樞經(jīng)推拿組與假推拿組的大鼠疼痛閾值相關(guān)指標機械縮足閾值與熱縮足潛伏期較模型組均顯著提升，即推拿通過升高疼痛閾值達到鎮(zhèn)痛作用；而樞經(jīng)推拿組的機械縮足閾值與熱縮足潛伏期顯著高于假推拿組，表明在樞經(jīng)學說理論指導下進行推拿干預的鎮(zhèn)痛效果更為明顯。

NPP的疼痛以頑固性、難愈性著稱，其發(fā)生、發(fā)展和維持機制盤根錯節(jié)，目前尚無明確的效應機制和治療方法，隨著科學研究的不斷深入，已有學者提出神經(jīng)敏感化、肌肉傷害感受神經(jīng)元的塑形化、門控理論等觀點［18］，NPP形成的關(guān)鍵病理因素為神經(jīng)損傷和炎癥［19］。研究表明，神經(jīng)元凋亡是許多神經(jīng)損傷后引發(fā)神經(jīng)元死亡的主要方式之一，神經(jīng)損傷后，產(chǎn)生的痛覺信號傳入脊髓刺激神經(jīng)元釋放促炎相關(guān)因子，從而引發(fā)炎癥反應，誘導神經(jīng)元凋亡，而神經(jīng)元本身沒有增殖修復能力，最終導致神經(jīng)元對疼痛敏感性升高［20-21］。因此，阻斷或減輕脊髓背角神經(jīng)元凋亡，是緩解NPP的有效方式。

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA可通過表觀遺傳和細胞凋亡調(diào)控許多疾病的發(fā)生、發(fā)展，逐漸成為近年來研究的熱點，其中LncRNA參與NPP的調(diào)控引發(fā)廣泛關(guān)注［22］。已有研究表明，在SNL大鼠脊髓背角存在大量LncRNA的差異表達，干預這些LncRNA能有效緩解疼痛，由此說明LncRNA在NPP的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其有望成為治療NPP的新靶點［23］。GAS 5是位于1號染色體長臂2區(qū)5帶的一類LncRNA，由12個外顯子及11內(nèi)含子組成，目前認為與神經(jīng)元凋亡、血管重塑、炎癥反應等生物行為相關(guān)［24］。ZHAO等［25］在大鼠實驗研究中發(fā)現(xiàn)通過抑制LncRNA-GAS5水平可以顯著降低凋亡基因BAX的水平，并提高抗凋亡疾病Bcl-2的表達水平，最終表明敲低LncRNA-GAS5的表達對腦梗死模型大鼠神經(jīng)元凋亡具有抑制作用。ZHANG等［26］研究表明，LncRNA-GAS5通過加劇神經(jīng)元糖酵解作用來誘導神經(jīng)元細胞凋亡。除了直接調(diào)控細胞凋亡外，LncRNA-GAS5還可以發(fā)揮“分子海綿”的作用來吸附miRNA對靶基因起調(diào)控作用，進而在細胞凋亡中發(fā)揮作用［27］。已有研究證明，在神經(jīng)元保護和修復過程中，miR-21被確認具有關(guān)鍵性調(diào)控作用［28］。KARL等［29］揭示了SNL大鼠脊髓和背根神經(jīng)節(jié)（DRG）內(nèi)miR-21的表達顯著增加，鞘內(nèi)注射miR-21抑制劑后，大鼠的機械性異常疼痛及熱痛覺過敏均減輕，表明miR-21有望成為未來NPP治療的下游靶點。本研究結(jié)果顯示，造模7 d后，樞經(jīng)推拿組與模型組、假推拿組比較細胞凋亡減少，神經(jīng)元數(shù)量較多，且神經(jīng)元凋亡減少，表明樞經(jīng)推拿治療可以顯著減少SNL大鼠的神經(jīng)元細胞凋亡。此外，模型組大鼠脊髓組織中LncRNA-GAS5表達水平低于正常組，而miR-21基因的表達水平高于正常組，提示miR-21在SNL大鼠中升高，與KARL等［29］研究結(jié)果一致。而與模型組相比，樞經(jīng)推拿組的LncRNA-GAS5表達水平顯著升高，同時miR-21表達水平顯著降低，由此推測，樞經(jīng)推拿作用于皮膚、肌肉等接收疼痛信號的外周軀體組織，略微阻斷疼痛信號傳至脊髓背角淺層，并刺激脊髓中的LncRNA-GAS5表達水平增長，LncRNA-GAS5發(fā)揮“吸附作用”使得miR-21表達水平降低，從而間接起到抑制神經(jīng)元凋亡的作用。另外，通過比較7、14 d模型組和樞經(jīng)推拿組中miR-21的表達水平可發(fā)現(xiàn)，模型組中miR-21的表達由高表達變?yōu)榈捅磉_，與之相反，樞經(jīng)推拿組中miR-21的表達則由低表達變?yōu)楦弑磉_，考慮為14 d模型組大鼠隨著機體的自然修復，疼痛逐漸減輕，因此脊髓中miR-21的水平降低，而樞經(jīng)推拿組大鼠在推拿干預下可能涉及參與調(diào)控miR-21的負反饋機制，然而具體機制尚不明確，有待日后進一步研究探討。

TLR8屬于Toll受體家族成員，主要在中小型異凝集素B4非肽能神經(jīng)元中表達，在病原體識別和先天免疫激活中起重要作用。已有研究證明，TLR8及其介導的信號通路在NPP的調(diào)控過程中以調(diào)控炎癥反應和免疫應答的方式參與，其中TLR8的激活具有抑制神經(jīng)突生長和誘導神經(jīng)元凋亡的能力，表明TLR8是軸突生長的負調(diào)控因子和神經(jīng)元凋亡的誘導因子［30-31］。ERK在神經(jīng)保護中是關(guān)鍵酶之一，神經(jīng)損傷會引起ERK磷酸化，ERK磷酸化后可上調(diào)BAD、BAX等促凋亡蛋白，并下調(diào)Bcl-2家族的抗凋亡蛋白以及激活凋亡終末效應器Caspase來觸發(fā)聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）蛋白水解，從而促進神經(jīng)細胞凋亡［32］。ZHANG等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在SNL大鼠的脊髓背角中，TLR8表達顯著增加，miR-21是其內(nèi)源性配體，TLR8通過miR-21的活化導致ERK磷酸化介導炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生以及神經(jīng)元的過度興奮來參與NPP。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，樞經(jīng)推拿組細胞凋亡誘導因子TLR8水平下調(diào)，miR-21介導的ERK蛋白也隨之下調(diào)；與之相反，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平上升，其通過抑制了人細胞色素C（Cyt-C）從線粒體釋放，進而也降低Caspase-3的表達［33］，最終顯著減少大鼠神經(jīng)元的凋亡，緩解疼痛的發(fā)展，起到保護神經(jīng)元的作用。

綜上所述，本研究中推拿手法在樞經(jīng)理論指導下通過干預足少陽膽經(jīng)上的關(guān)鍵穴位可減輕疼痛部位的炎癥反應，進一步調(diào)控脊髓背角神經(jīng)元凋亡來達到緩解NPP的作用，其機制可能與通過上調(diào)LncRNA-GAS5的表達，下調(diào)miR-21以及調(diào)控TLR8/ERK通路上下游的相關(guān)蛋白和因子表達有關(guān)。本研究在一定程度上為臨床樞經(jīng)推拿治療NPP提供了實驗依據(jù)，初步推測LncRNA-GAS5是通過發(fā)揮“分子海綿”功能吸附miR-21介導TLR8/ERK通路相關(guān)蛋白抑制神經(jīng)元凋亡，雖然其具體機制未明確證實，但LncRNA-GAS5有望成為未來治療NPP的新靶點，今后可用miR-21抑制劑或基因敲除等方式進一步探究LncRNA-GAS5與miR-21、TLR8以及ERK的關(guān)系，更深入闡明樞經(jīng)推拿對NPP的鎮(zhèn)痛機制。

作者貢獻：韋宗波負責文章的構(gòu)思、論文撰寫及論文的修訂；王雄將負責設計研究方案，進行動物造模；龍炳材、夏天、盧棟明進行整理數(shù)據(jù)、研究結(jié)果的分析；梁英業(yè)負責文章的質(zhì)量控制與審校；唐宏亮提出研究思路，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2023-05-14；修回日期：2023-07-10）

（本文編輯：崔莎）

基金項目：國家自然科學基金資助項目（82205305）；廣西自然科學基金資助項目（2019GXNSFBA245074）；廣西中青年教師科研基礎能力提升項目（2020KY07014）；廣西中醫(yī)藥大學校級科研項目（2019QN013）

*通信作者：王雄將，主治醫(yī)師；E-mail：958207546@qq.com

本文數(shù)字出版日期：2023-07-25