許雯怡，張雨諾，馮亞棟，2，尤智立，2*

（1.廈門醫(yī)學(xué)院，福建廈門 361023；2.廈門醫(yī)學(xué)院天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建廈門 361023）

皮膚長期暴露于紫外線下，會大量產(chǎn)生超氧陰離子、過氧化氫及氫基自由基等物質(zhì)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，影響細(xì)胞氧化與抗氧化平衡，造成細(xì)胞氧化傷害和加速衰老進(jìn)程[1]，因此，化妝品行業(yè)一直致力于尋找安全、高效的抗氧化劑延緩皮膚衰老[2]。而開發(fā)具有抗氧化作用的植物，將其應(yīng)用到化妝品中，是化妝品行業(yè)發(fā)展的一大重要趨勢[3]。DPPH 自由基清除實(shí)驗(yàn)和ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)通過評估自由基清除活性，為篩選開發(fā)新原料提供有力的科學(xué)依據(jù)[4-5]。此外，檢測還原金屬離子和螯合金屬離子的能力，也是評估其是否具有良好的抗氧化作用的重要體外實(shí)驗(yàn)[5-6]。氧化應(yīng)激反應(yīng)還可激活透明質(zhì)酸酶的活性，增加透明質(zhì)酸的降解，加速皮膚的衰老[7-8]。酪氨酸酶是催化生物體內(nèi)黑色素生物合成的第一步和限速步驟的關(guān)鍵酶[9]，酪氨酸酶可以將酪氨酸氧化為多巴醌，而多巴醌是合成真黑素和褐黑素的底物。因此，可以通過抑制酪氨酸酶的活性來減少黑色素生成[10]。尋找高效的、具有美白及抗衰功效的化妝品成分是化妝品行業(yè)的研究熱點(diǎn)，且是否具有抑制酪氨酸酶活性的效果和清除活性氧自由基的效果是目前篩選美白祛斑類化妝品活性成分的重要依據(jù)[11]。α-黑色素細(xì)胞刺激素（α-Melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）可增強(qiáng)小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16F10）細(xì)胞中酪氨酸酶活性，增加黑色素的生成，構(gòu)建α-MSH誘導(dǎo)的B16F10 細(xì)胞模型，觀察提取物作用后細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性和黑色素生成量的變化，可以從細(xì)胞層面檢測該提取物的安全性和美白效果[12-13]。而市面上的許多原料被認(rèn)為安全性低，這也使得兼有安全性與功效性的天然植物提取物越來越受到消費(fèi)者的青睞。

雀舌草（學(xué)名：Stellaria alsineGrimm），又名天蓬草、葶藶子、蛇查口、地耳草、田基黃，為雙子葉植物綱、石竹科，繁縷屬二年生草本植物，一般被用于治療傷風(fēng)感冒和跌打損傷等?，F(xiàn)今對雀舌草的抗氧化、美白功效研究報導(dǎo)很少，目前僅見對其中黃酮類物質(zhì)提取工藝的研究[14-15]，而與雀舌草同屬石竹科繁縷屬的繁縷中提取的黃酮具有較強(qiáng)的羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力[16]。為了進(jìn)一步發(fā)掘雀舌草的用藥潛能，探究其抗氧化、美白能力，本實(shí)驗(yàn)采用無水乙醇對雀舌草進(jìn)行活性成分的提取、濃縮與凍干，再通過進(jìn)行DPPH、ABTS+自由基清除實(shí)驗(yàn)、鐵離子還原能力實(shí)驗(yàn)、銅離子還原及螯合實(shí)驗(yàn)、透明質(zhì)酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)、蘑菇酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)、B16F10 小鼠黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)黑色素含量測定和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)等對雀舌草的抗氧化、美白作用進(jìn)行研究，為雀舌草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

雀舌草，原植物經(jīng)由廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥物檢測中心鮑紅娟副教授鑒定；2，2-聯(lián)苯基-1 苦基肼基（DPPH）、熊果苷（Arbutin）、沒食子酸、透明質(zhì)酸酶購于Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP 法）、總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS 法）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蘆?。≧utin）購于上海源葉生物科技有限公司；蘑菇酪氨酸酶（TYR）、左旋多巴（L-Dopa）、透明質(zhì)酸、4-二甲氨基苯甲醛（DMBA）購于生工生物工程（上海）股份有限公司；2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四硼酸二鈉購于上海麥克林生化科技股份有限公司；α-MSH 購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

92-IIN 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；N-1210B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；FS-600N 型超聲波處理器（上海生析超聲儀器有限公司）；GM-0.5B 型隔膜真空泵（天津市津藤實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；FDU-1200 型冷凍干燥機(jī)（上海愛朗儀器有限公司）；HWS-12 型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 雀舌草醇提物的制備

將雀舌草干燥研磨成粉，無水乙醇浸泡超聲30 min，過濾旋轉(zhuǎn)蒸餾后冷凍干燥，獲得其粉末。用無水乙醇回溶，作為實(shí)驗(yàn)樣品。

1.3.2 DPPH 自由基清除能力測定

在96 孔板每孔加入20 μL 各濃度樣品，空白對照組為無水乙醇，再加入180 μL DPPH 工作液置暗處20 min，測定517 nm 吸光值，清除率按下式計算（A 空白代表空白對照的吸光值，A 樣品代表樣品溶液的吸光值）：

1.3.3 ABTS+自由基清除能力測定

在96 孔板中每孔加入10 μL 各濃度樣品，空白對照組為無水乙醇，再加入90 μL ABTS 工作液后置暗處反應(yīng)10 min，測定734 nm 吸光值，用公式（1）計算清除率。

1.3.4 鐵離子還原能力測定

在96 孔板中每孔加入20 μL 各濃度樣品，空白對照組為無水乙醇，再加入180 μL FRAP 工作液，37 ℃反應(yīng)5 min，測593 nm 吸光值。

1.3.5 銅離子還原能力測定

在EP 管中加入60 μL 1 M 乙酸銨緩沖溶液、50 μL 7.5 mM 新銅素乙醇溶液、50 μL 10 mM 氯化亞銅溶液和40 μL 各濃度樣品，反應(yīng)60 min 后測量450 nm吸光值。

1.3.6 銅離子螯合能力測定

在EP 管中加入40 μL 各濃度樣品、10 μL 5 mM的硫酸銅溶液和140 μL 50 mM 的乙酸鈉緩沖液，避光反應(yīng)30 min 后加入10 μL 4 mM 的鄰苯二酚紫溶液，反應(yīng)30 min 后在632 nm 處測量其吸光值。螯合能力（%）由公式（1）計算。

1.3.7 透明質(zhì)酸酶活性抑制能力測定

在EP 管中依次加入20 μL 各濃度樣品，100 μL 900 U/mL 透明質(zhì)酸酶溶液，混合均勻后于37 ℃孵育0.5 h，加入180 μL 2.5 mg/mL 透明質(zhì)酸溶液并混合均勻后于37 ℃孵育0.5 h，加入50 μL 0.8 M 四硼酸二鈉水溶液后，于95 ℃水浴5 min，待冷卻至室溫后加入400 μL 100 mg/mL DMBA 溶液，混勻并于37 ℃孵育5 min 后，在590 nm 處測量其吸光值，抑制率按公式（1）計算。

1.3.8 蘑菇酪氨酸酶活性抑制能力測定

在每個EP 管中加入300 μL 的左旋多巴（LDopa）溶液和200 μL 各濃度樣品，空白對照組則加入等體積無水乙醇，最后加入100 μL 400 U/mL 的酪氨酸酶（TYR）溶液，充分混勻后迅速吸取180 μL 液體于96 孔板中，20 min 后測量475 nm 吸光值，酪氨酸酶抑制率按公式（1）計算。

1.3.9 細(xì)胞活性測定（MTT 法）

B16F10 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，以每孔100 μL 于96 孔板培養(yǎng)8 h后，加入不同濃度樣品，孵育24 h。每孔加入10 μL 5 mg/mL 的MTT，培養(yǎng)4 h 去除上清液，加入150 μL DMSO，測定570 nm 吸光值。

1.3.10 細(xì)胞內(nèi)黑色素含量測定

細(xì)胞鋪于6 孔板，培養(yǎng)8 h 后加入終濃度為100 μM α-MSH 及不同濃度樣品，以100 μg/mL α-熊果苷為對照組，控制組未加任何物質(zhì)，培養(yǎng)24 h 收集細(xì)胞并用200 μL 0.5% Triton X-100 于4 ℃裂解1 h，期間振蕩5 次，12 000 R 離心5 min 后，分離沉淀和上清液于-20 ℃保存。

在沉淀物中加入1 M NaOH（含10% DMSO）100 μL吹打混勻后于沸水中煮10 min，冷卻后各取90 μL 測量475 nm 吸光值。黑色素含量按下式計算（A 樣品代表樣品溶液的吸光值，A 空白代表空白對照的吸光值）：

黑色素含量=（A 樣品/A 空白）×100%。（2）

1.3.11 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性實(shí)驗(yàn)

于96 孔板中加入50 μL 上清液和150 μL 10 mM的L-Dopa 溶液，混合均勻后于37 ℃孵育0.5 h 后，測量475 nm 處吸光值，并按公式（1）計算酪氨酸酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗氧化能力檢測

由圖1 可知，雀舌草醇提物在DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、鐵離子還原能力、銅離子螯合能力和銅離子還原能力都有不錯的表現(xiàn)，可從表1 的IC50和EC50數(shù)值可判斷雀舌草醇提物有很好的抗氧化能力。

表1 雀舌草醇提物的抗氧化和透明質(zhì)酸酶活性抑制能力匯總

圖1 雀舌草醇提物的抗氧化能力

2.2 透明質(zhì)酸酶活性抑制能力

由圖2 可知，雀舌草醇提物可以抑制透明質(zhì)酸酶活性并呈濃度依賴性，其中，1.33 mg/mL 的抑制率為100%。因此，通過抑制透明質(zhì)酸酶活性實(shí)驗(yàn)，雀舌草醇提物可能在抗衰老方面發(fā)揮一定作用。

圖2 雀舌草醇提物的透明質(zhì)酸酶活性抑制能力

2.3 蘑菇酪氨酸酶活性抑制能力

由圖3 可知，1 mg/mL 的雀舌草醇提物對酪氨酸酶抑制率為31.29%，蘑菇酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)常用于檢測該物質(zhì)是否具有美白能力的體外實(shí)驗(yàn)。由此可知雀舌草醇提物有可能抑制細(xì)胞黑色素生成。

圖3 雀舌草醇提物的蘑菇酪氨酸酶活性抑制能力

2.4 雀舌草醇提物對B16F10 細(xì)胞活性

由圖4 可知，不同濃度醇提物處理B16F10 細(xì)胞24 h后，當(dāng)質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時，B16F10 細(xì)胞存活率約91%，說明在100 μg/mL 以內(nèi)時，有較好的細(xì)胞存活率。

圖4 雀舌草醇提物的細(xì)胞存活率

2.5 雀舌草醇提物對α-MSH 誘導(dǎo)的B16F10 細(xì)胞酪氨酸酶活性及黑色素含量的影響

由圖5 和圖6 可知，α-MSH 使B16F10 細(xì)胞酪氨酸酶活性顯著增強(qiáng)，黑色素含量增加。但雀舌草醇提物對酪氨酸酶的活性有顯著抑制作用，使B16F10 細(xì)胞的黑色素含量顯著降低（*P〈0.01）。由此可見，雀舌草醇提物可以抑制細(xì)胞黑色素生成。

圖5 雀舌草醇提物對B16F10 細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

圖6 雀舌草醇提物對B16F10 細(xì)胞黑色素含量的影響

3 結(jié)論

開發(fā)具有抗氧化、美白功效的天然植物化妝品成分，迎合消費(fèi)者和化妝品公司的需求，是市場的重要發(fā)展趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，雀舌草醇提物具有DPPH、ABTS+自由基清除能力、鐵離子還原能力、銅離子螯合能力和銅離子還原能力，展現(xiàn)出很好的抗氧化作用，并對透明質(zhì)酸酶活性具有較好的抑制作用，說明其在抗衰老方面有一定作用。此外，本實(shí)驗(yàn)證明雀舌草醇提物具有抑制蘑菇酪氨酸酶活性的作用，并能抑制α-MSH 誘導(dǎo)的B16F10 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性，減少黑色素生成。綜上所述，雀舌草醇提物具有抗氧化和黑色素生成抑制的作用，有望成為潛在的天然抗衰老及美白活性成分應(yīng)用于化妝品中。