鄭玉婷，洪 濤，徐柯卉，溫明皓，楊吉雪，伍夢(mèng)瑩，杭太俊，宋 敏

（中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析系，南京 210009）

脂質(zhì)體是由一個(gè)或多個(gè)磷脂雙分子層包裹核心水相組成的球形囊泡，它們獨(dú)特的兩親性使其能夠裝載各種疏水或親水的生物活性物質(zhì)，具有靶向性、生物利用度高、提高藥物穩(wěn)定性、降低藥物毒性等優(yōu)勢(shì)。由于藥物臨床試驗(yàn)的成本高、風(fēng)險(xiǎn)大，通過(guò)體外釋放來(lái)預(yù)測(cè)體內(nèi)行為，可以降低脂質(zhì)體藥物臨床失敗的風(fēng)險(xiǎn)。1997 年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《口服緩釋劑型:體外/體內(nèi)相關(guān)性的開(kāi)發(fā)、評(píng)價(jià)和應(yīng)用》（Extended Release Oral Dosage Forms:Development,Evaluation,and Application of In vitro/In vivo Correlations）指南中揭示了體外溶出度檢測(cè)的重要意義：（1）提供過(guò)程控制和質(zhì)量保證；（2）確定產(chǎn)品隨時(shí)間的穩(wěn)定釋放特性；（3）利于監(jiān)管決定[1]。釋放度不僅能區(qū)別不同處方或組成的制劑，還在一定程度上反映了藥物的安全性有效性，故體外釋放是脂質(zhì)體藥物的關(guān)鍵質(zhì)量控制項(xiàng)目之一[2]。

本研究針對(duì)創(chuàng)新藥物類紫杉醇脂質(zhì)體凍干粉制劑進(jìn)行研究。類紫杉醇新藥化學(xué)結(jié)構(gòu)與紫杉醇和多西他賽相似，均具有相同的10-脫乙?；涂ǘ、竽负耍胰呖鼓[瘤機(jī)制相同，均主要作用于微管和微管蛋白系統(tǒng)從而起到抗腫瘤的作用。由于類紫杉醇的疏水特征，將其包裹在由磷脂、膽固醇合成的膜層結(jié)構(gòu)中制成脂質(zhì)體，可有效降低增溶劑導(dǎo)致的不良反應(yīng)。本品預(yù)期體內(nèi)釋放時(shí)間為12 h。在分析現(xiàn)有體外釋放方法的優(yōu)缺點(diǎn)基礎(chǔ)上，結(jié)合本品的特點(diǎn)，進(jìn)行了分析測(cè)定方法的開(kāi)發(fā)。

離心超濾法效率高、設(shè)備成本低、操作快速；固相萃取法對(duì)脂質(zhì)體和游離藥物的分離度較高，可有效去除干擾物質(zhì)，靈敏度高[3]，在體外釋放研究中也有應(yīng)用[4-5]。因此本研究分別采用了離心超濾法、固相萃取法以及透析袋與溶出槳法結(jié)合的方法對(duì)類紫杉醇脂質(zhì)體制劑進(jìn)行釋放度考察。最終發(fā)現(xiàn)將透析袋與溶出槳法結(jié)合效果最佳，簡(jiǎn)稱為槳膜結(jié)合法，并對(duì)該方法進(jìn)行了條件優(yōu)化。

1 材 料

1.1 試藥與試劑

自制類紫杉醇原料藥（批號(hào)：191104，定量核磁標(biāo)定純度97.75%）；自制類紫杉醇脂質(zhì)體凍干粉（批號(hào)：210302、210303、210304，每支20 mg）。

乙腈、甲酸、硫酸、甲酸銨（分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、十二烷基硫酸鈉（SDS）（分析純，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；吐溫-80（化學(xué)純，南京化學(xué)試劑股份有限公司）；三乙胺（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；牛血清白蛋白（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：ST023-50 g）；Amicon?Ultra-0.5 超濾離心管（美國(guó)Millipore 公司，規(guī)格：30 K）；Oasis HLB 30 μmol/L 固相萃取柱（美國(guó)Waters 公司，規(guī)格：60 mg/3 cc）；普通型透析袋3.5 kD（批號(hào)：MD3525），普通型透析袋8 ～ 14 kD（批號(hào)：MD1425），纖維素透析袋100 kD（批號(hào)：SP131414），以上透析袋均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；即用型透析袋1 000 kD（美國(guó)光譜醫(yī)學(xué)公司，批號(hào)：131492）；0.45 μm 水系濾膜（天津津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；0.22 μm 水系濾膜（上海新亞凈化器件廠）。

1.2 儀 器

LC-2010C HT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；BS 110S 型電子分析天平、BS 21S 型電子分析天平，PB-10 普及型pH 計(jì)（德國(guó)Sartorius 公司）；ZRS-8G 智能溶出試驗(yàn)儀（天津大學(xué)無(wú)線電廠）；MZY-UR30VF 實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（南京妙之儀電子科技有限公司）；KH-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；Zetasizer Nano ZS90 激光粒度分析儀（英國(guó)Malvern Instruments公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 釋放方法的選擇

將類紫杉醇脂質(zhì)體均勻分散于HEPES 緩沖液中，加入三乙胺硫酸鹽后置37 ℃水浴中振蕩。在適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)吸取溶液0.5 mL，置于超濾離心管，以14 500 r/min 轉(zhuǎn)速離心30 min 或加在預(yù)處理的Oasis固相柱上分離脂質(zhì)體與游離藥物。

離心超濾法在48 h 釋放度僅為（22.48 ±7.45）%（n= 6），考慮可能是脂質(zhì)體釋放的游離藥物不溶于HEPES 釋放介質(zhì)，導(dǎo)致離心時(shí)無(wú)法透過(guò)濾膜孔徑，而留在了膜內(nèi)，使釋放度測(cè)量不準(zhǔn)。故取適量原料藥用含0.5%吐溫80 的HEPES 釋放介質(zhì)溶解后按上述超濾離心法處理，測(cè)得結(jié)果發(fā)現(xiàn)超濾膜對(duì)游離藥物存在著顯著吸附。游離藥物留在了膜內(nèi)，而未濾過(guò)膜外。即使采用游離藥物對(duì)超濾膜進(jìn)行預(yù)飽和，也不能有效消除其吸附作用，使得數(shù)據(jù)測(cè)定無(wú)法客觀準(zhǔn)確。

固相萃取法48 h 釋放率為（24.5 ± 5.42）%（n= 6），分析原因可能是游離藥物與SPE 小柱在預(yù)處理過(guò)程中引入的牛血清白蛋白結(jié)合，導(dǎo)致在淋洗步驟時(shí)以藥物-蛋白結(jié)合形式被洗脫下來(lái)造成損失。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三乙胺硫酸鹽作為釋放劑，主要是增大內(nèi)水相滲透壓使內(nèi)水相中的藥物釋放，而對(duì)于分布在脂質(zhì)雙分子層中的類紫杉醇藥物，是否加入三乙胺硫酸鹽對(duì)其釋放無(wú)影響。

2.2 透析袋截留相對(duì)分子質(zhì)量的選擇

裁取6 cm 左右透析袋，兩端以配套的透析夾夾緊并用牛皮筋固定于溶出槳上，照高效液相色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版四部通則0512項(xiàng)下高效液相色譜法）測(cè)定。由表1可知透析袋內(nèi)脂質(zhì)體水溶液上樣體積為0.5 mL 和1 mL 釋放最好，更換表面活性劑后24 h 釋放量明顯變大，表明SDS 比吐溫80 更能增大脂質(zhì)體表面磷脂雙分子層的流動(dòng)性。同時(shí)也反映了透析袋截留相對(duì)分子質(zhì)量太小導(dǎo)致藥物不能透過(guò)的問(wèn)題，使用1 000 kD的透析袋為最佳。

Table1 In vitro release results of liposomes with dialysis bag in different molecular weight cut-off at 24 h

2.3 釋放介質(zhì)的選擇

在透析袋內(nèi)脂質(zhì)體水溶液的上樣體積為1 mL時(shí)，如圖1 所示，分別比較了0.1%、0.3%、0.5%SDS 的PBS 緩沖液和0.1%、0.3%、0.5% SDS 的HEPES 緩沖液作為介質(zhì)的釋放情況，由于0.5%SDS相較于更低濃度的SDS，HEPES 緩沖液相較于PBS緩沖液更能滿足預(yù)期時(shí)間的體內(nèi)釋放要求，因此選定SDS 濃度為0.5%、釋放介質(zhì)為HEPES 緩沖液。

Figure1 In vitro drug release curves of paclitaxel derivative liposomes in different dissolution media （, n = 3）

2.4 透析袋內(nèi)脂質(zhì)體水溶液上樣體積考察

由表2 可知在0.5 mL 上樣時(shí)累積釋放度的RSD 整體小一些，而且釋放更快?？紤]到當(dāng)上樣體積過(guò)小時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致移取溶液的誤差變大，重復(fù)性變差，從而使RSD 增大，故選定脂質(zhì)體水溶液上樣體積為0.5 mL的條件下對(duì)溶解凍干粉的水溶液體積進(jìn)行考察。

Table2 In vitro release results of liposomes with 0.5 mL and 1 mL of aqueous solution in dialysis bag (, n = 3)

Table2 In vitro release results of liposomes with 0.5 mL and 1 mL of aqueous solution in dialysis bag (, n = 3)

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2.5 脂質(zhì)體凍干粉溶解體積考察

釋放度考察中一般要求靠前時(shí)間點(diǎn)累積釋放度的RSD 可稍大一些（應(yīng)在20%以內(nèi)），其后各時(shí)間點(diǎn)的RSD 應(yīng)在10%以內(nèi)，由表3 所示，20 mL 比30 mL 更符合規(guī)定。故最終優(yōu)化條件為以0.5%SDS 的HEPES 作為釋放介質(zhì)，20 mL 純化水溶解脂質(zhì)體凍干粉，透析袋內(nèi)脂質(zhì)體水溶液上樣0.5 mL進(jìn)行釋放。

Table3 In vitro release results of liposomes with 20 mL and 30 mL of purified water in penicillin bottle(, n = 3)

Table3 In vitro release results of liposomes with 20 mL and 30 mL of purified water in penicillin bottle(, n = 3)

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2.6 體外釋放測(cè)定結(jié)果

測(cè)定方法見(jiàn)“2.2”項(xiàng)。類紫杉醇脂質(zhì)體在0.5，1，2，4，6，8，12 h 的累計(jì)釋放速率分別為（3.71 ±0.68）%、（11.44 ± 1.85）%、（35.39 ± 4.62）%、（78.48 ± 2.82）%、（91.79 ± 2.65）%、（97.28 ±3.3）%和（102.83 ± 2.96）%（n=6）。

2.7 批間重復(fù)性考察

3批脂質(zhì)體制劑在 12 h內(nèi)釋放穩(wěn)定，批次間一致性良好，如圖2所示。自制類紫杉醇脂質(zhì)體整體釋放緩慢，無(wú)突釋現(xiàn)象，6 h后累計(jì)釋放率逐漸達(dá)到平臺(tái)。

Figure2 In vitro drug release curves of different batches of paclitaxel derivative liposome （, n = 6）

2.8 區(qū)分能力考察

藥物釋放時(shí)間依賴于磷脂含量，磷脂含量越高，藥物釋放越慢。釋藥曲線差異源于兩種處方中藥脂比不同，由于處方1 中磷脂含量比處方2 約低9%，故在12 h內(nèi)釋放速率較高。圖3表明，本方法對(duì)不同處方的脂質(zhì)體體外釋放具有區(qū)分能力。

Figure3 In vitro drug release curves of paclitaxel derivative liposome with different formulas （, n = 6）

2.9 不同pH條件考察

由于脂質(zhì)體進(jìn)入體內(nèi)會(huì)受到巨噬細(xì)胞和外周巨細(xì)胞的吞噬，這些細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生酸性和其他物質(zhì)以加速脂質(zhì)體降解，使細(xì)胞與脂質(zhì)體界面的pH 小于7，故考察了釋放介質(zhì)在pH 6.5 和pH 7.4 條件下藥物釋放情況。結(jié)果見(jiàn)圖4。4 h前pH 6.5釋放得快，4 h 后pH 7.4 釋放略快于pH 6.5，釋放曲線的差異反映了介質(zhì)pH 對(duì)脂質(zhì)體體外釋放的影響，提示體內(nèi)環(huán)境變化對(duì)脂質(zhì)體體內(nèi)釋藥可能的作用。

Figure4 In vitro drug release curves of paclitaxel derivative liposome under different pH conditions （, n = 6）

3 討 論

本研究為建立類紫杉醇藥物在12 h 內(nèi)從脂質(zhì)體中完全釋放的方法，在釋放方法、透析袋截留相對(duì)分子質(zhì)量、透析袋膜材和表面活性劑等多個(gè)方面進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明類紫杉醇脂質(zhì)體在體外具有良好的緩釋作用。該方法可用于評(píng)估非水溶性藥物脂質(zhì)體制劑的體外擴(kuò)散動(dòng)力學(xué)、測(cè)試產(chǎn)品質(zhì)量的一致性、建立體外/體內(nèi)行為的相關(guān)性，為脂質(zhì)體制劑評(píng)價(jià)影響藥物質(zhì)量的工藝變更提供有用的反饋。

3.1 透析袋截留相對(duì)分子質(zhì)量的確定

Xu 等[6]提出在脂質(zhì)體不能透過(guò)的前提下，透析袋的截留相對(duì)分子質(zhì)量應(yīng)為藥物相對(duì)分子質(zhì)量的100 倍，否則會(huì)使透過(guò)效率變低。然而，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明100 kD 的透析袋也未達(dá)到相對(duì)分子質(zhì)量約為1 000 的類紫杉醇期望的釋放量，為使藥物盡快釋放，繼續(xù)考察更大孔徑的透析袋。經(jīng)測(cè)定類紫杉醇脂質(zhì)體粒徑為（93.81 ± 1.722）nm，美國(guó)光譜醫(yī)學(xué)1 000 kD 透析袋的孔徑大約為70 nm，對(duì)于本研究中粒徑分布集中在75 ～ 150 nm 的類紫杉醇脂質(zhì)體不能通過(guò)，只有當(dāng)類紫杉醇藥物從脂質(zhì)體中釋放出來(lái)進(jìn)入溶液中時(shí)才能進(jìn)行擴(kuò)散，因此本研究中選用的1 000 kD 透析袋符合預(yù)期釋放要求。

3.2 透析袋膜材比較

試驗(yàn)中嘗試了不同品牌、不同孔徑的纖維素酯膜（cellulose ester, CE）和再生纖維素膜（regenerated cellulose, RC），如表4 所示，再生纖維素膜作為親水性膜不會(huì)對(duì)類紫杉醇造成吸附，然而其無(wú)法使脂質(zhì)體達(dá)到12 h 完全釋放。雖然纖維素酯膜對(duì)類紫杉醇藥物有吸附，但是試驗(yàn)表明可通過(guò)0.5% SDS的水溶液洗滌數(shù)次以消除藥物殘留。

Table4 In vitro release results of paclitaxel derivative liposomes with different brands of dialysis bags(, n = 6)

Table4 In vitro release results of paclitaxel derivative liposomes with different brands of dialysis bags(, n = 6)

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3.3 表面活性劑的選擇

在槳膜結(jié)合法的介質(zhì)選擇方面，基于自制類紫杉醇藥物的非親水性特征，考慮在釋放溶液中加入表面活性劑來(lái)增大磷脂膜流動(dòng)性促進(jìn)藥物釋放。擬定表面活性劑須滿足3點(diǎn)要求：一是符合漏槽條件；二是要達(dá)試驗(yàn)預(yù)期釋放量；三是表面活性劑的濃度要盡可能低以更好模擬體內(nèi)生理環(huán)境。實(shí)驗(yàn)測(cè)得SDS 對(duì)類紫杉醇原料藥的浸潤(rùn)性較好，能明顯增加原料藥在水性介質(zhì)中的溶解度，比吐溫80 更能促進(jìn)類紫杉醇藥物釋放，故SDS 適合作為類紫杉醇脂質(zhì)體體外釋放試驗(yàn)的表面活性劑。

4 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)脂質(zhì)體技術(shù)迎來(lái)新的突破，例如脂質(zhì)納米粒、長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體、pH 敏感脂質(zhì)體、溫度敏感脂質(zhì)體、磁性脂質(zhì)體和免疫脂質(zhì)體等[7]。由于包載藥物性質(zhì)及脂質(zhì)體制劑功能的不同，體外釋放方法不一而足。觸發(fā)釋放行為、分離包封與游離藥物、檢測(cè)分析手段是開(kāi)發(fā)釋放方法需要考慮的3個(gè)因素。透析法[8-14]是目前最受熱衷的方法，然而對(duì)于快釋制劑，藥物跨越透析膜可能是限速步驟[15]。無(wú)透析袋的取樣分離法[4,16-18]需要保證脂質(zhì)體與游離藥物分離完全；不使用分離手段而直接檢測(cè)藥物釋放的電化學(xué)法[19]、熒光法[20-21]則要求藥物具備檢測(cè)特殊性。透析適配器技術(shù)[2]和分散釋放器技術(shù)[22-23]已經(jīng)被證明改善了膜滲透限速的影響，且使用了藥典規(guī)定的溶出設(shè)備，為體外釋放儀器的商業(yè)化生產(chǎn)、規(guī)范化使用、制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，透析袋質(zhì)量參差不齊，必要時(shí)應(yīng)對(duì)透析袋進(jìn)行篩選比較。透析膜的截留相對(duì)分子質(zhì)量和儀器自動(dòng)化程度限制了脂質(zhì)體釋藥試驗(yàn)的進(jìn)一步優(yōu)化。藥物體外擴(kuò)散研究方法的選擇需要結(jié)合具體藥物分析，從而推動(dòng)配方開(kāi)發(fā)、臨床治療和結(jié)果預(yù)測(cè)。