摘要：研究靈芝以荷葉為主要基質(zhì)的固態(tài)發(fā)酵工藝，并測(cè)定發(fā)酵前后活性成分的含量。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以生物量為檢測(cè)指標(biāo)，考察水料比、碳源、氮源及荷葉規(guī)格4個(gè)因素對(duì)靈芝發(fā)酵的影響，得出最優(yōu)培養(yǎng)條件為：水料比3.0∶1，碳源（葡萄糖）10%，氮源（大豆蛋白）4%，七水合硫酸鎂0.1 g，磷酸二氫鉀0.15 g，荷葉規(guī)格40目，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間12 d。發(fā)酵后基質(zhì)中的生物堿含量0.508%、多糖含量4.870%，靈芝酸含量0.720%，可溶性膳食纖維含量3.450%，不溶性膳食纖維含量9.020%，是一種功能食品的良好原料。

關(guān)鍵詞：靈芝；發(fā)酵工藝；荷葉；活性成分；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S567.3+1；TS205.5" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）08-0085-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.08.013 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of Ganoderma lucidum fermentation process with lotus leaf substrate and determination of active components

YANG Cong-fa，TANG Ben，QIN Qi，LUAN Li-ning，ZHU Yong-quan，DENG Xiang，LI Xiang

（School of Ocean Food and Biological Engineering， Jiangsu Ocean University， Lianyungangnbsp; 222005， Jiangsu， China）

Abstract：Ganoderma lucidum fermentation process with lotus leaf as the main substrate was studied and the content of active components before and after fermentation was determined. Biomass was selected as the detection index， and the effects of water material ratio， carbon source（glucose）， nitrogen source（soybean protein） and lotus leaf specification on Ganoderma lucidum fermentation were studied by single factor test and orthogonal test. The results showed that the optimal culture conditions of lotus leaf fermented by Ganoderma lucidum were as follows： water material ratio of 3.0∶1， carbon source（glucose） 10%， nitrogen source（soybean protein） 4%， magnesium sulfate heptahydrate 0.1 g， potassium dihydrogen phosphate 0.15 g， lotus leaf specification 40 mesh particle size， fermentation temperature 28 ℃， and fermentation time 12 d. After fermentation， the contents of active components in the substrate were alkaloid 0.508%， polysaccharide 4.870%， ganoderma acid 0.720%， soluble dietary fiber 3.450% and insoluble dietary fiber 9.020%， which was a good raw material for a functional food.

Key words： Ganoderma lucidum； fermentation process； lotus leaf； active components； orthogonal test

荷葉是蓮科蓮屬多年生草本挺水植物蓮荷（Lotus）的葉，被列入第二批“既是食品又是藥品”的名單之中［1］，在食用及藥用兩方面均有較廣泛的應(yīng)用［2，3］。荷葉含有植物所共有的纖維素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、單寧等常規(guī)化學(xué)成分［4］，除此之外還含有皂類、β-胡蘿卜素、黃酮［5］、維生素C、生物堿［6］等多種活性成分，具有明顯的生物活性和生理功能，不僅有活血化瘀［7］、降脂［8］、減肥［9］、降血壓和防止動(dòng)脈粥樣硬化［10］等藥用及食用價(jià)值，而且具有抗有絲分裂的作用，有較強(qiáng)的抑菌［11］效果。中國(guó)擁有豐富的荷葉資源，各省普遍栽培，干荷葉年產(chǎn)量約10 000 t，到目前為止，對(duì)荷葉的加工利用較為有限，每年僅有100 t左右的干荷葉被應(yīng)用于食品及藥品的生產(chǎn)，荷葉的開(kāi)發(fā)利用發(fā)展前景十分廣闊。

靈芝為多孔菌科真菌赤芝（Ganoderma lucidum Karst.）或紫芝（Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang）的干燥子實(shí)體［12］，有著悠久的藥食兩用傳統(tǒng)，已被納入藥食兩用名單。靈芝含有靈芝酸［13］、靈芝多糖［14］、甾醇類、多肽、生物堿［15］等多種活性成分，具有抗腫瘤［16］、抗癲癇［17］、抗氧化［18］、降血脂、降血糖、護(hù)肝［19］、增強(qiáng)免疫力等作用，能夠用來(lái)治療心腦血管［20］、神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)疾病，在保健食品、藥品及化妝品等方面有著廣泛的應(yīng)用［21］。為此，試驗(yàn)采用固態(tài)發(fā)酵的方式，利用靈芝固態(tài)發(fā)酵荷葉培養(yǎng)基，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，優(yōu)化靈芝固態(tài)發(fā)酵荷葉的工藝條件。靈芝在發(fā)酵過(guò)程中降解荷葉基質(zhì)中的纖維素，使荷葉中的活性成分游離，更易于人體消化吸收，同時(shí)將荷葉中難以被人體利用的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成具有藥用價(jià)值的活性物質(zhì)，提高荷葉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，以期能開(kāi)發(fā)一種功能性食品原料，實(shí)現(xiàn)對(duì)荷葉的高效利用，解決荷葉的資源浪費(fèi)問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)基

1.1.1 原料 干制荷葉片購(gòu)自山東同德堂醫(yī)藥連鎖有限公司，產(chǎn)地山東菏澤；靈芝菌種為赤芝，購(gòu)自江南大學(xué)傳統(tǒng)釀造食品研究中心。

1.1.2 試劑 石油醚（沸程30～60 ℃）（天津福晨化學(xué)試劑廠），氯仿（南京化學(xué)試劑廠），氫氧化鈉（無(wú)錫市晶科化工有限公司），荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（北京沃凱生物科技有限公司），麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品（北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司），濃硫酸、鹽酸（萊陽(yáng)市康德化工有限公司），高氯酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），以上試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，去離子水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

荷葉基質(zhì)培養(yǎng)基：過(guò)60目篩荷葉粉10 g，大豆蛋白2%（荷葉粉計(jì)），葡萄糖4%（荷葉粉計(jì)），七水合硫酸鎂0.10 g，磷酸二氫鉀0.15 g，初始水料比4∶1（水∶荷葉粉，體積質(zhì)量比，mL∶g），121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9162恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、SPX-50智能生化培養(yǎng)箱（杭州匯爾儀器有限公司）、HZQ-160振蕩培養(yǎng)箱（常州國(guó)華電器有限公司）、FW80-1高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）、YXQ LS全自動(dòng)高壓滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）、T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海易研實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、LD5-2A低速冷凍離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理和菌種制備 荷葉預(yù)處理：粉碎機(jī)粉碎，不同目數(shù)過(guò)篩備用。菌種活化：將靈芝菌種接種于PDA培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.3.2 固態(tài)培養(yǎng) 挑取長(zhǎng)勢(shì)良好、直徑6 mm的圓形菌塊接種于荷葉基質(zhì)培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.4 單因素試驗(yàn)

在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以麥角固醇含量為指標(biāo)，針對(duì)水料比（水∶荷葉粉，體積質(zhì)量比，mL∶g）（1.5∶1、3.0∶1、4.5∶1、6.0∶1）、氮源（大豆蛋白）（2%、4%、6%、8%）、碳源（葡萄糖）（4%、6%、8%、10%）及荷葉規(guī)格（20、40、60、80目）分別進(jìn)行考察，研究不同水平對(duì)靈芝生長(zhǎng)的影響。

1.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

1.6 生物量的測(cè)定

在真菌的固體發(fā)酵中真菌與固態(tài)基質(zhì)結(jié)合緊密，難以徹底分離，直接測(cè)定菌體的生物量難以實(shí)現(xiàn)。麥角固醇作為真菌細(xì)胞膜的重要組分，能夠反映真菌的生物量情況［22］，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵后基質(zhì)中麥角固醇的含量間接測(cè)量靈芝菌的生物量，此外，荷葉中不存在麥角固醇，不會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。

1.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別稱取麥角固醇0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg，溶于石油醚中，定容至10 mL，紫外分光光度計(jì)設(shè)定波長(zhǎng)為282 nm，測(cè)定吸光度，以麥角固醇濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=2.484 x+0.022 3，r=0.999 2。

1.6.2 樣品中麥角固醇含量的測(cè)定 采用醇?jí)A回流法測(cè)定麥角固醇含量［23］，稱取約1 g粉碎后的樣品倒入圓底燒瓶，加20% NaOH溶液20 mL，無(wú)水乙醇20 mL，85 ℃熱水浴回流提取2.5 h，圓底燒瓶冷卻后將回流提取物移入分液漏斗，用移液管精確加入25 mL石油醚，塞上漏斗塞，將漏斗連同鐵架臺(tái)放在水平搖床上搖晃15 min（選取合適轉(zhuǎn)速，注意排氣，防止塞子頂出），靜置過(guò)夜。取上層石油醚萃取液，定容至25 mL，移入棕色玻璃瓶中密封、避光保存，于282 nm處測(cè)定吸光質(zhì)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中麥角固醇濃度，代入公式計(jì)算樣品中麥角固醇含量。

[X=25 c／1 000 m×100%] （1）

式中，X為麥角固醇含量（%）；25為萃取相石油醚體積（mL）；c為樣品中麥角固醇濃度（mg/mL）；" " 1 000為單位換算；m為稱取的樣品質(zhì)量（g）。

1.6.3 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取潔凈錐形瓶，按“1.1.3”荷葉基質(zhì)培養(yǎng)基配制滅菌，接種后，自48 h開(kāi)始每間隔24 h取一瓶培養(yǎng)基滅菌，烘干粉碎后測(cè)定麥角固醇含量，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 活性成分測(cè)定

針對(duì)發(fā)酵前后荷葉基質(zhì)活性成分及含量的變化進(jìn)行研究，測(cè)定生物堿、多糖、靈芝酸、膳食纖維的含量。生物堿采用索氏提取法提?。?4］，多糖采用水浴回流法提?。?5］，靈芝酸采用乙醇回流法提?。?6］，膳食纖維的測(cè)定參照GB 5009.88—2014［27］進(jìn)行。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及分析采用SPSS 26軟件進(jìn)行，作圖采用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝生長(zhǎng)曲線

根據(jù)麥角固醇含量繪制靈芝生長(zhǎng)曲線，從圖1可以看出，靈芝菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)至12 d后基本穩(wěn)定，故選擇12 d為優(yōu)化的發(fā)酵時(shí)間。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 水料比單因素試驗(yàn) 從圖2可以看出，水料比對(duì)麥角固醇含量影響明顯，整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，水料比3.0∶1時(shí)麥角固醇含量最高，繼續(xù)添加去離子水，麥角固醇含量隨之下降，水料比6.0∶1時(shí)，觀察到有培養(yǎng)基不能完全凝固，培養(yǎng)后期仍有部分液體存在，對(duì)靈芝菌的發(fā)酵產(chǎn)生了影響。

2.2.2 氮源添加量單因素試驗(yàn) 從圖3可以看出，大豆蛋白的添加量對(duì)麥角固醇含量的影響表現(xiàn)為先上升后下降，氮源添加量為6%時(shí)，麥角固醇含量最高，繼續(xù)添加大豆蛋白，麥角固醇含量明顯下降，氮源添加量應(yīng)控制為6%。

2.2.3 碳源添加量單因素試驗(yàn) 從圖4可以看出，碳源（葡萄糖）的最佳添加量為8%。碳源添加量低于8%時(shí)，麥角固醇含量與碳源的添加量呈正相關(guān)，當(dāng)碳源的添加量高于8%時(shí)，麥角固醇的含量呈下降趨勢(shì)。結(jié)合實(shí)際觀察的菌絲生長(zhǎng)情況，推測(cè)靈芝菌在碳源添加量為10%時(shí)，生長(zhǎng)速度加快，提早進(jìn)入衰亡期，故麥角固醇含量下降。

2.2.4 荷葉規(guī)格單因素試驗(yàn)結(jié)果 從圖5可以看出，當(dāng)荷葉規(guī)格為20目時(shí)，麥角固醇含量最低，荷葉規(guī)格為40、60、80目時(shí)，麥角固醇含量測(cè)定結(jié)果較好，其中以荷葉規(guī)格40目時(shí)含量最高。結(jié)合實(shí)際觀察到的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)荷葉以80目添加至培養(yǎng)基時(shí)，靈芝菌絲僅在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，菌絲未蔓延至培養(yǎng)基內(nèi)部，推測(cè)培養(yǎng)基結(jié)合過(guò)于緊密，透氣性差，阻礙了靈芝菌的生長(zhǎng)。因此，荷葉規(guī)格控制在40目為宜。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2可以看出，對(duì)樣品中麥角固醇含量影響最大的因素為水料比，其余依次為荷葉規(guī)格、碳源添加量、氮源添加量。從極差分析推斷得出最優(yōu)方案為A2B1C3D2，即水料比3.0∶1，氮源（大豆蛋白）添加量4%，碳源（葡萄糖）添加量10%，荷葉規(guī)格40目。

通過(guò)方差分析（表3）可知，水料比、碳源添加量、荷葉規(guī)格對(duì)樣品中麥角固醇含量有顯著影響，氮源添加量對(duì)樣品中麥角固醇含量的影響不顯著。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

正交試驗(yàn)的最佳發(fā)酵條件與極差分析所得的發(fā)酵工藝條件不一致，故根據(jù)正交試驗(yàn)極差分析得出的荷葉基質(zhì)培養(yǎng)基的工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得樣品中麥角固醇的含量測(cè)定結(jié)果平均值為0.741%，優(yōu)于正交試驗(yàn)中最優(yōu)結(jié)果0.730%，故最優(yōu)方案為A2B1C3D2，即水料比3.0∶1，氮源（大豆蛋白）添加量4%，碳源（葡萄糖）添加量10%，荷葉規(guī)格40目。

2.5 活性成分測(cè)定結(jié)果

由表4可知，發(fā)酵后基質(zhì)中生物堿的含量略微上升，為0.508%，推測(cè)發(fā)酵過(guò)程中靈芝菌產(chǎn)酶分解了荷葉細(xì)胞壁，增加了生物堿的溶出，以及發(fā)酵過(guò)程中合成了微量的靈芝生物堿；發(fā)酵后多糖的含量大幅上升，達(dá)到4.87%；靈芝酸含量為0.72%；可溶性膳食纖維含量上升至3.45%，不溶性膳食纖維含量下降至9.02%，二者的比值由 1∶4.25 變?yōu)?1∶2.61。發(fā)酵后活性成分含量的上升提高了荷葉基質(zhì)的功能性，膳食纖維含量的變化更貼合均衡飲食的需求。

3 小結(jié)

試驗(yàn)采用固態(tài)發(fā)酵的方式，以荷葉為主要基質(zhì)發(fā)酵靈芝菌，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，最終得到荷葉培養(yǎng)基的最佳配比為水料比3.0∶1，氮源（大豆蛋白）添加量4%，碳源（葡萄糖）添加量10%，荷葉規(guī)格40 目，七水合硫酸鎂0.1 g，磷酸二氫鉀0.15 g，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時(shí)間12 d。發(fā)酵前后活性成分對(duì)比表明，生物堿、多糖、靈芝酸、可溶性膳食纖維含量均有上升，不溶性膳食纖維含量下降。相較于未發(fā)酵的荷葉，靈芝發(fā)酵的荷葉基質(zhì)活性成分含量更高，更具有利用價(jià)值。試驗(yàn)為拓展荷葉和靈芝的資源利用領(lǐng)域，豐富食品藥品加工工藝提供了參考。

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收稿日期：2022-02-21

基金項(xiàng)目：江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院開(kāi)放課題（HKK201617）；江蘇省研究生科研與實(shí)踐創(chuàng)新計(jì)劃（SJCX20_1315）

作者簡(jiǎn)介：楊從發(fā)（1965-），男，江蘇鹽城人，副教授，博士，主要從事食品加工與安全的研究工作，（電話）13951256312（電子信箱）ycff1965@163.com。